本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙?；?D-氨基葡萄糖為二糖單位的以β-l,3和β-l,4糖苷鏈交替連接組成的一種線性粘多糖，廣泛存在于人體皮膚、角膜、關(guān)節(jié)液、細(xì)胞外基質(zhì)中，具有保持水分、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、促進(jìn)細(xì)胞自我修復(fù)和軟骨形成等生理功能。透明質(zhì)酸具有良好的生物相容性、降解性以及黏彈性，改性條件溫和、工藝簡單，可修飾位點多，其羥基、羧基和乙?；伎捎糜谛揎椄男?，因而其研究備受青睞。近年來，以透明質(zhì)酸為基本原料制備的水凝膠在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，在細(xì)胞三維培養(yǎng)、藥物遞送載體、支架材料、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

在透明質(zhì)酸研究與應(yīng)用中，通常都需要對其進(jìn)行改性，以滿足要求，拓寬適用范圍。常用改性方法有化學(xué)改性和復(fù)合改性兩種，化學(xué)改性通過酯化、酰胺化、開環(huán)、交聯(lián)、接枝等，復(fù)合改性是通過將透明質(zhì)酸與其它聚合物共混改性或者形成聚電解質(zhì)復(fù)合物實現(xiàn)[J Xu,L Ai,HY Bai,et al.Research progress of modification of hyaluronic acid.Polymer Bulletin,2011,2:78-84]。鑒于透明質(zhì)酸的優(yōu)異性能，越來越多的研究者以改性為基礎(chǔ)，設(shè)計制備新的功能化透明質(zhì)酸衍生物，進(jìn)一步發(fā)掘它的潛能，不斷擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。生物體用來直接合成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，L-賴氨酸作為其中重要一種，為人體必需氨基酸，與其他改性劑相比，具有安全無毒的優(yōu)點。L-賴氨酸有兩個氨基，可保護(hù)一個氨基，用另一個氨基進(jìn)行反應(yīng)，可見反應(yīng)位點可控是其一大優(yōu)點。

利用L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物來制備性能優(yōu)異的水凝膠，交聯(lián)劑的選擇起著十分重要的作用。常用的交聯(lián)劑大致可分為兩類，一類是化學(xué)合成的交聯(lián)劑，另一類是生物交聯(lián)劑。較為常用的交聯(lián)劑有戊二醛、環(huán)氧化合物等。這些化學(xué)合成的交聯(lián)劑雖然各有優(yōu)點，但它們的一些缺點也是不容忽視的。由于這些交聯(lián)劑具有明顯的細(xì)胞毒性[DP Speer,M Chvapil,CD Eskelson,et al.Biological effects of residual glutaraldehyde in glutaraldehyde---tanned collagen biomaterial.J Biomed Mater Res,1980,14:753-764；C Nishi,N Nakajima,Y Ikada,et al.In vitro evaluation of cytotoxicity of diepoxycopounds used for biomaterial modification.J Biomed Mater Res,1995,29:829-834]。戊二醛作為最早開始使用且一直在使用的交聯(lián)劑，具有雙官能團(tuán)，能有效地與氨基進(jìn)行交聯(lián)，但大量研究表明其有細(xì)胞毒性，會加速組織鈣化，使組織硬化，這極大地限制了其在關(guān)于生物相容性評價乃至活體實驗方面的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠及其制備方法，通過將L-賴氨酸接枝于透明質(zhì)酸分子上，再與二元醛交聯(lián)劑經(jīng)希夫堿鍵交聯(lián)形成水凝膠，最后利用硼氫化鈉還原法將希夫堿中的碳氮雙鍵還原，有效解決了二元醛的毒性問題，該水凝膠具有工藝簡單、安全無毒、生物相容性良好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、形變恢復(fù)能力優(yōu)異等特點，可用于3D腫瘤模型構(gòu)建、細(xì)胞/藥物遞送、組織再生修復(fù)、創(chuàng)傷敷料等方面。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的制備方法，制備方法如下：

將L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物溶于水中形成質(zhì)量濃度為1％～10％的溶液，向其中加入二元醛溶液，混合均勻后，轉(zhuǎn)移至模具中室溫交聯(lián)反應(yīng)0.5小時～4小時；接著，浸入硼氫化鈉溶液中保持12小時～48小時，然后再在磷酸鹽緩沖溶液中浸泡1天～3天，最后經(jīng)冷凍干燥，得到L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，硼氫化鈉的摩爾數(shù)是二元醛摩爾數(shù)的1～10倍，二元醛溶液中二元醛的質(zhì)量為L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物質(zhì)量的1％～20％。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物的制備方法如下：

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到混合物，然后將該混合物煮沸2小時～4小時，熱過濾，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為1:1～4:1；混合物中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為0.5～6％：

2)配制質(zhì)量濃度為0.5％～2％的透明質(zhì)酸水溶液，加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后將pH值調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時～60小時，得到溶液；N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.22～0.99倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2～10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.2～0.9倍；

3)向步驟2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，攪拌下加入步驟2)到溶液2倍體積量的無水乙醇中，加入過程中出現(xiàn)沉淀，收集沉淀物，再將所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；

將8-羥基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入到溶液A中，攪拌12小時～48小時后過濾去除固體，水相用溶液B洗至無色，透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，得到L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的1～5倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為0.5:1～1.5:1。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的透明質(zhì)酸分子量為5000Da～3000kDa。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的透析所用的透析袋截留分子量為3500Da。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的冷凍干燥為零下20℃保持72小時、20℃保持4小時。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，混合均勻是通過磁力攪拌10分鐘～30分鐘實現(xiàn)的。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的硼氫化鈉溶液的質(zhì)量濃度為0.1％～10％。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的二元醛為丁二醛、戊二醛或己二醛；二元醛溶液的質(zhì)量濃度為1％～20％。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為10mmol/L，pH值為7.4；所述的在磷酸鹽緩沖液中浸泡1天～3天，期間每隔2小時～5小時換一次磷酸鹽緩沖液。

一種L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠，該水凝膠平均孔徑為145μm，壓縮模量為4kPa～10kPa。

與現(xiàn)有透明質(zhì)酸水凝膠及制備技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

(1)在透明質(zhì)酸衍生物水凝膠形成中雖然采用了二元醛做交聯(lián)劑，但通過硼氫化鈉還原法將交聯(lián)橋鍵中的碳氮雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱颂嫉獑捂I，從根本上解決了降解產(chǎn)生毒性的二元醛問題，同時提高了水凝膠的力學(xué)穩(wěn)定性和持久性，該水凝膠平均孔徑為145μm，壓縮模量為4kPa～10kPa。

(2)該水凝膠制備工藝簡單、反應(yīng)條件溫和，通過調(diào)節(jié)二元醛與L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物的比例關(guān)系，使制備的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的性能可控可調(diào)，適用范圍廣，可用于3D腫瘤模型構(gòu)建、細(xì)胞/藥物遞送、組織修復(fù)、創(chuàng)傷敷料等方面。

進(jìn)一步的，透明質(zhì)酸用L-賴氨酸改性，原料易得，安全無毒，生物相容性優(yōu)異。

進(jìn)一步的，在利用L-賴氨酸接枝改性透明質(zhì)酸時，采用了L-賴氨酸-銅絡(luò)合物，既確保了反應(yīng)位點，又有效保留了α-氨基酸端基，并且實驗過程簡便，反應(yīng)效率高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1獲得的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠試樣的光學(xué)照片。

圖2為本發(fā)明實施例1獲得的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的流變學(xué)性能。

圖3為本發(fā)明實施例1獲得的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

圖4為本發(fā)明實施例1獲得的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的掃描電鏡圖，圖4(a)放大倍數(shù)為35，圖4(b)放大倍數(shù)為500。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于此。

實施例1

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到混合物，然后將該混合物煮沸2小時～4小時，熱過濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為1.5:1；混合物中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為5％：

2)配制質(zhì)量濃度為1％的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后利用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌24小時，得到溶液；N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.44倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的4倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.4倍；其中，透明質(zhì)酸分子量為170kDa。

3)向步驟2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，攪拌下緩慢加入步驟2)到溶液2倍體積量的無水乙醇中，加入過程中出現(xiàn)沉淀，收集沉淀物，再將所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的3倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1:1，接著，將溶液B加入到溶液A中，磁力攪拌12小時～48小時后過濾去除固體，水相用溶液B洗至無色，采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物。

4)將L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物溶于水中形成質(zhì)量濃度為7％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通過磁力攪拌10分鐘，混合均勻后，轉(zhuǎn)移至模具中室溫交聯(lián)反應(yīng)4小時；接著，浸入質(zhì)量濃度為0.5％的硼氫化鈉溶液中保持24小時，然后再在濃度為10mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡3天，期間每隔2小時換一次磷酸鹽緩沖液，最后經(jīng)冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，硼氫化鈉的摩爾數(shù)是二元醛摩爾數(shù)的5倍，二元醛溶液中二元醛的質(zhì)量為L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物質(zhì)量的14％，二元醛為丁二醛，二元醛溶液的質(zhì)量濃度為8％。

由本實施例獲得的L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸水凝膠宏觀光學(xué)照片、流變學(xué)性能和壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線、掃描電鏡圖片分別如圖1、圖2、圖3和圖4所示。由圖1可知，L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠彈性性能很好；由圖2可以看出，該水凝膠儲能模量均遠(yuǎn)大于損耗模量，表明彈性性能好，且儲能模量和損耗模量隨著時間變化基本保持不變，說明該水凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好；由圖3可知，該水凝膠壓縮模量為6.3kPa，且壓縮曲線與回彈曲線基本重合，說明該水凝膠形狀恢復(fù)能力及彈性性能好。圖4中兩圖放大倍數(shù)分別為35倍和500倍，從圖4(a)可知該水凝膠呈現(xiàn)均勻多孔的結(jié)構(gòu)，平均孔徑約為145μm，從圖4(b)可以看出其孔壁光滑無褶皺。

實施例2

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到混合物，然后將該混合物煮沸2小時，熱過濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為1:1；混合物中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為4％：

2)配制質(zhì)量濃度為1.5％的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后利用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時，得到溶液；N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.22倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.7倍；其中，透明質(zhì)酸分子量為5000Da。

3)向步驟2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，攪拌下緩慢加入步驟2)到溶液2倍體積量的無水乙醇中，加入過程中出現(xiàn)沉淀，收集沉淀物，再將所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的1倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為0.5:1，接著，將溶液B加入到溶液A中，磁力攪拌12小時后過濾去除固體，水相用溶液B洗至無色，采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物。

4)將L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物溶于水中形成質(zhì)量濃度為1％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通過磁力攪拌20分鐘，混合均勻后，轉(zhuǎn)移至模具中室溫交聯(lián)反應(yīng)1.5小時；接著，浸入質(zhì)量濃度為0.1％的硼氫化鈉溶液中保持48小時，然后再在濃度為10mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡1天，期間每隔2小時換一次磷酸鹽緩沖液，最后經(jīng)冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，硼氫化鈉的摩爾數(shù)是二元醛摩爾數(shù)的1倍，二元醛溶液中二元醛的質(zhì)量為L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物質(zhì)量的1％，二元醛為戊二醛，二元醛溶液的質(zhì)量濃度為5％。

本實施例制得的水凝膠的壓縮模量為4kPa。

實施例3

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到混合物，然后將該混合物煮沸3小時，熱過濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為2:1；混合物中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為2％：

2)配制質(zhì)量濃度為0.5％的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后利用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌45小時，得到溶液；N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.5倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.4倍；其中，透明質(zhì)酸分子量為30kDa。

3)向步驟2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，攪拌下緩慢加入步驟2)到溶液2倍體積量的無水乙醇中，加入過程中出現(xiàn)沉淀，收集沉淀物，再將所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的2倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1.5:1，接著，將溶液B加入到溶液A中，磁力攪拌20小時后過濾去除固體，水相用溶液B洗至無色，采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物。

4)將L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物溶于水中形成質(zhì)量濃度為5％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通過磁力攪拌30分鐘，混合均勻后，轉(zhuǎn)移至模具中室溫交聯(lián)反應(yīng)4小時；接著，浸入質(zhì)量濃度為10％的硼氫化鈉溶液中保持12小時，然后再在濃度為10mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡2天，期間每隔5小時換一次磷酸鹽緩沖液，最后經(jīng)冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，硼氫化鈉的摩爾數(shù)是二元醛摩爾數(shù)的10倍，二元醛溶液中二元醛的質(zhì)量為L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物質(zhì)量的20％，二元醛為己二醛，二元醛溶液的質(zhì)量濃度為10％。

本實施例制得的水凝膠的壓縮模量為10kPa。

實施例4

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到混合物，然后將該混合物煮沸4小時，熱過濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為3:1；混合物中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為0.5％：

2)配制質(zhì)量濃度為1％的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后利用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌60小時，得到溶液；N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.99倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的5倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.2倍；其中，透明質(zhì)酸分子量為1000kDa。

3)向步驟2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，攪拌下緩慢加入步驟2)到溶液2倍體積量的無水乙醇中，加入過程中出現(xiàn)沉淀，收集沉淀物，再將所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的5倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1.5:1，接著，將溶液B加入到溶液A中，磁力攪拌35小時后過濾去除固體，水相用溶液B洗至無色，采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物。

4)將L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物溶于水中形成質(zhì)量濃度為10％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通過磁力攪拌10分鐘，混合均勻后，轉(zhuǎn)移至模具中室溫交聯(lián)反應(yīng)0.5小時；接著，浸入質(zhì)量濃度為3％的硼氫化鈉溶液中保持20小時，然后再在濃度為10mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡3天，期間每隔4小時換一次磷酸鹽緩沖液，最后經(jīng)冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，硼氫化鈉的摩爾數(shù)是二元醛摩爾數(shù)的3倍，二元醛溶液中二元醛的質(zhì)量為L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物質(zhì)量的5％，二元醛為己二醛，二元醛溶液的質(zhì)量濃度為20％。

實施例5

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到混合物，然后將該混合物煮沸2小時，熱過濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為4:1；混合物中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為6％：

2)配制質(zhì)量濃度為2％的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后利用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌30小時，得到溶液；N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.7倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的8倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.9倍；其中，透明質(zhì)酸分子量為3000kDa。

3)向步驟2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，攪拌下緩慢加入步驟2)到溶液2倍體積量的無水乙醇中，加入過程中出現(xiàn)沉淀，收集沉淀物，再將所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的4倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1:1，接著，將溶液B加入到溶液A中，磁力攪拌48小時后過濾去除固體，水相用溶液B洗至無色，采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性的透明質(zhì)酸衍生物。

4)將L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物溶于水中形成質(zhì)量濃度為7％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通過磁力攪拌15分鐘，混合均勻后，轉(zhuǎn)移至模具中室溫交聯(lián)反應(yīng)3小時；接著，浸入質(zhì)量濃度為7％的硼氫化鈉溶液中保持30小時，然后再在濃度為10mmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡1.5天，期間每隔3小時換一次磷酸鹽緩沖液，最后經(jīng)冷凍干燥，具體先在零下20℃保持72小時、20℃保持4小時，得到L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，硼氫化鈉的摩爾數(shù)是二元醛摩爾數(shù)的8倍，二元醛溶液中二元醛的質(zhì)量為L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸衍生物質(zhì)量的12％，二元醛為己二醛，二元醛溶液的質(zhì)量濃度為1％。

本發(fā)明用L-賴氨酸來改性透明質(zhì)酸，并用這種透明質(zhì)酸衍生物與二元醛交聯(lián)形成水凝膠，并通過硼氫化鈉還原交聯(lián)化學(xué)鍵希夫堿來解決二元醛的毒性問題，使水凝膠中席夫堿的碳氮雙鍵變成碳氮單鍵，從而具有更好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。該水凝膠力學(xué)性能優(yōu)異、彈性好、吸水率大，主要成分為生物相容性好的透明質(zhì)酸和L-賴氨酸，在3D腫瘤模型、細(xì)胞/藥物遞送、組織再生修復(fù)、創(chuàng)傷敷料等方面可發(fā)揮重要作用。