本發(fā)明屬于酶與生物催化領(lǐng)域，具體涉及利用羰基還原酶生物催化生產(chǎn)立體互補(bǔ)的手性N-雜環(huán)醇類化合物的方法。

背景技術(shù)：

N-雜環(huán)醇類衍生物，尤其是手性N-雜環(huán)醇類衍生物是一類在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要研究?jī)r(jià)值的化合物，作為藥物合成的重要中間體，被廣泛的應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、抗精神病、抗腫瘤、抗心血管病等藥物的合成。

目前，制備手性N-雜環(huán)醇類衍生物的方法主要有通過(guò)手性源環(huán)化合成法、化學(xué)拆分法和生物轉(zhuǎn)化法。

手性源環(huán)化合成法，如下所示：

主要以天然的手性化合物為起始原料，經(jīng)過(guò)多步的環(huán)化反應(yīng)得到手性純的3-羥基哌啶衍生物。該方法存在反應(yīng)步驟繁瑣，終產(chǎn)物的收率低，產(chǎn)物的光學(xué)純度較低、生產(chǎn)成本較高的缺點(diǎn)。

化學(xué)拆分法，如下所示：

主要是將外消旋的3-羥基哌啶在手性酸的作用下成鹽析出得到手性的鹽，然后游離上保護(hù)基得到手性的N-取代-3羥基哌啶，該方法存在拆分收率低、操作繁瑣、生產(chǎn)成本較高、原子經(jīng)濟(jì)性低的缺點(diǎn)。

生物轉(zhuǎn)化法，如下所示：

利用磨碎的野生胡蘿卜的根為生物催化劑，將不同取代的N-雜環(huán)酮類化合物還原得到(S)-N-雜環(huán)醇類化合物，該方法存在催化劑的需求量大、產(chǎn)物的光學(xué)純度不夠高的問(wèn)題，反應(yīng)效率低，生產(chǎn)成本高，很難被應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種以羰基還原酶為生物催化劑制備立體互補(bǔ)的手性N-雜環(huán)醇類化合物的方法，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。具體地，本發(fā)明所用的底物為如下結(jié)構(gòu)通式(I)，利用不同的高效高選擇性羰基還原酶為生物催化劑，經(jīng)不對(duì)稱還原獲得相應(yīng)(S)或(R)構(gòu)型手性醇。

生物催化過(guò)程可表示如下：

其中，n在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為1、2或3；

m在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為1或2；

R在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自叔丁氧羰基，芐基，芐氧羰基，或乙基氧羰基等；

進(jìn)一步說(shuō)，反應(yīng)是將N-雜環(huán)酮類化合物用(R)-羰基還原酶還原為(R)-N-雜環(huán)醇類化合物，或用(S)-羰基還原酶還原為(S)-N-雜環(huán)醇類化合物。

進(jìn)一步說(shuō)，所述的(R)-羰基還原酶為ChKRED20；(S)-羰基還原酶還原為RE-ADH；

所述的羰基還原酶是由基因工程大腸桿菌通過(guò)發(fā)酵表達(dá)得到。

進(jìn)一步說(shuō)，所述的羰基還原酶推薦以酶粉形式或含有羰基還原酶的細(xì)胞破碎液的形式加入。

根據(jù)本領(lǐng)域的公共知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)以下方式獲得生物催化劑。首先，羰基還原酶的信息(基因序列和氨基酸序列)可通過(guò)該酶的NCBI登錄號(hào)查詢獲知，然后經(jīng)基因合成公司合成獲得，并以常規(guī)技術(shù)手段構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)體系，經(jīng)過(guò)量表達(dá)獲得上述酶作為生物催化劑。

RE-ADH在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為：AY161280；ChKRED20在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為：KC342020。

本發(fā)明的生物催化體系及反應(yīng)條件：

(1)生物催化劑為羰基還原酶RE-ADH純酶或者粗酶時(shí)，生物催化體系為：

磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH6～7)、羰基還原酶、結(jié)構(gòu)通式(I)底物和還原型輔酶NADH；

或者，生物催化體系為：

磷酸鹽緩沖(0.1M，pH6～7)、羰基還原酶、結(jié)構(gòu)通式(I)底物、氧化型輔酶NAD⁺，異丙醇。

上述反應(yīng)體系中，羰基還原酶的酶量可根據(jù)底物濃度調(diào)整，較優(yōu)的濃度為純酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以總蛋白量計(jì))。

優(yōu)選的，底物終濃度為1～120g/l；NAD⁺濃度0.1～1g/l；異丙醇的濃度為5％(v/v)；NADH的摩爾濃度大于等于底物的摩爾濃度。

生物催化條件：溫度20～50℃，轉(zhuǎn)速50～220rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為1～24h。

(2)生物催化劑為羰基還原酶ChKRED20純酶或者粗酶時(shí)，生物催化體系為：

磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH6～8)、羰基還原酶、結(jié)構(gòu)通式(I)底物和還原型輔酶NADH；

或者，生物催化體系為：

磷酸鹽緩沖(0.1M，pH6～8)、羰基還原酶、結(jié)構(gòu)通式(I)底物、氧化型輔酶NAD⁺，異丙醇。

上述反應(yīng)體系中，羰基還原酶的酶量可根據(jù)底物濃度調(diào)整，較優(yōu)的濃度為純酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以總蛋白量計(jì))。

優(yōu)選的，底物終濃度為1～40g/l；NAD⁺濃度0.1～1g/l；異丙醇的濃度為20～50％(v/v)；NADH的摩爾濃度大于等于底物的摩爾濃度。

生物催化條件：溫度20～40℃，轉(zhuǎn)速50～220rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為1～24h。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明公開了以羰基還原酶生物催化方法獲得立體互補(bǔ)手性N-雜環(huán)醇類化合物，該方法的催化劑易制備，水相催化，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，無(wú)副反應(yīng)，ee值絕大多數(shù)大于99％，為手性N-雜環(huán)醇類化合物生產(chǎn)提供了可選擇的環(huán)境友好的生物催化方法，具有極大地工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明所獲得的手性N-雜環(huán)醇類化合物可作為很多藥物合成中的中間體。以生產(chǎn)5b產(chǎn)物為例(見實(shí)施例1和實(shí)施例27)，RE-ADH催化底物5a時(shí)，底物濃度為120g/l時(shí),轉(zhuǎn)化率為97.4％，ee值>99％，具有很強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明涉及的生物催化過(guò)程示意圖。其中，n在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為1、2或3；m在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為1或2；R在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自叔丁氧羰基，芐基，芐氧羰基，或乙基氧羰基等；ChKRED20為催化劑時(shí)，得到(R)-構(gòu)型醇；RE-ADH為催化劑時(shí)，得到(S)-構(gòu)型醇。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施方案為便于更好的理解本發(fā)明，但并非對(duì)本發(fā)

明的限制。

實(shí)施例1：羰基還原酶的篩選

以本領(lǐng)域熟知的方法，將羰基還原酶基因連入pET28a(+)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21-DE3中異源表達(dá)，6,000rpm，4℃離心10min獲得重組菌濕菌體,重懸于磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，以均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，13,000rpm，4℃離心20min，所得上清即為粗酶液，作為生物催化劑。篩選時(shí)，生物催化及體系為：磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)、羰基還原酶粗酶液10g/l、底物1g/l、NAD⁺濃度0.6g/l和異丙醇5％(v/v)。反應(yīng)時(shí)間為24h，反應(yīng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm。

同時(shí)，將沒有連入羰基還原酶基因的pET28(+)空載體同樣轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21-DE3中異源表達(dá)，重懸于磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH 8.0)，以均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，13,000rpm，4℃離心20min，所得上清為空白對(duì)照轉(zhuǎn)化各類底物。以下展示的篩選結(jié)果，空白對(duì)照均不能轉(zhuǎn)化底物。

反應(yīng)結(jié)束后，以等體積甲基叔丁基醚萃取3次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，而后減壓旋蒸除去溶劑，加入異丙醇(HPLC級(jí))溶解樣品，高速離心后HPLC測(cè)定樣品的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物ee值。(1)羰基還原酶催化還原的底物及HPLC檢測(cè)條件，見表1：

表1底物及測(cè)定條件

(2)羰基還原酶催化各底物的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值，見表2。其中，RE-ADH催化后得到(S)構(gòu)型產(chǎn)物；ChKRED20催化后得到(R)構(gòu)型產(chǎn)物。以下實(shí)施例的相應(yīng)產(chǎn)物構(gòu)型均相同，不再贅述。

表2兩個(gè)酶對(duì)不同底物的轉(zhuǎn)化率和ee值

實(shí)施例2：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物1a

取新鮮培養(yǎng)的羰基還原酶RE-ADH重組菌濕菌體重懸于磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，以均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，13,000rpm，4℃離心20min，所得上清即為粗酶液。

磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，羰基還原酶RE-ADH濃度10g/l(粗酶液)，底物1a濃度40g/l，異丙醇5％(v/v)，NAD⁺濃度0.6g/l，50℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間2h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明2h內(nèi)40g/l底物就能轉(zhuǎn)化完全，得到相應(yīng)(S)構(gòu)型醇，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例3：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物1a

取新鮮培養(yǎng)的羰基還原酶ChKRED20重組菌濕菌體重懸于磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，以均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，13,000rpm，4℃離心20min，所得上清即為粗酶液。

磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，羰基還原酶ChKRED20濃度10g/l(粗酶液)，底物1a濃度40g/l，異丙醇40％(v/v)，NAD⁺濃度0.6g/l，40℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間10h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明10h內(nèi)40g/l底物就能轉(zhuǎn)化完全，得到相應(yīng)(R)構(gòu)型醇，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例4：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物2a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間21h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明21h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例5：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物2a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例6：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物3a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間21h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明21h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為91.2％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例7：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物3a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為93.7％，產(chǎn)物的ee值為98％。

實(shí)施例8：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物4a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間10h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明10h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例9：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物4a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間10h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明10h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例10：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物5a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間0.5h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明0.5h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例11：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物5a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間6h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明6h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例12：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物6a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間4h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明4h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例13：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物6a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間14h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明14h內(nèi)40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例14：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物7a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間1.5h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明1.5h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例15：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物7a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間10h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明10h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例16：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物8a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間21h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明21h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為87.3％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例17：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物8a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為84.5％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例18：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物9a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為51.0％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例19：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物9a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為49.8％，產(chǎn)物的ee值為88％。

實(shí)施例20：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物10a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為94.4％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例21：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物10a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為56.7％，產(chǎn)物的ee值為95％。

實(shí)施例22：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物11a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為78.1％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例23：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物11a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物的轉(zhuǎn)化率為45.6％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例24：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物12a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例25：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物12a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間24h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明24h內(nèi)，40g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例26：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化80g/l底物5a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間5h，反應(yīng)過(guò)程中每一小時(shí)加入5％(v/v)的異丙醇。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明5h內(nèi)，80g/l底物可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例27：羰基還原酶RE-ADH粗酶液催化120g/l底物5a

反應(yīng)體系與實(shí)施例2相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間7h，反應(yīng)過(guò)程中每一小時(shí)加入5％(v/v)的異丙醇。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明7h內(nèi)，120g/l底物的轉(zhuǎn)化率為97.4％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。

實(shí)施例28：羰基還原酶ChKRED20粗酶液催化80g/l底物5a

反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同，轉(zhuǎn)化時(shí)間20h。等體積甲基叔丁基醚萃取終止反應(yīng),樣品處理方法及檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。結(jié)果表明20h內(nèi)，80g/l底物的轉(zhuǎn)化率為89.1％，且產(chǎn)物的ee值大于99.9％。