本發(fā)明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種水稻鋅指蛋白基因及其應用。

背景技術：

水稻(Oryza sativa)是中國最重要的禾谷類作物之一，是世界上重要的糧食作物，全世界超過半數的人口以稻米為主食。然而，病蟲害、低溫、干旱等生物脅迫與非生物脅迫日益嚴重地威脅到水稻的產量與品質。因此，深入開展水稻抗逆相關基因的功能和進化研究，對水稻安全生產意義重大。植物在生長發(fā)育過程中經受著各種生物和/或非生物逆境脅迫(干旱、鹽堿、高溫、低溫及各種病蟲害等)的影響，但通常情況下，植物都能夠正常生長。這主要是因為植物在漫長的進化過程中形成了一整套自身防御體系，能夠通過調節(jié)自身的各種生理生化活動以適應外界環(huán)境的脅迫，減少或消除逆境對植物本身造成的傷害。

鋅指蛋白（Zinc finger protein）是一類通過結合鋅離子折疊成手指狀結構域的蛋白。這個手指狀結構域稱鋅指結構域，單個或成簇出現，主要由半胱氨酸（Csy簡寫C）和/或組氨酸（His 簡寫H）組成，通過鋅離子形成“指”狀四面體結構。鋅指蛋白最初于1983 年在非洲爪蟾的卵母細胞的轉錄因子TFⅢA 中被發(fā)現，現已在大部分的真核生物體內被大量地鑒定，它是所有DNA結合蛋白中最龐大的一個家族。鋅指可以通過與靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特異性結合，以及與自身或其他鋅指蛋白的結合，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達、細胞分化以及胚胎發(fā)育等等。

目前報道的水稻鋅指蛋白基因功能主要是與非生物脅迫相關，約占62.79%；其次是與生長發(fā)育相關，約占34.89%；再次是與生物脅迫相關，約占9.31%。有些鋅指蛋白還可以在水稻不同的組織、不同的發(fā)育階段具有多種功能，特別是可以增強水稻一種或多種抗逆功能已被鑒定和應用。但目前報道的大部分水稻鋅指蛋白基因都停留在基因的克隆與表達分析階段，這些基因在誘導因子和組織表達方面不盡相同，基因受誘導的時間和表達水平也存在著差異。

在水稻中， 最早的報道是2001 年Li 等人所在的課題組報道了第1個水稻鋅指蛋白， 含3 個C2C2型的鋅指結構，將其編碼基因命名為OsZFP1。2002 年，張紅生課題組克隆到了第2 個水稻鋅指蛋白基因， 命名為OsZFP，其編碼的蛋白含2 個典型的C₂H₂型鋅指結構，且鋅指結構的α 螺旋區(qū)有QALGGH 保守序列。隨著水稻基因組測序計劃的完成， 對水稻鋅指蛋白及其基因的報道越來越多，截至2012 年10 月，國內外報道的具有基因表達或功能特點的基因已超過40 個，主要是與環(huán)境脅迫相關，也有與生長發(fā)育或生物脅迫相關。有些鋅指蛋白還可以在水稻不同的組織、不同的發(fā)育階段具有多種功能， 特別是可以增強水稻一種或多種抗逆功能已被鑒定和應用。

目前對水稻DNL鋅指蛋白基因（Oryza sativa DNL Zinc-finger Protein， 縮寫為OsDZP）及其同源鋅指蛋白亞家族基因的功能尚未見報道，對OsDZP 在水稻抗逆應答中的作用的研究，可以開拓新的水稻不育基因資源，為作物雜種優(yōu)勢利用和新品種分子設計提供理論基礎。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種水稻鋅指蛋白基因及其應用，本發(fā)明中涉及的水稻DNL鋅指蛋白與水稻逆境脅迫相關，提高水稻的抗逆能力，通過常規(guī)育種和分子育種將其應用于水稻生產中，有望提高水稻的抗逆性，保證水稻 產量和品質。同時也為水稻等單子葉禾本科作物的生殖發(fā)育調控和遺傳育種提供了一種新的基因資源。所用基因為水稻本身自有基因，所以轉基因水稻的安全性能高。

為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明涉及一種水稻抗逆相關DNL鋅指蛋白基因（Oryza sativa DNL Zinc-finger Protein，縮寫為OsDZP），其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO ：1 所示。上述水稻抗逆相關DNL鋅指蛋白基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO ：2 所示。

本發(fā)明涉及上述水稻抗逆相關DNL鋅指蛋白基因在水稻育性遺傳育種中的應用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：發(fā)明中涉及的水稻DNL鋅指蛋白與水稻逆境脅迫相關，提高水稻的抗逆能力，通過常規(guī)育種和分子育種將其應用于水稻生產中，有望提高水稻的抗逆性，保證水稻產量和品質。同時也為水稻等單子葉禾本科作物的生殖發(fā)育調控和遺傳育種提供了一種新的基因資源。所用基因為水稻本身自有基因，所以轉基因水稻的安全性能高。

附圖說明

圖1云引經稻瘟病誘導后OsDZP基因的表達特征。

圖2麗江新團黑谷經稻瘟病誘導后OsDZP基因的表達特征。

圖3云引、麗江新團黑谷經稻瘟病誘導后OsDZP基因的表達特征。

具體實施方式

實施例1：水稻全基因組測序及基因篩選

以廣譜稻瘟病抗性品種云引（YY）為供體親本，以普感稻瘟病品種麗江新團黑谷（LTH）為受體親本雜交，之后以LTH為輪回親本回交4代，再自交直至穩(wěn)定，獲得了‘云引’稻瘟病抗性的近等基因系材料。分別提取云引、麗江基因組DNA及近等基因系抗病株系與近等基因系感病株系的基因池，委托百邁克生物科技有限公司將其進行全基因組測序。

測序共獲得64Gbp數據量，過濾后得到的Clean Reads為54Gbp，Q30達到85%，平均每個個體測序深度36X。樣品與參考基因組平均比對效率為95.19%，平均覆蓋深度為27X，基因組覆蓋度為97.13%（至少一個堿基覆蓋）。將進行不同樣品間SNP、Indel、SV檢測，并最終通過相應樣品的關聯(lián)分析，得到定位更精確的性狀連鎖區(qū)。根據Reads與參考基因組的比較的結果，在不同組的基因組上獲得了包含精細定位區(qū)域在內的大量SNP和插入缺失等基因變異。經過篩選獲得若干抗逆相關候選基因，Os02g57430 基因是其中一個候選基因。

實施例2：水稻OsDZP 基因的克隆及序列分析

根據Os02g57430 參考基因序列設計引物，并以云引、麗江、近等基因系抗性株系、近等基因系感病株系DNA為模板，克隆獲得相應的DNA序列。

1、試劑

高保真DNA 聚合酶PrimeStar 購于TaKaRa 公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成，其余試劑均為進口分裝或國產分析純產品。

2、大腸桿菌菌株和植物材料

大腸桿菌(Escherichia coli) 菌株DH5α 購于北京全式金生物技術有限公司；廣譜抗稻瘟病水稻品種云引由云南省農業(yè)科學院提供。

3、培養(yǎng)基和溶液

LB 培養(yǎng)基: 胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH 調pH 至7.0，高壓滅菌。

按以下程序進行擴增：95℃ 3min( 預變性) ；95℃ 30s( 變性)，55℃ 30s( 復性)，72℃ 120s( 延伸)，所述變性- 復性- 延伸30 個循環(huán)；72℃ 5min( 總延伸)。

引物序列如下：

DZPF:5’- ATGGCCACTCGGTTTCTGC -3’；

DZPR:5’- CTATTTTTTATCAGAAGGGCCCTTATCAT -3’。

通過上述操作，獲得了OsDZP 基因PCR 擴增產物并送生物技術公司測序。測序結果采用NCBI、BLAST及DNAMAN等軟件進行比較分析。測序結果通過比對，云引中Os02g57430與Nipponbare序列進行比較有99%的同源性，進一步在NCBI繼續(xù)Blast分析，結果顯示與已克隆的短花藥野生稻DNL 型鋅指蛋白（DNL-type zinc finger protein）同源性為87%。蛋白保守結構域預測結果顯示其具有鋅指蛋白DNL結構域。因此將云引中克隆獲得的Os02g57430 基因命名為OsDZP 基因。

將云引OsDZP 基因與日本晴Os02g57430 基因編碼區(qū)序列進行比對，拼接獲得云引OsDZP 基因編碼區(qū)CDS序列。

實施例3：水稻OsDZP 基因的表達模式分析

1 試驗材料

水稻材料為稻瘟病廣譜抗性品種云引（由云南省農業(yè)科學院提供），普感稻瘟病品種麗江新團黑谷（LTH），稻瘟病菌株為四川43，分生孢子接種濃度為5×10⁵個mL^-1，添加0.2% Tween-20，在水稻苗期（5葉1心）噴霧接種，對照僅噴無菌水。在接種病原菌和無菌水后不同時間（0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h）取葉片作為樣品，立即在液氮中速凍，保存于-80℃冰箱。

2 總RNA的提取和檢測

總RNA的提取、檢測RNA提取步驟參照Trizol試劑盒（Invitrogen公司）操作手冊進行。紫外分光光度計檢測RNA的濃度、純度，并將RNA終濃度調為250 ng·μL^-1；電泳鑒定RNA 的完整性后置于-80℃冰箱保存，備用。

3 Real-time PCR 分析

采用SYBR PrimeScript RT-PCR kit（TAKARA）熒光定量試劑盒進行熒光定量RT-PCR分析基因的表達特征。

選擇水稻的看家基因Actin為內參基因，依據實時定量PCR引物設計原則，根據OsDZP基因的測序序列和水稻的看家基因Actin的 mRNA 序列，用Primer Premier 5.0設計目標基因和內參基因的特異性引物，用 Oligo 6.0 檢驗其特異性。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

引物序列為：

ACTIN1-F 5'-CATCTTGGCATCTCTCAGCAC-3'

ACTIN1-R 5'-AACTTTGTCCACGCTAATGAA-3'

OsDZP-F 5'- GTGACCGTAACCAGGACATAGAG -3'

OsDZP-R 5'- CCTTGCTCGCCATCTTCATAG -3'

將各個時間段的RNA用SYBR PrimeScript RT-PCR kit 進行反轉錄反應。50μl 反應體系包含5×PrimeScriptTM Buffer（for Real Time）10 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 2.5μl，Oligo dT Primer（50μM）2.5μl，Random 6 mers（100μM）2.5μl， Total RNA 400ng (根據各個樣濃度加樣) RNase Free dH₂O 補足 50μl。反應在 ABI 9700 PCR擴增儀上進行，反應條件如下：37℃ 15min，85℃ 5sec，得到的cDNA放置-20℃冰箱中備用，或者立即用于熒光定量PCR反應。

選擇水稻的看家基因Actin為內參基因，目標基因和看家基因在6個時間段內重復3次反應，并設置無模板對照。25μl 反應體系包含SYBRR Premix Ex TaqTM(2×) 12.5μl，PCR Forward Primer(10μM) 0.5μl， PCR Reverse Primer(10uM) 0.5 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.5μl，cDNA template 2.0μl，滅菌蒸餾水9μl。采用兩步法進行擴增，擴增程序如下：第1步：94℃預變性30sec，第2步：95℃、5s，60℃、34s，40個循環(huán)，擴增反應在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行。反應結束后，采用ABI 7500 system SDS software 進行數據處理。

熒光定量PCR結果顯示抗病材料云引經稻瘟病誘導后OsDZP基因表達量在0h到48h五個時間段表達量降低、回升交替變化，48h后該基因表達量明顯下降。另外稻瘟病感病材料麗江新團黑谷經稻瘟病誘導后OsDZP基因在12h表達量明顯下降，24h時上升，隨后其表達量一直處于顯著下降的趨勢。OsDZP基因在云引與麗江中表達特征差異明顯。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農業(yè)科學院水稻研究所

<120> 一種水稻鋅指蛋白基因及其應用

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 核苷酸序列

<400> 1

atgcttgtta tcgtattcgc gtgtcgccct tatggccact cggtttctgc ctctggtgcg 60

ccgcggcctc gccggcgtcc tgaatcaatc gcccgcgccc gcgtccaccc gaggtgattc 120

ccccaaactt ttttttgctt tagctccctc ttttggttcg gcatggataa atctagtcga 180

tattggtgat gactctcgcg gatgtgtgtt ttacttggag aggccggtgg ttggaggctc 240

gaatccgggg ttgctgctgc cactacagtc aaattttgtt tacactgcgt ctgcgccctt 300

ttcccttgtg tttgggggta tgagaagatt gaaatatgga aacaaggggt ttcccttgtt 360

ttgggattga ttttggtaaa attaaggtga tatggttgaa gaactgaaga aaaaacttgg 420

tggcaactat agtagtaata ataagataag attatagagt caattgtgtc tgtttgttgc 480

tagttgtcag ttcctgccag attggcaaat atctaaagca tttaccattc aaatcattac 540

gtatgacaag aatttactta catctttgca ataggaatta attaaacagt caactaatga 600

aaatctgtta ttgcaggatt cttgtttcct gcacctgtga ctgctggcat aagatctctg 660

caaactatca tggaagcaag caataatgct tcagatgacc gtaaccagga catagaggat 720

tccaaaaccg acaccgtgcc agctatggtc ccttcatcgg attccggctt caaagttaga 780

gatacatcaa acttgaagat ctcaccgaga cacgacctcg ccatgatctt tacgtgcaag 840

gtttgcgaga ccaggtctat gaagatggcg agcaaggaat catatgagaa aggagtggtg 900

gtcgctcgtt gcggcggctg caataatttc cacctgatcg ccgataggct tggctggttt 960

ggggagccag gaagcatcga agactttcta gccgaacaag gagaggaggt gaagaaaggc 1020

tcaacagata ctcttaactt cactcttgag gacttggttg ggtctcaggc taatgataag 1080

ggcccttctg ataaaaaata gaagggcgac acgcgaagtc gatgtcgc 1128

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Thr Arg Phe Leu Pro Leu Val Arg Arg Gly Leu Ala Gly Val

1 5 10 15

Leu Asn Gln Ser Pro Ala Pro Ala Ser Thr Arg Gly Phe Leu Phe Pro

20 25 30

Ala Pro Val Thr Ala Gly Ile Arg Ser Leu Gln Thr Ile Met Glu Ala

35 40 45

Ser Asn Asn Ala Ser Asp Asp Arg Asn Gln Asp Ile Glu Asp Ser Lys

50 55 60

Thr Asp Thr Val Pro Ala Met Val Pro Ser Ser Asp Ser Gly Phe Lys

65 70 75 80

Val Arg Asp Thr Ser Asn Leu Lys Ile Ser Pro Arg His Asp Leu Ala

85 90 95

Met Ile Phe Thr Cys Lys Val Cys Glu Thr Arg Ser Met Lys Met Ala

100 105 110

Ser Lys Glu Ser Tyr Glu Lys Gly Val Val Val Ala Arg Cys Gly Gly

115 120 125

Cys Asn Asn Phe His Leu Ile Ala Asp Arg Leu Gly Trp Phe Gly Glu

130 135 140

Pro Gly Ser Ile Glu Asp Phe Leu Ala Glu Gln Gly Glu Glu Val Lys

145 150 155 160

Lys Gly Ser Thr Asp Thr Leu Asn Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Gly

165 170 175

Ser Gln Ala Asn Asp Lys Gly Pro Ser Asp Lys Lys

180 185

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccactc ggtttctgc 19

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctatttttta tcagaagggc ccttatcat 29

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catcttggca tctctcagca c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aactttgtcc acgctaatga a 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgaccgtaa ccaggacata gag 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccttgctcgc catcttcata g 21