本發(fā)明屬于微生物菌劑技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法。
(二)
背景技術(shù)：
重金屬在土壤中大量堆積導(dǎo)致土壤性質(zhì)發(fā)生變化，直接影響土壤營養(yǎng)元素的供應(yīng)和肥力特性。重金屬污染土壤的氮元素礦化明顯降低，土壤供氮能力下降；重金屬污染的土壤對磷的吸持固定作用增強，土壤磷有效性下降；重金屬污染的土壤對鉀的吸附能力下降，交換鉀含量下降，水溶態(tài)鉀含量上升，加速鉀的流失，最終影響到土壤中氮、磷、鉀的保持和供應(yīng)。
外生菌根真菌的菌絲可以在植物營養(yǎng)根表面形成一層緊密交織的菌套，它不僅有助于促進宿主植物對礦物質(zhì)形式的磷酸鹽和氮的吸收，更重要的是，菌根真菌可以“鈍化”土壤中的重金屬，減少植物對重金屬的吸收。目前，對于重金屬污染或高鉻、高鉛土壤，尚未有有效改善土壤中重金屬污染的肥料或菌劑，導(dǎo)致生長于上述土壤中的宿主植物根系被重金屬侵染，影響植物生長和土壤品質(zhì)的提升。
(三)
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種制備科學、成本低廉、改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法，該制備方法制得的菌劑施用于高鉻、高鉛土壤中，肥效顯著，能有效避免上述土壤中植物根系的重金屬侵染，降解重金屬，提高土壤品質(zhì)，促進植物生長，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法，包括如下操作步驟：
(1)分別挑取褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌及紅絨蓋牛肝菌的斜面菌種的邊緣菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃條件下暗培養(yǎng)48h，得活化菌種；
(2)取步驟(1)經(jīng)活化培養(yǎng)的各菌種的菌絲體培養(yǎng)基，分別切成菌絲體小塊，備用；
(3)在無菌條件下，將步驟(2)得到的褐環(huán)乳牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基中，26-30℃條件下?lián)u床振蕩暗培養(yǎng)5-6d，得褐環(huán)乳牛肝菌種子液；
在無菌條件下，將步驟(2)得到的紅絨蓋牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基中，28-32℃條件下?lián)u床振蕩暗培養(yǎng)5-6d，得紅絨蓋牛肝菌種子液；
在無菌條件下，將步驟(2)得到的美味牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到美味牛肝菌液體培養(yǎng)基中，24-28℃條件下?lián)u床振蕩暗培養(yǎng)5-6d，得美味牛肝菌種子液；
(4)按(4-6)：(1-3)：(2-4)：(0.5-1)：(1-3)的重量比，將菌劑承載物：玉米芯、麩皮、棉籽殼、殼聚糖、木屑依次投入到混合攪拌機中，充分混合，混勻后經(jīng)粉碎機粉碎過篩，得0.5-1mm粉末，再經(jīng)120℃高溫滅菌30min，得混合菌劑承載物，備用；
(5)按與無菌水重量比為(10-12):25的比例，將步驟(4)滅菌的混合菌劑承載物和無菌水加入到發(fā)酵罐中，得混合培養(yǎng)基；
(6)按照占發(fā)酵培養(yǎng)基重量5％的接種量，分別將三種菌的種子液接種到步驟(5)的混合培養(yǎng)基中，在26-30℃條件下攪拌暗培養(yǎng)6-8天，得發(fā)酵菌液；
(7)將步驟(6)的發(fā)酵菌液過濾，得含有菌絲體的濾餅，經(jīng)干燥降低水分至不高于15％，粉碎濾餅至60目-100目，分裝即得。
步驟(3)的褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L、麥芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氫鉀0.25g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.19g/L、檸檬酸0.1g/L、氯化鐵0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：步驟(3)的紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；步驟(3)的美味牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、麩皮100g/L、磷酸二氫鉀5g/L、硫酸鎂3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
步驟(3)搖床振蕩頻率為120r/min-180r/min。
用法用量：該改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法制得的菌劑針對樹齡大小施用，按300g-500g/棵穴施或者溝施，盡量靠近樹根施用。
本發(fā)明改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法的有益效果為：
1、本發(fā)明制備方法使用的褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌和紅絨蓋牛肝菌取自于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學經(jīng)篩選保存的菌種，通過本發(fā)明方法的培養(yǎng)，這三種菌可發(fā)揮對土壤中重金屬的“過濾”作用，避免重金屬對植物組織造成傷害，其菌絲對重金屬有較強的吸持能力，使重金屬積聚于真菌中，當土壤中重金屬達到毒害水平時，真菌細胞壁分泌的粘液和真菌組織中的聚磷酸、有機酸等能結(jié)合過量的重金屬元素，減少重金屬向地上部的轉(zhuǎn)移、達到解毒作用，對降低植物根系侵染和降解重金屬表現(xiàn)突出。
2、本發(fā)明制備方法所用的菌劑承載物為玉米芯、麩皮、木屑、殼聚糖和稻殼粉等，取材便宜，能使菌體迅速繁殖，菌絲的含量高，對植物的效用高。
3、本發(fā)明制備方法采用對菌根真菌進行液體深層發(fā)酵，菌絲的形成速度快，大大節(jié)省了發(fā)酵時間和成本，最終制得的菌劑效用高，提升了土壤品質(zhì)。
(四)具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于此。
實施例1：
該改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法，采用如下操作步驟：
(1)分別挑取褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌及紅絨蓋牛肝菌的斜面菌種的邊緣菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃條件下暗培養(yǎng)48h，得活化菌種；
(2)取步驟(1)經(jīng)活化培養(yǎng)的各菌種的菌絲體培養(yǎng)基，分別切成1cm菌絲體小塊，備用；
(3)在無菌條件下，將步驟(2)得到的褐環(huán)乳牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基中，28℃條件下?lián)u床120r/min振蕩暗培養(yǎng)5d，得褐環(huán)乳牛肝菌種子液；
在無菌條件下，將步驟(2)得到的紅絨蓋牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基中，30℃條件下?lián)u床120r/min振蕩暗培養(yǎng)5d，得紅絨蓋牛肝菌種子液；
在無菌條件下，將步驟(2)得到的美味牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到美味牛肝菌液體培養(yǎng)基中，26℃條件下?lián)u床180r/min振蕩暗培養(yǎng)5d，得美味牛肝菌種子液；
(4)將菌劑承載物：玉米芯200g、麩皮80g、棉籽殼120g、殼聚糖40g、木屑80g依次投入到混合攪拌機中，充分混合，混勻后經(jīng)粉碎機粉碎過篩，得0.5mm粉末，再經(jīng)120℃高溫滅菌30min，得混合菌劑承載物，備用；
(5)將步驟(4)滅菌的混合菌劑承載物和1000g無菌水加入到發(fā)酵罐中，得混合培養(yǎng)基；
(6)按照均占混合培養(yǎng)基重量5％的接種量，分別將三種菌的種子液接種到步驟(5)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃條件下攪拌暗培養(yǎng)7天，得發(fā)酵菌液；
(7)將步驟(6)的發(fā)酵菌液過濾，得含有菌絲體的濾餅，經(jīng)干燥降低水分至14％，粉碎濾餅至80目，分裝即得。
步驟(1)的PDA固體培養(yǎng)基為：馬鈴薯汁1000mL、葡萄糖20g、瓊脂18-20g。
步驟(3)的褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、麥芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氫鉀0.25g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.19g/L、檸檬酸0.1g/L、氯化鐵0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：
步驟(3)的紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；
步驟(3)的美味牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、麩皮100g/L、磷酸二氫鉀5g/L、硫酸鎂3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
以上褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌和紅絨蓋牛肝菌均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學經(jīng)篩選保存的菌種。
用法用量：該制備方法制得的真菌菌劑針對樹齡大小施用，按300g-500g/棵穴施或者溝施，盡量靠近樹根施用。
本發(fā)明制備的菌劑按照3g菌劑/kg土樣的用量在煙臺地區(qū)選擇高鉻、高鉛的土壤進行實驗，以柳樹苗為實驗對象，實驗效果如下表所示：
表1對高鉻土壤作用的影響
表2對高鉛土壤作用的影響
實施例2：
該改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法，采用如下操作步驟：
(1)分別挑取褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌及紅絨蓋牛肝菌的斜面菌種的邊緣菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃條件下暗培養(yǎng)48h，得活化菌種；
(2)取步驟(1)經(jīng)活化培養(yǎng)的各菌種的菌絲體培養(yǎng)基，分別切成2cm菌絲體小塊，備用；
(3)在無菌條件下,將步驟(2)得到的褐環(huán)乳牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基中，26℃條件下?lián)u床120r/min振蕩暗培養(yǎng)6d，得褐環(huán)乳牛肝菌種子液；
在無菌條件下，將步驟(2)得到的紅絨蓋牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基中，28℃條件下?lián)u床120r/min振蕩暗培養(yǎng)6d，得紅絨蓋牛肝菌種子液；
在無菌條件下，將步驟(2)得到的美味牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到美味牛肝菌液體培養(yǎng)基中，24℃條件下?lián)u床160r/min振蕩暗培養(yǎng)6d，得美味牛肝菌種子液；
(4)將菌劑承載物：玉米芯200g、麩皮50g、棉籽殼100g、殼聚糖25g、木屑50g依次投入到混合攪拌機中，充分混合，混勻后經(jīng)粉碎機粉碎過篩，得1mm粉末，再經(jīng)120℃高溫滅菌30min，得混合菌劑承載物，備用；
(5)按與無菌水重量比為12:25的比例，將步驟(4)滅菌的混合菌劑承載物和無菌水加入到發(fā)酵罐中，得混合培養(yǎng)基；
(6)按照均占混合培養(yǎng)基重量5％的接種量，分別將三種菌的種子液接種到步驟(5)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在26℃條件下攪拌暗培養(yǎng)6天，得發(fā)酵菌液；
(7)將步驟(6)的發(fā)酵菌液過濾，得含有菌絲體的濾餅，經(jīng)干燥降低水分至8％，粉碎濾餅至60目，分裝即得。
步驟(1)的PDA固體培養(yǎng)基為：馬鈴薯汁1000mL、葡萄糖20g、瓊脂18-20g。
步驟(3)的褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、麥芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氫鉀0.25g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.19g/L、檸檬酸0.1g/L、氯化鐵0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：
步驟(3)的紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；
步驟(3)的美味牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、麩皮100g/L、磷酸二氫鉀5g/L、硫酸鎂3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
以上褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌和紅絨蓋牛肝菌均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學經(jīng)篩選保存的菌種。
用法用量同實施例1。
本發(fā)明制備的菌劑按照4g菌劑/kg土樣的用量在煙臺地區(qū)選擇高鉻、高鉛的土壤進行實驗，以柳樹苗為實驗對象，實驗效果如下表所示：
表3對高鉻土壤作用的影響
表4對高鉛土壤作用的影響
實施例3：
該改善土壤重金屬污染的真菌菌劑的制備方法，采用如下操作步驟：
(1)分別挑取褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌及紅絨蓋牛肝菌的斜面菌種的邊緣菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃條件下暗培養(yǎng)48h，得活化菌種；
(2)取步驟(1)經(jīng)活化培養(yǎng)的各菌種的菌絲體培養(yǎng)基，分別切成1cm菌絲體小塊，備用；
(3)在無菌條件下,將步驟(2)得到的褐環(huán)乳牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基中，30℃條件下?lián)u床120r/min振蕩暗培養(yǎng)5d，得褐環(huán)乳牛肝菌種子液；
在無菌條件下,將步驟(2)得到的紅絨蓋牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基中，32℃條件下?lián)u床120r/min振蕩暗培養(yǎng)5d，得紅絨蓋牛肝菌種子液；
在無菌條件下,將步驟(2)得到的美味牛肝菌菌絲體小塊轉(zhuǎn)接到美味牛肝菌液體培養(yǎng)基中，28℃條件下?lián)u床180r/min振蕩暗培養(yǎng)5d，得美味牛肝菌種子液；
(4)將菌劑承載物：玉米芯300g、麩皮150g、棉籽殼75g、殼聚糖50g、木屑150g依次投入到混合攪拌機中，充分混合，混勻后經(jīng)粉碎機粉碎過篩，得0.8mm粉末，再經(jīng)120℃高溫滅菌30min，得混合菌劑承載物，備用；
(5)按與無菌水重量比為10:25的比例，將步驟(4)滅菌的混合菌劑承載物和無菌水加入到發(fā)酵罐中，得混合培養(yǎng)基；
(6)按照均占發(fā)酵培養(yǎng)基重量5％的接種量，分別將三種菌的種子液接種到步驟(5)的混合培養(yǎng)基中，在30℃條件下攪拌暗培養(yǎng)8天，得發(fā)酵菌液；
(7)將步驟(6)的發(fā)酵菌液過濾，得含有菌絲體的濾餅，經(jīng)干燥降低水分至10％，粉碎濾餅至100目，分裝即得。
步驟(1)的PDA固體培養(yǎng)基為：馬鈴薯汁1000mL、葡萄糖20g、瓊脂18-20g。
步驟(3)的褐環(huán)乳牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、麥芽汁10mL/L、酵母膏6g/L、磷酸二氫鉀0.25g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.19g/L、檸檬酸0.1g/L、氯化鐵0.15g/L、VB12mg/L，自然pH值：
步驟(3)的紅絨蓋牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂1.5g/L、VB1 10mg/L，自然pH值；
步驟(3)的美味牛肝菌液體培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/L、馬鈴薯200g/L、麩皮100g/L、磷酸二氫鉀5g/L、硫酸鎂3g/L、VB115mg/L，自然pH值。
以上褐環(huán)乳牛肝菌、美味牛肝菌和紅絨蓋牛肝菌均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學經(jīng)篩選保存的菌種。
用法用量同實施例1。
本發(fā)明制備的菌劑按照5g菌劑/kg土樣的用量在煙臺地區(qū)選擇高鉻、高鉛的土壤進行實驗，以柳樹苗為實驗對象，實驗效果如下表所示：
表5對高鉻土壤作用的影響
表6對高鉛土壤作用的影響