本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高CRISPR介導(dǎo)的同源重組效率的方法。

背景技術(shù)：

基因組編輯是一種可以對(duì)生物體基因組完成精確修飾的一種技術(shù)，利用基因組編輯技術(shù)可以將細(xì)胞內(nèi)特定的基因進(jìn)行突變、敲入和刪除等，從而改變生物體的遺傳特性。當(dāng)前的基因組編輯技術(shù)是利用某些方法在基因組特定的位置上造成DNA損傷，從而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)主要修復(fù)DNA雙鏈斷裂的機(jī)制有兩條：一條是非同源末端連接途徑(英文全稱：Non-homologous End Joining，英文簡(jiǎn)稱：NHEJ)，在該途徑中細(xì)胞對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行部分酶切，使之產(chǎn)生粘性末端，再將兩個(gè)末端連接起來(lái)，這個(gè)過(guò)程中往往會(huì)導(dǎo)致部分堿基丟失，因此使得該相應(yīng)基因缺乏幾個(gè)氨基酸或者發(fā)生移碼突變而被敲除。另一條重要的修復(fù)途徑是同源重組途徑(英文全稱：Homologous Recombination，英文簡(jiǎn)稱：HR)，若DNA損傷時(shí)的同時(shí)恰好遇到與該損傷位點(diǎn)同源性很高的另一條完整的DNA時(shí)，損傷位點(diǎn)會(huì)以同源的DNA為模板進(jìn)行損傷修復(fù)，若同源基因中被人為引入了其它基因、元件或者點(diǎn)突變則可憑此修改細(xì)胞基因組。因此以同源重組的方式對(duì)基因組DNA進(jìn)行修復(fù)具有更高的可控性，可以完全產(chǎn)生預(yù)期的基因組改變，并且能夠在適當(dāng)?shù)奈恢靡胩囟ǖ耐庠椿?。例如可以在較為穩(wěn)定的基因組位置上插入特定基因進(jìn)行表達(dá)，這對(duì)于獲得高效表達(dá)的重組蛋白細(xì)胞株尤其重要。然而，HR只發(fā)生在細(xì)胞分裂的特定時(shí)期，并且效率低下，極大的限制了基于HR的基因編輯技術(shù)的應(yīng)用。

NHEJ和HR修復(fù)途徑存在一定競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，若削弱了NHEJ途徑的修復(fù)能力必然會(huì)導(dǎo)致HR修復(fù)水平適當(dāng)提升。目前已有大量研究揭示NHEJ和HR途徑調(diào)控中的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)及其相關(guān)基因在其中所起的重要作用，其中Lig4、DNA-PK和XRCC6等都是NHEJ途徑中的關(guān)鍵分子。Lig4是一種DNA連接酶，能將DNA雙鏈斷裂中的末端直接連接回來(lái)，Lig4和XRCC4形成復(fù)合物，并且進(jìn)一步和DNA-PK形成NHEJ途徑所必須的復(fù)合物。PNA-PK是一種磷脂酰肌醇-3依賴的絲/蘇氨酸蛋白激酶，DNA-PK的自磷酸化使其改變構(gòu)象允許末端加工酶接近DNA損傷末端。XRCC6又名Ku70，其與Ku80形成異二聚體結(jié)合DNA雙鏈損傷末端，也是NHEJ修復(fù)途徑中所必須的。有研究表明抑制Lig4、DNA-PK和XRCC6能有效促進(jìn)DNA同源重組修復(fù)。所以在基因編輯的同時(shí)通過(guò)shRNA抑制多個(gè)NHEJ途徑關(guān)鍵分子可能是提高同源重組效率的有效途徑。

將外源基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞特定的位點(diǎn)能有效防止隨機(jī)整合導(dǎo)致的突變并且能使細(xì)胞在多次分裂后仍然能維持外源蛋白高水平的表達(dá)。腺相關(guān)病毒位點(diǎn)1(AAVS1)位于蛋白磷酸酶1調(diào)控亞基12C(PPP1R12C)基因的第一個(gè)內(nèi)含子中，其所處的位置染色體結(jié)構(gòu)較為開放允許外源基因的插入并持久穩(wěn)定的表達(dá)，并且該位點(diǎn)的基因插入對(duì)于其鄰近的基因表達(dá)干擾較小，因此該位點(diǎn)被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因插入人類基因組中的一個(gè)安全位置，是通過(guò)植入外源基因進(jìn)行基因治療以及構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)重組蛋白細(xì)胞株的首選插入位點(diǎn)。目前，在人類多能干細(xì)胞的AAVS1位點(diǎn)處插入外源基因產(chǎn)生遺傳修飾的干細(xì)胞可以很好的用于發(fā)育生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)和基因治療等領(lǐng)域的研究。因此通過(guò)提高HR修復(fù)的效率使得在AAVS1位點(diǎn)特異性的插入外源基因具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

提供一種提高CRISPR介導(dǎo)的同源重組效率的方法，其基于miRNA轉(zhuǎn)錄加工機(jī)制同時(shí)表達(dá)shRNA和sgRNA的方法，在基因編輯的同時(shí)抑制NHEJ途徑。

一方面，通過(guò)sgRNA介導(dǎo)位點(diǎn)特異性DNA斷裂，從而激活細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈損傷修復(fù)機(jī)制以修復(fù)受損DNA；另一方面，通過(guò)共表達(dá)的shRNA抑制NHEJ途徑的關(guān)鍵分子，從而使得DNA損傷只能依靠HR途徑修復(fù)。本發(fā)明具體實(shí)施方式提供一種編輯報(bào)告基因從而檢測(cè)HR效率的方法和一種在AAVS1位點(diǎn)上通過(guò)同源重組高效整合目的基因的方法。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明的shNHEJ TLR1.1 sgRNA載體結(jié)構(gòu)圖。

圖2 shNHRJ TLR1.1 sgRNA載體敲減Lig4、DNA-PK和XRCC6效率的檢測(cè)。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中同源重組效率檢測(cè)結(jié)果。其中GFP(左)表示報(bào)告載體由HR修復(fù)，mCherry(右)表示報(bào)告載體由NHEJ修復(fù)，同一個(gè)樣品的左右兩個(gè)圖來(lái)自熒光顯微鏡的同一視野，GFP和mcherry比值可以反應(yīng)pcDNA3.1(-)-shNHEJ TLR1.1 sgRNA比其它載體更為有效介導(dǎo)同源重組。

圖4為pcDNA3.1(-)shNHEJ AAVS1 sgRNA載體結(jié)構(gòu)圖；

圖5為AAVS1 donor載體(DC-F0215-SH01-10)結(jié)構(gòu)圖；

圖6為本原理及流程圖

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1—shNHEJ TLR1.1 sgRNA載體構(gòu)建及其介導(dǎo)HR效率檢測(cè)

shNHEJ TLR1.1 sgRNA載體構(gòu)建策略如圖1所示，具體如下：

shNHEJ sgRNA載體設(shè)計(jì)；

根據(jù)人Lig4、DNA-PK和XRCC6的mRNA序列，分別設(shè)計(jì)長(zhǎng)度在20-24nt之間的shRNA靶位點(diǎn)。shRNA中sense鏈與靶基因mRNA的序列完全一致，antisense的序列能與sense完全互補(bǔ)配對(duì)為宜。Antisense最好進(jìn)行blast以確保其在全基因組mRNA中沒(méi)有與其它mRNA有過(guò)多的堿基配對(duì)，以免有脫靶效應(yīng)。Sense與antisense之間的loop區(qū)域可以自由設(shè)計(jì)成無(wú)配對(duì)的區(qū)域，但在loop區(qū)域含有UGUG模體的加工效率更佳。SgRNA的設(shè)計(jì)需要考慮靶位點(diǎn)上有相應(yīng)的PAM位點(diǎn)，我們已SpCas9為例，將含有NGG PAM識(shí)別位點(diǎn)前20個(gè)堿基作為sgRNA上的引導(dǎo)序列，再這20個(gè)堿基后加上SpCas9 sgRNA通用的部分構(gòu)成完整的sgRNA序列。

本例中ShRNA與sgRNA之間的臂選擇miR-23a/27a/24-2clusters上的間隔序列，將sgRNA插入其中，sgRNA靶向pCVL Traffic Light Reporter 1.1(I-Sce target)Ef1a BFP(Plasmid#31481,Addgene)報(bào)告載體中的I-SceI酶切位點(diǎn)上的5’-TTATTTGCGTAGGGATAACA GGG-3’序列，其中最后3個(gè)GGG為PAM識(shí)別位點(diǎn)，僅出現(xiàn)于報(bào)告載體中，不存在于sgRNA中。我們構(gòu)建的sgRNA的DNA序列為：

5’-TTATTTGCGTAGGGATAACATAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG CTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT-3’。該sgRNA能靶向pCVL Traffic Light Reporter 1.1(I-Sce target)Ef1a BFP報(bào)告載體，通過(guò)NHEJ途徑修復(fù)可以使細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，通過(guò)HR途徑修復(fù)可以使細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。

shNHRJ sgRNA載體構(gòu)建外包給公司從頭合成，并以XbaI和BamHI克隆至pcDNA3.1(-)中，其序列如下：

AGCCTCTGGCCCCGCCCGGTGCCCCCCTCACCCCTGTGCCACGGCCGGCTAGAGAGAGAATGGCCTATGGAATAGTGAAGCCACAGATGTATTCCATAGGCCATTCTCTCTCTAACCGACCCTGAGCTCTGCCACCGAGGATGCTGCCCGGGGACGGGGTGGCAGAGAGGCCCCGAAGCCTGTGCCTGGCCTGAGGAGCTTGGGTGAAGTTCATCCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTAGGATGAACTTCACCCAACCCCCAGGCCCTCACCTCCTCTGGCCTTGCCGCCTGTCCCCTGCTGCCGCCTGTCTGCCTGCCATCCTGCTGCCTGGCCTCCCTGGGCTCTGCCTCCCGGTGCCAACCTCTTTAGTGATAGTGAAGCCACAGATGTATCACTAAAGAGGTTGGCACGGGTCAAGCCCCCTTGGAGCCTGCAGCCCCTGCCTTCCCTGGGTGGGCTGATGCTTGGA

shNHRJ TLR1.1 sgRNA載體構(gòu)建外包給公司從頭合成，并以XbaI和BamHI克隆至pcDNA3.1(-)中，其序列如下：

AGCCTCTGGCCCCGCCCGGTGCCCCCCTCACCCCTGTGCCACGGCCGGCTAGAGAGAGAATGGCCTATGGAATAGTGAAGCCACAGATGTATTCCATAGGCCATTCTCTCTCTAACCgaccctgagctctgccaccgaggatgctgTTATTTGCGTAGGGATAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTcccggggacggggtggcaGAGAGGCCCCGAAGCCTGTGCCTGGCCTGAGGAGCTTGGGTGAAGTTCATCCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTAGGATGAACTTCACCCAACCCCCAGGCCCTCACCTCCTCTGGCCTTGCCGCCTGTCCCCTGCTGCCGCCTGTCTGCCTGCCATCCTGCTGCCTGGCCTCCCTGGGCTCTGCCTCCCGGTGCCAACCTCTTTAGTGATAGTGAAGCCACAGATGTATCACTAAAGAGGTTGGCACGGGTCAAGCCCCCTTGGAGCCTGCAGCCCCTGCCTTCCCTGGGTGGGCTGATGCTTGGA

23a TLR1.1 sgRNA載體構(gòu)建

23a TLR1.1 sgRNA外包給公司從頭合成，并以XbaI和BamHI克隆至pcDNA3.1(-)中，其序列如下：

agcctctggccccgcccggtgcccccctcacccctgtgccacggccggctggggttcctggggatgggatttgcttcctgtcacaaatcacattgccagggatttccaaccgaccctgagctctgccaccgaggatgctgTTATTTGCGTAGGGATAACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTcccggggacggggtggcagagaggccccgaagcctgtgcctggcctgaggagcagggcttagctgcttgtgagcagggtccacaccaagtcgtgttcacagtggctaagttccgccccccaggccctcacctcctctggccttgccgcctgtcccctgctgccgcctgtctgcctgccatcctgctgcctggcctccctgggctctgcctcccgtgcctactgagctgaaacacagttggtttgtgtacactggctcagttcagcaggaacaggggtcaagcccccttggagcctgcagcccctgccttccctgggtgggctgatgcttgga

miRNA-based sgRNA載體轉(zhuǎn)染和表達(dá)檢測(cè)

miRNA-based sgRNA載體可以用通用的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)。本實(shí)施例用轉(zhuǎn)染試劑PEI將其與SpCas9表達(dá)載體lentiCRISPR(Plasmid#49535,Addgene)共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞檢測(cè)其knockdown、HR和NHEJ的效率。具體操作為6孔板細(xì)胞，每個(gè)孔轉(zhuǎn)染1.5μg shNHEJ TLR1.1 sgRNA或miR-23a TLR1.1 sgRNA以轉(zhuǎn)染pCDH或者pCDH-23a cluster為陰性對(duì)照，同時(shí)每孔再加入1.5μg lentiCRISPR和1μg pCVL Traffic Light Reporter 1.1(I-Sce target)Ef1a BFP報(bào)告載體進(jìn)行總4μg進(jìn)行共轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。每孔加opti-medium 200μl和12μl PEI轉(zhuǎn)染試劑。

本實(shí)施例用定量PCR檢測(cè)Lig4、DNA-PK和XRCC6的knockdown效果。將shNHRJ TLR1.1 sgRNA、SpCas9表達(dá)載體、donor載體和TLR1.1報(bào)告載體共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后2天Trizol裂解細(xì)胞并提取RNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄總RNA，接著用跨內(nèi)含子的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。通過(guò)定量PCR檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)Lig4、DNA-PK和XRCC6能有效的被shNHEJ和shNHRJ抑制(圖2)。

NHEJ和HR的效率通過(guò)報(bào)告基因的方法進(jìn)行檢測(cè)，將shNHRJ TLR1.1sgRNA、SpCas9表達(dá)載體、donor載體和TLR1.1報(bào)告載體共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，發(fā)生位點(diǎn)特異性NHEJ的細(xì)胞能發(fā)出紅色熒光，而發(fā)生位點(diǎn)特異性HR的細(xì)胞發(fā)出綠光。我們發(fā)現(xiàn)我們?cè)O(shè)計(jì)的23a TLR1.1 sgRNA對(duì)照載體可以使部分細(xì)胞發(fā)出紅色熒光和綠色陽(yáng)光，因此意味著該載體可以表達(dá)有活性的sgRNA并由NHEJ和HR途徑共同修復(fù)損傷的DNA(圖3)。

實(shí)施例2—shNHEJ AAVS1 sgRNA載體構(gòu)建

重組蛋白藥物表達(dá)需要構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，已知整合到人類基因組某些位點(diǎn)的基因表達(dá)效率較高且較為穩(wěn)定，不易在細(xì)胞多次傳代的過(guò)程中發(fā)生缺失、沉默等現(xiàn)象，因此將外源基因特異性整合到這些位點(diǎn)有助于提高重組蛋白穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建效率。其中AAVS1位點(diǎn)我們擬采用我們的策略實(shí)現(xiàn)這一高效的位點(diǎn)特異性整合。具體如下：

設(shè)計(jì)靶向AAVS1位點(diǎn)的sgRNA：GGGGCCACTAGGGACAGGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT

將AAVS1 sgRNA替換實(shí)施例1中pcDNA3.1(-)shNHEJ TLR1.1 sgRNA中的TLR1.1 sgRNA(圖4)

合成如下shNHEJ-AAVS1 sgRNA序列，并以XbaI和BamHI位點(diǎn)克隆至pcDNA3.1(-)載體中。

AGCCTCTGGCCCCGCCCGGTGCCCCCCTCACCCCTGTGCCACGGCCGGCTAGAGAGAGAATGGCCTATGGAATAGTGAAGCCACAGATGTATTCCATAGGCCATTCTCTCTCTAACCgaccctgagctctgccaccgaggatgctgGGGGCCACTAGGGACAGGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTcccggggacggggtggcaGAGAGGCCCCGAAGCCTGTGCCTGGCCTGAGGAGCTTGGGTGAAGTTCATCCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTAGGATGAACTTCACCCAACCCCCAGGCCCTCACCTCCTCTGGCCTTGCCGCCTGTCCCCTGCTGCCGCCTGTCTGCCTGCCATCCTGCTGCCTGGCCTCCCTGGGCTCTGCCTCCCGGTGCCAACCTCTTTAGTGATAGTGAAGCCACAGATGTATCACTAAAGAGGTTGGCACGGGTCAAGCCCCCTTGGAGCCTGCAGCCCCTGCCTTCCCTGGGTGGGCTGATGCTTGGA

將上述pcDNA3.1(-)-shNHEJ AAVS1 sgRNA載體1μg與Cas9表達(dá)載體1μg以及AAVS1donor載體(DC-F0215-SH01-10，見圖5，購(gòu)買至GeneCopoeia公司)1μg用200μl opti-medium稀釋后加9μl PEI轉(zhuǎn)染試劑混勻靜止25min后共轉(zhuǎn)染6孔板293T細(xì)胞。其中AAVS1donor載體中含有所需要過(guò)表達(dá)的重組蛋白編碼基因。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知，本發(fā)明的技術(shù)方案在下述范圍內(nèi)變化時(shí)，仍然能夠得到與上述實(shí)施例相同或相近的技術(shù)效果，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

一種提高CRISPR介導(dǎo)的同源重組效率的方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)計(jì)靶向Lig4、DNA-PK和XRCC6的shRNA；

(2)將shRNA的基因序列順序排列，并sgRNA的基因序列連接于二shRNA之間，形成shRNA-sgRNA多順?lè)醋樱?/p>

(3)將shRNA sgRNA多順?lè)醋又糜赗NA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動(dòng)子下游，并置于載體上導(dǎo)入人細(xì)胞系中表達(dá)pri-shRNA-sgRNA；

(4)上述pri-shRNA-sgRNA在細(xì)胞中被Dicer和Drosha加工成pre-shRNA-sgRNA，在此過(guò)程中，sgRNA和pre-shRNA分別釋放出來(lái)，其中sgRNA形成sgRNA-Cas9復(fù)合物，進(jìn)而識(shí)別相應(yīng)的靶位點(diǎn)，對(duì)所述需要進(jìn)行編輯的基因進(jìn)行編輯；pre-shRNA則抑制Lig4、DNA-PK和XRCC6從而抑制NHEJ修復(fù)途徑。

所述shRNA的正義鏈和反義鏈之間具有l(wèi)oop區(qū)域。

所述RNA聚合酶II啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子。

參閱圖6，圖6為本發(fā)明提供的提高CRISPR介導(dǎo)的同源重組效率的方法，該方法如圖6所示，包括如下步驟：

步驟S601、設(shè)計(jì)靶向Lig4、DNA-PK和XRCC6等促進(jìn)非同源末端連接(NHEJ)途徑的基因的shRNA，并將其以miRNA的形式串聯(lián)成多順?lè)醋颖磉_(dá)；

步驟S602、根據(jù)目的，在需要進(jìn)行同源重組(HR)編輯的目的基因上選取合適的sgRNA靶位點(diǎn)；

步驟S603、將上述sgRNA與shRNA融合構(gòu)成shRNA-sgRNA多順?lè)醋?，將多順?lè)醋又糜赗NA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動(dòng)子下游構(gòu)建表達(dá)載體；

步驟S604、將sgRNA兩側(cè)約500bp(設(shè)定范圍)作為重組臂，中間插入目的基因，其中，重組臂序列和細(xì)胞基因組上特定位置的序列相同用于引發(fā)與細(xì)胞基因組之間的同源重組，插入基因可以是插入位置處原本的基因的修飾也可以是需要外源表達(dá)的新的基因；

步驟S605、將上述載體與Cas9表達(dá)載體以及含重組臂的donor載體共轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，以通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成pri-shRNA-sgRNA；

步驟S606、上述pri-shRNA-sgRNA在動(dòng)物細(xì)胞中被Drosha和Dicer加工，在此過(guò)程中，sgRNA和pre-shRNA分別釋放出來(lái)，其中sgRNA的部分與Cas9裝配形成位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶，進(jìn)而識(shí)別相應(yīng)的靶位點(diǎn)，對(duì)相應(yīng)的基因進(jìn)行編輯；pre-shRNA則被加工進(jìn)入RISC復(fù)合物成為成熟的shRNA，以抑制NHEJ途徑的活性。

上述Lig4、DNA-PK和XRCC6的shRNA和特定的sgRNA可以利用miRNA的表達(dá)加工機(jī)制同時(shí)表達(dá)抑制Lig4、DNA-PK和XRCC6的shRNA和特點(diǎn)的sgRNA。

在CRISPR基因編輯的同時(shí)抑制了NHEJ途徑使得更多的斷裂的DNA采取HR修復(fù)的方式進(jìn)行修復(fù)。HR修復(fù)的產(chǎn)物完全是已知的不會(huì)像NHEJ途徑那樣產(chǎn)生難以預(yù)計(jì)的DNA缺失，因此基因編輯的結(jié)果更加可控；HR修復(fù)效率的提高有助于增強(qiáng)外源基因的位點(diǎn)特異性整合，從而提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以及高表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株制備的效率。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。