本發(fā)明屬于動物病毒分子生物學技術領域，具體是一種鑒別檢測PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株與高致病性疫苗株（JXA1-R株）的多重RT-PCR檢測試劑盒，適用于臨床或科研中鑒別檢測樣品是否是PRRSV經(jīng)典株感染，或者是PRRSV高致病性變異株感染，或者是PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）感染，亦或是其中兩者或三者的共同感染。

背景技術：

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母豬發(fā)熱、流產，斷奶前、后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。

1991年，荷蘭學者Wensvoort等人在感染豬體內分離到歐洲型PRRSV，命名為Lelystad病毒(LV)；同年，美國學者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為VR-2332。目前，豬繁殖與呼吸綜合征已在世界范圍內流行，我國自1996年以來普遍存在該病。2006年6月起，我國南方一些省份的豬場暴發(fā)了一種“高熱”綜合征，發(fā)病豬的體溫高于41℃，病豬食欲不振甚至廢絕，腹部、耳尖及后軀發(fā)紅，發(fā)病率達70%～100%，死亡率達50%～100%不等。該病傳播迅速，在短短的半年內幾乎傳遍了大半個中國，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

由于PRRSV在流行過程中經(jīng)常發(fā)生演化重組，不同來源的PRRSV基因的重組產生了大量的中間毒株，包括野毒間的重組毒株、疫苗毒株和野毒株的重組毒株、以及疫苗毒株演化而來的毒株。這種變化使得病毒的致病力持續(xù)增強，疫病防控的難度也逐漸加大。

傳統(tǒng)的豬繁殖與呼吸障礙綜合征的診斷方法有多種，如檢測病原的有病毒分離、免疫組化、免疫熒光試驗等方法，檢測抗體的有ELISA、血清病毒中和試驗、間接免疫熒光試驗、免疫過氧化酶單層試驗等血清學方法，但這些診斷方法不同程度地存在諸如敏感性低、特異性差、需時長、無法區(qū)分PRRSV的不同毒株感染等的局限性。國內外已建立了針對所有PRRSV的RT-PCR方法，但此種方法只能檢測是否有PRRSV感染，無法判斷是PRRSV經(jīng)典株感染，或者是PRRSV高致病性變異株感染，亦或是兩者共同感染。此外，已有的針對PRRSV高致病性變異株的RT-PCR檢測方法，只能檢測出PRRSV高致病性變異株，無法判斷是單一的PRRSV高致病性變異株感染，還是PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株亦或是高致病性疫苗株的共同感染。因此，建立一種簡便、快速、特異性強、敏感性高的PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株與高致病性疫苗株的鑒別檢測方法意義重大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種鑒別PRRSV的多重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒只需一次擴增反應就可同時檢測出樣本中是否含有PRRSV JXA1-R、經(jīng)典株和高致病性變異株，臨床應用操作便捷，實用性強，經(jīng)濟實惠，適合于養(yǎng)殖場和專業(yè)實驗室對PRRSV病毒株的快速鑒定，同時可為PRRS的疫情監(jiān)測、流行病學調查及綜合防控提供強有力的技術支持。

本發(fā)明所采取的技術方案是：一種用于鑒別PRRSV的多重RT-PCR檢測試劑盒，包括5×M-MLV反轉錄Buffer、M-MLV反轉錄酶、dNTP Mixture、RNA酶抑制劑和反轉錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、兩對引物和DEPC水；

引物是根據(jù)GenBank公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒序列，在其NSP2基因保守序列區(qū)域及JXA1-R株與其它高致病性PRRSV毒株13380-13900 nt區(qū)域設計的兩對特異性引物。

所述試劑盒還包括陽性對照，陽性對照為將豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、高致病性毒株及高致病性疫苗株（JXA1-R株）分別接種Marc-145細胞后，收集48-72小時細胞培養(yǎng)物，測定TCID₅₀，通過β-丙內酯滅活后，三種毒株混合至最終含量均為10⁴ TCID₅₀/mL。

應用所述試劑盒檢測待檢樣品中是否含有PRRSV的方法，包括如下步驟 ：

1、病毒RNA的提取

采用Trizol法提取，分別取美洲型PRRSV國內分離株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ、PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的細胞培養(yǎng)液各400 μL，凍融2-3次，加800 μL Trizol，室溫作用5 min；加入200 μL氯仿，室溫作用10 min；4℃，12000 rpm，離心15 min；吸取上清液，加入等體積異丙醇，-20℃作用10 min；4℃，12000 rpm，離心15 min；棄上清液，加入1 mL75%乙醇，8000 rpm，離心5 min；棄乙醇，晾干，即得病毒基因組總RNA，立即反轉錄或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、反轉錄合成cDNA

cDNA 的合成體系采用20 μL體系, 其中含2μL RNA, 5×M-MLV反轉錄Buffer 4 μL, 10 mM dNTP 2 μL, M-MLV反轉錄酶1 μL (100U)，Random Primer 1 μL(30 pM/μL) Rnasin 0.5 μL, 再用DEPC水補至20 μL，42℃ 1h，95℃ 5 min滅活反轉錄酶，即得cDNA，立即進行PCR或置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、多重RT-PCR

以病毒基因組cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25 μL體系，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL（NSP2-F：5’-TGAYGGGCGACAATGTCC-3’；

NSP2-R：5’-CGCAGACAAATCCAGAVG-3’；JXA1-F：5’-ATTTGAATGTTCGCACGGTC TC

-3’；JXA1-R：5’- CCGCTGAAACTCTGGTTAAAGG-3’），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板cDNA 2.5μL，用DEPC水補至25 μL。擴增循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

4、瓊脂糖凝膠電泳及結果判定

取PCR產物7 μL于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓80-120 V，時間15-20 min，根據(jù)電泳圖像判斷檢測結果。根據(jù)電泳圖按照PRRSV普通株的目的條帶為319 bp，PRRSV高致病性毒株的目的條帶為229 bp，PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的目的條帶為229 bp 和610 bp，判定是PRRSV三種毒株的單獨感染或是混合感染。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明利用兩對引物鑒別美洲型 PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株和高致病性疫苗株（JXA1-R株）三種毒株，減少了鑒定不同PRRSV病毒株的檢測成本和檢測時間；且只需一次PCR反應即可鑒別出三種PRRSV毒株，解決了臨床樣品檢測中無法區(qū)分PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株和高致病性疫苗株（JXA1-R株）單獨感染亦或共同感染的問題。

2、本發(fā)明具有敏感性高、特異性強，可重復性好等諸多優(yōu)勢，僅對PRRSV的核酸產生特異性的擴增反應，對豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬乙型腦炎病毒、豬輪狀病毒等均無擴增反應，試劑盒的可檢測出RNA樣品的濃度為96 copies/反應。

3、簡便快速，僅需約1個小時，加上核酸的提取和瓊脂糖凝膠檢測，共需約2小時。

4、經(jīng)濟實惠，僅需一次PCR擴增即可鑒別出PRRSV的三種毒株，對于需要同時檢測PRRSV三種毒株的樣本來說，成本降低了約2/3。

5、本發(fā)明為我國PRRSV的臨床檢測提供了新手段，該試劑盒可用于種豬流通環(huán)節(jié)中PRRSV的檢驗檢疫，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的PRRSV的疫情監(jiān)控、鑒別診斷以及疫病的凈化，為提升我國PRRSV的綜合防控水平提供了技術支撐。

附圖說明

圖1：PRRSV多重RT-PCR特異性試驗結果，注：M:DL2000 Marker；1-10： PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV普通株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬輪狀病毒（RV）及陰性對照（H₂O）。

圖2： PRRSV多重RT-PCR敏感性試驗結果，注：M:DL2000 Marker；1-7:384, 192, 96, 48, 24, 12, 6 copies/反應。

圖3：PRRSV多重RT-PCR臨床檢測電泳圖，注：M:DL2000 Marker；1-4：PRRSV高致病性變異株、PRRSV高致病性疫苗株、PRRSV普通株及陰性對照（H₂O）。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例僅用于說明本發(fā)明，不會限制權利要求書所詳細描述的本發(fā)明。

本發(fā)明研究過程中用到的病毒毒株包括：豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬輪狀病毒（RV）均由湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

病毒特異性引物設計：所述的病毒特異性引物，指的是根據(jù)GenBank公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒序列，在其NSP2基因保守序列區(qū)域及JXA1-R株與其它高致病性PRRSV毒株13380-13900 nt區(qū)域設計的與其基因高度保守區(qū)的特異性片段完全相同或者反向互補。

本發(fā)明所列的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向書寫。

實施例1 PRRSV多重RT-PCR鑒別方法的特異性試驗

用復合RT-PCR方法檢測6株其它豬源病毒毒株6份，1份PRRSV經(jīng)典株CH-1a，1份PRRSV高致病性變異株07HBEZ，1份PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R，以考查該方法檢測不同樣品的特異性。

1 病毒株

PRRSV經(jīng)典株：美洲型PRRSV國內分離株CH-1a，由中國科學院武漢病毒研究所提供；PRRSV高致病性變異株：由湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定的07HBEZ (GenBank ID: FJ495082.2)；PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R：購自市售疫苗，經(jīng)Marc-145細胞培養(yǎng)增殖后用于本發(fā)明；其它豬病病毒：豬瘟病毒 (CSFV)， 豬偽狂犬病毒(PRV)，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，豬細小病毒 (PPV)，豬日本乙型腦炎病毒 (JEV) 和豬輪狀病毒(RV)。

2 病毒培養(yǎng)

將凍存的美洲型PRRSV國內分離株CH-1a和PRRSV高致病性變異株07HBEZ取出，加入適量含10％小牛血清的細胞培養(yǎng)液稀釋后，接種于生長良好的Marc145細胞單層，37℃吸附1h，加入含2％小牛血清的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)3-5d，觀察細胞病變（CPE），待出現(xiàn)典型細胞病變達70％時收毒，-70℃保存?zhèn)溆?；PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R取自市售疫苗，無菌操作經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后按前述方法培養(yǎng)。其它病毒分別接種適應細胞進行培養(yǎng)。

3 病毒RNA的提取

采用Trizol法提取，分別取美洲型PRRSV國內分離株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及其它病毒的細胞培養(yǎng)液各400μL，凍融2-3次，加800μL Trizol，室溫作用5 min；加入200μL氯仿，室溫作用10 min；4℃，12000 rpm，離心10 min；吸取上清液，加入等體積異丙醇，-20℃作用5 min；4℃，12000 rpm，離心10 min；棄上清液，加入1 mL75%乙醇，8000 rpm，離心5 min；棄乙醇，晾干，即得病毒基因組總RNA，立即反轉錄或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 陰性對照

取滅菌的DEPC水，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5 PRRSV復合RT-PCR檢測方法的操作程序

25 μL反應體系，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 2 μL，上、下游引物（NSP2-F：5’-TGAYGGGCGACAATGTCC-3’；NSP2-R：5’-CGCAGACAAATCCAGAVG-3’；JXA1-F：5’-ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC-3’；JXA1-R：5’- CCGCTGAAACTCTGGTTAAAGG-3’）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板cDNA 2.5μL，用DEPC水補至25 μL。擴增循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

6 電泳

稱取1 g瓊脂糖放入500 mL錐形瓶中，加入1×TAE電泳緩沖液100 mL，于微波爐中熔解，再加入5 μL染色液混勻。在電泳槽模內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待完全凝固后取出置于電泳槽中，將PCR擴增產物5 μL混合1 μL上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以80-120V電壓于1×TAE電泳緩沖液中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

7 結果判定

PRRSV普通株的目的條帶為319 bp，PRRSV高致病性變異株的目的條帶為229 bp，PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）的目的條帶為229 bp 和610 bp、陰性對照無條帶（引物帶除外）時，實驗結果有效。

8 結果

用PRRSV復合RT-PCR方法檢測6株其它豬源病毒毒株，結果均為陰性，PRRSV經(jīng)典株CH-1a，PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株（JXA1-R株）均擴增出目的條帶，而陰性對照DEPC水未擴增出任何目的帶（見圖1）。

實施例2 PRRSV多重RT-PCR鑒別方法的敏感性試驗

用復合RT-PCR方法檢測不同含量的PRRSV經(jīng)典株CH-1a， PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R，以考查該方法檢的敏感性。

1 病毒

PRRSV經(jīng)典株CH-1a，PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R。

2 方法

將PRRSV經(jīng)典株CH-1a、PRRSV高致病性變異株07HBEZ和PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R分別稀釋為384, 192, 96, 48, 24, 12, 6 copies/反應，提取RNA，按前述PRRSV復合RT-PCR擴增每個稀釋度樣品。

3 結果

用PRRSV復合RT-PCR擴增檢測不同稀釋度樣品的結果見圖2。結果表明該PRRSV復合RT-PCR的敏感性為96 copies/反應。

實施例3 應用PRRSV復合RT-PCR方法檢測臨床樣品

分別檢測PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及PRRSV高致病性野毒株陽性組織樣品各3份，同時重復檢測3次，并設雙蒸水作為陰性對照，以檢測該方法的穩(wěn)定性。

1 材料

PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R及PRRSV高致病性野毒株陽性組織樣品各3份。

2 方法

采用Trizol法分別提取PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV高致病性野毒株陽性組織樣品的RNA，按前述復合RT-PCR擴增每個樣品。

3 結果

PRRSV活疫苗CH-1R株、PRRSV高致病性疫苗株JXA1-R、PRRSV高致病性野毒株陽性組織樣品的cDNA均擴增出與預期大小一致的目的條帶，陰性對照無任何條帶產生（圖3），說明該鑒別診斷方法穩(wěn)定性好，可直接應用于臨床。

<<110>湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一種鑒別PRRSV的多重RT-PCR檢測試劑盒

<160>4

<210>1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaygggcga caatgtcc 18

<210> 2

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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