本發(fā)明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種獼猴桃內生放線菌的分離及其應用。

背景技術：

獼猴桃營養(yǎng)非富，汁多味美，被人們譽為“水果之王”，是理想的綠色食品，近年來需求日益增加。但是因為果農一味追求高產，采用不科學的栽培管理方式，如氮磷肥的重施、鉀肥的輕施，有機肥的缺施等導致獼猴桃易患潰瘍病、葉片黃化病等病害，致使獼猴桃優(yōu)果率下降、土壤肥力急速削減，嚴重影響獼猴桃產量及品質。

微生物肥料能夠有效的改良土壤肥力，提高化肥的利用率同時提高能源利用率。實踐證明，微生物肥料在綠色有機食品生產、農業(yè)生態(tài)環(huán)境保護以及高產、優(yōu)質、高效農業(yè)的持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。微生物肥料的功能核心是有益微生物，施入土壤后，能固定空氣中的氮素，活化土壤中的養(yǎng)分，改善植物的營養(yǎng)環(huán)境，微生物在生命活動過程中產生活性物質，刺激植物的生長。但是當前的微生物肥料普遍存在功能單一、菌株活性退化的問題，因此，挖掘新的功能微生物對于多功能微生物肥料的研發(fā)具有重要意義。

內生菌是一類生活在活體植物組織內、不會引起植物明顯病害的微生物，能作為外源基因的載體，具有促進植物生長、抗逆境、抗病害、增加宿主植物的他感作用以及對病蟲害的防治等作用。獼猴桃根部內生菌豐富，而患病植株會誘導自身根部的微生物群落發(fā)生響應變化，以患潰瘍病的獼猴桃植株根部為分離材料，可以提高具有潛在抗病促生的功能微生物的分離效率。以患潰瘍病的獼猴桃植株根部為分離源，進行內生放線菌的分離篩選對于挖掘新的具有抗病促生復合功能的微生物菌種資源并應用于新型復合微生物菌劑的開發(fā)具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種獼猴桃內生放線菌及其應用，通過綜合評價篩選獼猴桃內部放線菌的功能特性，旨在解決當前微生物肥料生產菌種單一、菌株優(yōu)良性狀退化、獼猴桃專用微生物菌劑環(huán)境適應性弱等問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種獼猴桃根部內生放線菌，所述獼猴桃根部內生放線菌為球孢鏈霉菌，命名為球孢鏈霉菌SCAU-1(Streptomyces globisporus SCAU-1)，已于2016年10月18日保藏至武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏編號為：CCTCC NO：M 2016577。該菌具有較廣泛的抗菌作用，同時能促進植物生長，兼具“肥藥”雙效功能，使用該菌制成的微生物肥料對于在農業(yè)種植業(yè)中減少化學肥料和農藥施用具有重要意義。

本發(fā)明的另一目的在于一種獼猴桃根部內生放線菌的分離方法，采集患潰瘍病的獼猴桃根部樣品，用0.1％Tween 20清洗30s，無菌水沖洗3次，75％乙醇浸泡5min，無菌水沖洗3次，有效氯含量2％次氯酸鈉溶液浸泡3-5min，無菌水沖洗3次；10％NaHCO₃浸泡10min，無菌水清洗3次，然后研磨成勻漿后接于TSA培養(yǎng)基平板中，在28℃導致培養(yǎng)30d，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和色澤等表觀特征挑取單菌落并進行劃線純化，通過分離獲得32株菌落形態(tài)各不相同的菌株。

進一步的，該菌株的生物學特征如下：該菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、丁香假單胞菌、玉米紋枯病菌、西瓜枯黃病菌和番茄早疫病菌具有抑制作用，IAA產量大于40mg/L，可產生纖維素酶。

本發(fā)明的另一目的在于一種利用權利要求1所述獼猴桃內生放線菌制備的發(fā)酵液。

進一步的，包括：將篩選得到的球孢鏈霉菌SCAU-1活化后接種于高氏一號培養(yǎng)液中，30℃，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)96h后，作為種子液以1:1比例加入高氏一號培養(yǎng)基，30℃，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)96h使其活菌數(shù)達到10億以上，取出備用。

本發(fā)明的另一目的在于一種利用獼猴桃內生放線菌制備的球孢鏈霉菌SCAU-1菌液體菌劑。

本發(fā)明的另一目的在于一種獼猴桃內生放線菌發(fā)酵液在獼猴桃種植中的應用。

進一步的，將按50-200比例稀釋SCAU-1菌株發(fā)酵液，在獼猴桃移栽時，將SCAU-1進行獼猴桃灌根處理，活菌含量約為2×107cfu/ml。

本發(fā)明發(fā)酵液在獼猴桃盆栽中的應用，將按50-200比例稀釋的SCAU-1菌株的發(fā)酵液采用灌根的方式進行獼猴桃苗的接菌處理。

本發(fā)明的有益技術效果是：本發(fā)明提供的獼猴桃內生放線菌及其應用，從獼猴桃中分離出特異內生放線菌，不僅可以促進植物的生長，還可以抑制植物病原真菌和細菌的生長，且具備高效纖維素降解能力，可用于抗病促生型多功能微生物肥料的制作，改善土壤理化性質，促進植物生長；連續(xù)三次盆栽實驗顯示SCAU-1發(fā)酵液經清水稀釋后，采用灌根的方式對獼猴桃表現(xiàn)出明顯的促生作用，能夠明顯提高獼猴桃苗期的根數(shù)、根長、株高、葉片數(shù)量和葉面積。本發(fā)明的球孢鏈霉菌SCAU-1，具有較廣泛的抗菌作用，同時能促進植物生長，具有“肥藥”兼效功能，使用該菌制成的發(fā)酵菌劑對于在農業(yè)種植業(yè)中減少化學肥料和農藥施用具有重要意義；菌株具有廣泛的抗菌活性，高效纖維素降解能力，同時產生IAA，對植物具有明顯的促進生長作用，表現(xiàn)出多重生物學功能。該菌制作的生物肥料能夠促進獼猴桃等植物的生長，同時促進獼猴桃品質。對于在獼猴桃栽培中開展“減肥減藥”具有潛在應用價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實施例提供的獼猴桃內生放線菌的制備方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實施例提供的獼猴桃盆栽實驗前后對比圖。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明實施例的獼猴桃內生放線菌，經形態(tài)、生理、分子鑒定為球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)，命名為球孢鏈霉菌SCAU-1(Shreptamyccs glablsporus SCAU-1)，已于2016年10月18日保藏至武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏編號為：CCTCC NO：M 2016577。

如圖1所示，本發(fā)明實施例的獼猴桃內生放線菌的制備方法包括以下步驟：

S101：獼猴桃選擇，采自四川傳統(tǒng)獼猴桃主產區(qū)-都江堰，植物體患潰瘍??；

S102：獼猴桃根部內生放線菌的分離，以患潰瘍病獼猴桃根部為分離材料，將根剪短成1cm左右，利用75％酒精以及2％次氯酸鈉表面消毒。研磨成勻漿后涂布于高氏一號培養(yǎng)基平板中，以最后一次洗滌水作對照，以檢測表面消毒是否徹底；

S103：在28℃導致培養(yǎng)30d，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和色澤等表觀特征挑取單菌落并進行劃線純化。通過分離，共獲得32株菌落形態(tài)各不相同的菌株。

下面結合具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。

(一)球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)SCAU-1菌株篩選

1、獼猴桃選擇

采自四川傳統(tǒng)獼猴桃種植基地-都江堰，獼猴桃患潰瘍??；

2、獼猴桃內生放線菌的分離

采用患潰瘍病獼猴桃根部樣品，用0.1％Tween 20清洗30s，無菌水沖洗3次，75％乙醇浸泡5min，無菌水沖洗3次，有效氯含量2％次氯酸鈉溶液浸泡3-5min，無菌水沖洗3次；10％NaHCO₃浸泡10min，無菌水清洗3次。然后研磨成勻漿后接于TSA培養(yǎng)基平板中，以最后一次洗滌水作對照，以檢測表面消毒是否徹底；在28℃導致培養(yǎng)30d，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和色澤等表觀特征挑取單菌落并進行劃線純化。通過分離，共獲得32株菌落形態(tài)各不相同的菌株。

3、內生放線菌產吲哚乙酸(IAA)測定

將步驟2中的32株內生放線菌培養(yǎng)到對數(shù)期，取菌液50μl于含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液體培養(yǎng)基中(約3ml)中，重復3次，28℃140r/min振蕩培養(yǎng)1.5天，取50μl于洗凈的白瓷板中，加100μl顯色劑，25℃下避光30min，如果出現(xiàn)粉紅色，表明產生IAA，以沒有接菌的含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液體培養(yǎng)基為對照。

將產吲哚乙酸的內生放線菌繼續(xù)在含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48h后，8000r/min離心5min，取上清液2ml加入4ml Salkowski顯色劑，25℃下避光30min后，530nm下測定吸光度值。以空白培養(yǎng)基作對照，并以IAA的標準樣品對應的光密度做標準曲線，計算IAA的產量(mg/L)。

32株菌中有19株產生IAA，產量大于40mg/L的菌株有3株，其中SCAU-1菌株IAA產量最高，為43.3mg/L。

4、產纖維素酶測定

將步驟2中的菌株點種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2d，用1mg/mL的剛果紅溶液侵染1h，再用1mol/L的NaCl溶液脫色1h，倒入1mol/L的HCl使背景呈藍色而使透明圈更加明顯，記錄透明圈直徑HD值與菌落直徑CD值并計算其比值。32株菌中有3株具纖維素酶活，SCAU-1的HD/CD值約1.45。

6、菌株抑菌能力測定

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、丁香假單胞菌、玉米紋枯病菌、西瓜枯黃病菌和番茄早疫病菌為供試病原菌，通過平板拮抗測定分離菌株對病原菌的抑制作用。記錄HD值與CD值并計算其比值。32株供試內生放線菌中有6株對上述6種病原菌均表現(xiàn)出抑制效果，其中SCAU-1對西瓜枯黃病菌和大腸桿菌的HD/CD值分別為2.4和3.2，對金黃色葡萄球菌、丁香假單胞菌、玉米紋枯病菌、和番茄早疫病菌的HD/CD值介于約1.2-2.1。

7、SCAU-1發(fā)酵液的準備

將上述步驟中篩選得到的球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)SCAU-1活化后接種于高氏一號培養(yǎng)液中，30℃，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)36h后，作為種子液以1:1比例加入高氏二號培養(yǎng)基，30℃，120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)36h使其活菌數(shù)達到10億以上，取出備用。

8、獼猴桃盆栽應用

供試獼猴桃品種為紅陽，將按一定比例稀釋的SCAU-1菌株的發(fā)酵液采用灌根的方式進行獼猴桃苗的接菌處理，以無菌水作對照，培養(yǎng)60后測定獼猴桃苗相關指標。

表1獼猴桃苗在各處理中的形態(tài)指標

從表1可以看出，不同濃度SCAU-1菌株的發(fā)酵液稀釋物對獼猴桃苗的根數(shù)、根長、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量均表現(xiàn)出促進作用，具有潛在應用價值。

本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。