本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治香蕉枯萎病的內(nèi)生真菌，具體地說涉及一種防治香蕉枯萎病的內(nèi)生真菌Schizothecium sp.L-14及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

香蕉枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病、凋萎病，是制約香蕉生產(chǎn)的一種毀滅性土傳病害。該病由鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌古巴?；颓秩疽?，近年在華南蕉區(qū)有擴(kuò)大為害趨勢。目前尚無有效克制香蕉枯萎病的藥劑，較為耐病的香蕉品種又無法達(dá)到產(chǎn)量的要求。生物防治作為綜合防治香蕉枯萎病的措施之一，是一項有發(fā)展前景的環(huán)境友好型技術(shù)。

目前，國內(nèi)外研究學(xué)者對香蕉枯萎病的生物防治已開展不少研究，已報道的生防微生物包括了真菌、細(xì)菌和放線菌等?？路落摰?2010)發(fā)現(xiàn)通過連續(xù)施用木霉菌株gz-2菌劑對枯萎病的防治效果達(dá)74.4％；石妞妞等(2015)于接種香蕉枯萎病菌前4d和2d，施用枯草芽孢桿菌T122F，對香蕉枯萎病防效達(dá)66％。茹祥(2012)在海南吊羅山原始林區(qū)分離到兩株對香蕉枯萎病有較好生防效果的放線菌DL-24和DL-28。盡管生防微生物資源的篩選收集工作已經(jīng)開展得較為廣泛，但因田間環(huán)境因素復(fù)雜，適用于大規(guī)模田間應(yīng)用的生防微生物資源依然很少。內(nèi)生真菌是一類能與寄主植物互惠共生的微生物資源，其定殖宿主具有非專一性，且在脅迫環(huán)境中，其分布更為廣泛。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種內(nèi)生真菌菌株L-14，已于2016年4月18日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC NO.12240，屬于裂殼菌(Schizothecium sp.)真菌。

菌株L-14的分離所需材料與方法如下：

1.材料

土樣采集后盡快處理或置于4℃冰箱待用。

選用白菜種子，種子表面消毒方法：體積濃度75％酒精20秒→質(zhì)量濃度1％次氯酸鈉1分鐘→無菌水漂洗三次，每次1分鐘→無菌濾紙吸干水分→置于純瓊脂上培養(yǎng)2-3天，出芽長成無菌苗。

2.菌株L-14的分離

將土樣與滅菌育苗土以重量比2:1比例混合后裝入培養(yǎng)杯中，將上述表面消毒后的白菜苗，培養(yǎng)1-2個月后收獲，用龍頭水沖洗白菜幼苗的根，采用質(zhì)量濃度1％次氯酸鈉1-2分鐘進(jìn)行表面消毒，滅菌水沖洗3次后，吸干水分后置于重量濃度為1/2玉米粉培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并逐日觀察，待菌絲從根段部位長出后及時轉(zhuǎn)接到麥芽汁培養(yǎng)基上，獲得純培養(yǎng)菌株。

生防菌株的分類鑒定：

1.菌株的形態(tài)學(xué)觀察

將從冰箱取出的菌種接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)上，培養(yǎng)3周后觀察菌落形態(tài)特征。用插片法將純化的菌株接于燕麥培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)2-4周，待明顯看到菌絲著生在蓋玻片上時，將玻片取出，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.菌株的分子鑒定

將內(nèi)生真菌菌株L-14培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)，在28℃轉(zhuǎn)速120r/min搖床中震蕩培養(yǎng)14d后，過濾收集菌絲。菌絲體總DNA采用Saghai et al.(1984)【Phytopathology,2015,105:1512-1521Saghai MA,Soliman KM,Jorgensen RA,et al.Ribosomal DNA spacer-length Polymorphism in barley:mendelian inheritance chromosomal location and population dynamics[J].Pro.Natl.Acard.Sci.USA,1984,81(24):5014-5018】的CTAB法提取。28SrDNA的區(qū)域PCR擴(kuò)增采用通用引物L(fēng)ROR和LR5。PCR反應(yīng)體系為：TIANgel一管便攜式MasterMix(成分：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L Dntp each，0.05U Pplymerase/μL、ddH₂O)9μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，用超純水定容至25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min， 94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

序列使用ClustalX 1.81和BioEdit v7.0軟件進(jìn)行分析，實驗獲得的28S rRNA基因D1/D2區(qū)序列及其在GenBank中下載的最相似序列，使用MEGA6.06軟件基于Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)bootstrap1000次循環(huán)檢驗系統(tǒng)樹的可靠性。

3.內(nèi)生真菌菌株L-14的形態(tài)學(xué)鑒定

該菌株在CMMY培養(yǎng)基上長速較快，28℃下培養(yǎng)兩周后菌落直徑60-65mm，圓形，棕色至深棕色，粉狀(如圖2所示)。顯微鏡下觀察可見菌絲光滑，有隔，淺黃褐色。分生孢子梗保齡球狀至長瓶狀，頂端有明顯囊領(lǐng)，部分彎曲，偶有縊縮，不分枝或偶有1-2個分枝，淺黃褐色，光滑，0-2個分隔，分隔處稍有縊縮或不縊縮，分生孢子梗長7.9-25.7μm，梗最寬部位1.7-3.8μm，梗最窄部位0.7×1.7μm。分生孢子從分生孢子梗頂部鏈生，淺黃褐色，梨形、倒卵球形或楔形，基部有平整截面，光滑，無隔，1.9-3.3×1-2μm(如圖3、4所示)。

4.序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株L-14的28SrRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測序后，測得其序列長度為900bp。將該序列進(jìn)行BLAST分析，選取相似性極高的部分菌株，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示)。菌株L-14與Schizothecium屬種聚到一起，支持率為94％，結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為裂殼菌(Schizothecium sp.)真菌。

本發(fā)明還提供了該菌株L-14在防治香蕉枯萎病上的應(yīng)用。

菌株L-14在平皿防治上防治香蕉枯萎病上的應(yīng)用，包括以下幾個步驟：

步驟A:將菌株L-14活化后接種于燕麥培養(yǎng)基上，備用；

步驟B：選擇長勢一致的無菌香蕉組培苗移栽至菌落上，根系平鋪于菌株L-14菌落表面，每菌落移栽一株組培苗；將培養(yǎng)皿放入組培瓶中，再將組培瓶放入培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，獲得菌株L-14-香蕉苗共生體。

優(yōu)選的，所述步驟B中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：溫度25℃、光照強(qiáng)度 180μmol/m²·s²、光照時間16h/d，培養(yǎng)15d。

菌株L-14在盆栽防治上的應(yīng)用包括以下幾個步驟：

步驟A＇:取長勢一致的3-4葉香蕉幼苗統(tǒng)一栽種于營養(yǎng)杯中，采用無病自然土種植；

步驟B＇:將活化后的菌株L-14接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，用滅菌紗布過濾收集菌絲團(tuán)，用滅菌水沖洗數(shù)次后，將菌絲團(tuán)打碎配制成L-14菌液，備用；

步驟C＇：對步驟A＇得到的香蕉苗用菌株L-14菌液進(jìn)行灌根。

優(yōu)選的，所述步驟B＇中，所述L-14菌液的濃度為5×10⁵CFU/mL的菌液。

優(yōu)選的，所述步驟C＇中，每株香蕉苗灌根50mL菌液，每隔15d灌根一次，共灌根三次。

本發(fā)明的有益效果：菌株L-14對香蕉枯萎病的防治效果穩(wěn)定，平皿防效平均可達(dá)到72.42％，盆栽防效平均可達(dá)到56.52％。

附圖說明

圖1是菌株L-14與Schizothecium屬種聚到一起的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

圖2是菌株L-14在PDA上的菌落形態(tài)。

圖3、4是菌株L-14產(chǎn)孢梗和分生孢子(標(biāo)尺＝10μm)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明：

實施例1

內(nèi)生真菌菌株L-14抗香蕉枯萎病的平皿防治

步驟(1):內(nèi)生真菌菌株L-14與香蕉組培苗的共培養(yǎng)

將供試菌株L-14活化后接種于燕麥培養(yǎng)基(燕麥粉10g/L，瓊脂18g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，NaNO₃ 1g/L)上，每皿接種3個菌塊，培養(yǎng)10d，備用。選擇長勢一致的無菌香蕉組培苗移栽至菌落上，根系平鋪于菌落表面，每菌落移栽一株組培苗，每皿栽3株。將培養(yǎng)皿放入組培瓶 中，于25℃、光照強(qiáng)度180μmol/m²·s²、光照時間16h/d的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)15d。以不接種內(nèi)生真菌菌株的處理為對照，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)7皿。

步驟(2):抗香蕉枯萎病內(nèi)生真菌菌株L-14的平皿防治試驗

將鐮刀菌活化后接于水瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂9g/L)上，每皿接種3個菌塊，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，備用。將步驟(1)培養(yǎng)獲得的菌株L-14-香蕉苗共生體連同培養(yǎng)基一起平移至長有病原菌的水瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃，光照強(qiáng)度180μmol/m²·s²，濕度80％的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d。對照則直接接入帶有鐮刀菌的水瓊脂平板上。觀察記錄各處理的病級情況，并計算病情指數(shù)和防治效果。平皿試驗病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級-外觀無可見癥狀；1級-香蕉植株長勢無明顯受阻，全株黃萎面積不超35％；2級-香蕉植株弱小，全株黃萎面積達(dá)35％-80％；3級-香蕉植株全株黃萎面積達(dá)80％以上，甚至全株枯死。

防效計算公式為：

內(nèi)生真菌菌株L-14抗香蕉枯萎病的平皿防治結(jié)果：

通過平皿防治試驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力，3個重復(fù)抑菌率達(dá)70％以上，平均防治效果為72.42％。

表1內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病的平皿防治效果

實施例2

內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病的盆栽防治

步驟(1)：內(nèi)生真菌菌株L-14菌液的制備

將活化后的內(nèi)生真菌菌株L-14菌塊接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中，于25℃轉(zhuǎn)速120r/min搖床中震蕩培養(yǎng)14d后，用滅菌紗布過濾收集菌絲團(tuán)，用滅菌水沖洗數(shù)次后，將菌絲團(tuán)打碎配制成5×10⁵CFU/mL的菌液，備用。

步驟(2)：鐮刀菌孢子懸浮液的制備

參照柯仿鋼等，西貢蕉枯萎病生防木霉菌株gz-2的鑒定及生物學(xué)特性研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，23(5)：1533-1539方法，配制濃度為1×10⁶CFU/mL的菌液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟(3)：內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病的盆栽防治試驗

本實驗在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行。取長勢一致的香蕉幼苗(3-4葉)統(tǒng)一栽種于20cm×19cm的營養(yǎng)杯中，采用無病自然土種植。每株香蕉苗灌根50mL L-14菌液，每隔15d灌根一次，共灌根三次。于最后一次灌根結(jié)束10d后，對香蕉苗進(jìn)行傷根接種鐮刀菌孢子懸浮液。保持適溫適濕，觀察香蕉苗植株發(fā)病情況，約于接種后25d解剖香蕉植株球莖，觀察記錄香蕉苗病級，并計算防效。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù) 8株香蕉苗，以清水灌根并接種鐮刀菌孢子懸浮液為對照。病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級-球莖健康無變色；1級：球莖變色面積占球莖面積的20％以下；2級-球莖變色面積占球莖面積的20％-40％；3級-球莖變色面積占球莖面積的40％-60％；4級-球莖變色面積占球莖面積的60％-80％；5級-球莖變色面積占球莖面積80％以上，甚至全部球莖變色壞死。防效計算公式為：

內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病的盆栽防治結(jié)果

如表2可知，通過盆栽防治試驗可以看出，內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病的防治效果穩(wěn)定，3個重復(fù)的防治效果均在50％以上，平均防效達(dá)56.52％，對香蕉枯萎病的發(fā)生有明顯的抑制作用。

表2內(nèi)生真菌菌株L-14對香蕉枯萎病的盆栽防治效果

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。