本發(fā)明涉及中醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種虎杖生物活性成分的提取方法。
背景技術(shù)：
：虎杖是一種傳統(tǒng)中藥，味微苦、澀、性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效，主治關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸經(jīng)閉等多種疾??；經(jīng)現(xiàn)代藥化、藥理學(xué)研究虎杖含有大量的生物活性成分，主要有芪三酚類(虎杖甙及白藜蘆醇)、蒽醌類(大黃素等)。白藜蘆醇是一種活性多酚類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化、延緩衰老、清除自由基的作用，對癌變及細(xì)胞組織變異具有很強(qiáng)的抑制作用，是紫杉醇后又一綠色抗癌防癌活性物質(zhì)。而且白藜蘆醇具有預(yù)防動脈硬化、冠心病及清除血液、肝臟脂肪的作用；虎杖甙是白藜蘆醇的配糖化合物，虎杖甙可以在生物酶的作用下水解為白藜蘆醇和葡萄糖分子，在虎杖植物內(nèi)主要以更加穩(wěn)定的虎杖甙形式存在于虎杖細(xì)胞內(nèi)，一般虎杖甙含量是游離虎杖甙元的兩倍多，虎杖甙具有強(qiáng)心作用、改善微循環(huán)、抑制過氧化物在血管和肝臟堆積而起到護(hù)肝和保護(hù)血管作用等等；大黃素是虎杖的代表性鑒別物質(zhì)，具有顯著的抗菌活性、有強(qiáng)力瀉下作用而改善便秘癥狀、還有降血壓、護(hù)肝、改善微循環(huán)的作用等等；所以虎杖是一種利用價(jià)值很高的中藥材，很值得大力開發(fā)利用。我國地區(qū)海拔2500米以下的陰暗潮濕之地都是虎杖的分布區(qū)域，從南到北廣泛分布，以湖南湖北為主產(chǎn)區(qū)，而且質(zhì)量最優(yōu)，而且大量野生虎杖資源自生自滅從未加以利用，而且虎杖采集方便成片生長，在我國有開發(fā)的廣闊前景?；⒄茸鳛閭鹘y(tǒng)中藥，我國很早就有比較充分的認(rèn)識，經(jīng)過幾十年現(xiàn)代藥化藥理研究，特別是虎杖提取物研究開發(fā)以來，首先從虎杖提取物以大黃素為標(biāo)志性成分到目前經(jīng)發(fā)酵提取白藜蘆醇到現(xiàn)在分離提純虎杖甙再發(fā)酵制備白藜蘆醇等，但是到目前為止還沒有綜合利用純化的工藝。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是如何綜合利用虎杖，而提供一種虎杖生物活性成分的提取方法。(二)技術(shù)方案為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種虎杖生物活性成分的提取方法(所用原料均市購得到)，該方法包括如下步驟：步驟一：準(zhǔn)備：稱取虎杖，粉碎，過18-22目篩，投入到回流罐中；步驟二：回流：加入虎杖重量6-10倍的75-85％的酒精，用1％KOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5-9.5，在55-65℃溫度下回流2.5-3.5小時(shí)；步驟三：二次回流：加入虎杖重量5-7倍的75-85％的酒精，用1％KOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5-9.5，在55-65℃溫度下回流1.5-2.5小時(shí)；步驟四：過濾：合并兩次回流液體，用HCl中和至pH值為6.5-7.0，加入飽和硫酸銨至產(chǎn)生沉淀，過濾除去沉淀；步驟五：回收酒精：從濾液中回收酒精至酒精含量為15％以下，得到醇提液；步驟六：濃縮：將酒精含量為15％以下的醇提液濃縮至比重為1.0-1.5，得到濃縮浸膏；步驟七：水沉：將濃縮浸膏用4-6倍重量的80-90℃的熱水充分?jǐn)嚢枞芙猓?.5-1.5小時(shí)后迅速高速離心過濾，除去水不溶性成分取上清液；步驟八：再濃縮：將步驟七得到的上清液濃縮至比重為1.0-1.5，得到濃縮浸膏；步驟九：再醇溶：將步驟八得到的濃縮浸膏用4-6倍重量的濃度75-85％的酒精溶解過夜，高速離心分離醇不溶沉淀，取上清液；步驟十：超濾：將從驟九得到的上清液中回收酒精至酒精含量小于15％，將上清液用磺化聚醚砜(SPES)平板超濾，收集超濾液，用水稀釋超濾液至酒精濃度為50％，看到絮狀物，冷凍過夜，收集沉淀和上清液；步驟十一：分離純化大黃素：將步驟十得到的沉淀加到5％碳酸鈉溶液中，再加入乙醚均勻混合，靜置后分為乙醚層和堿液層，取堿液層酸化沉淀，將酸化沉淀物用丙酮重結(jié)晶，得到橙色針狀結(jié)晶大黃素，其純度為99.8％；步驟十二：分離上清液：對步驟十得到的上清液用大孔樹脂吸附，分別洗脫收集40％酒精溶液的洗脫液和80％酒精溶液的洗脫液；步驟十三：分離純化虎杖甙：將步驟十二得到的40％酒精洗脫液蒸發(fā)至無酒精味，用5倍純水稀釋，用重量濃度為5％的Na2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5-9.5，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓缓蟾咚匐x心過濾得上清液，將該上清液用鹽酸酸化至pH4.5-5.5，過夜冷藏，然后離心分離收集沉淀，對得到的沉淀用冷純水洗滌4-6次，再用乙醚充分洗滌1-3次，然后將沉淀用該沉淀10倍重量80％的酒精一起加熱溶解，冷卻后高速離心沉淀得到上清液，將上清液稀釋至酒精濃度15％以下，酸化高速離心收集沉淀，對沉淀水洗4-6次，乙醚洗滌1-3次，真空干燥，得到無色針狀結(jié)晶的虎杖甙，其純?yōu)?9.5％以上；步驟十四：分離純化白藜蘆醇：將步驟十二得到的80％酒精洗脫液蒸發(fā)至酒精含量15％以下，5倍重量純水稀釋，用1％的KOH水溶液調(diào)節(jié)pH至10.5-11.5，完全溶解，然后離心過濾得上清液，將該上清液用鹽酸酸化至pH5.0-6.0，冷藏過夜，收集沉淀，對沉淀用純水洗滌4-6次，乙醚洗滌1-3次，再用1％的KOH水溶液調(diào)節(jié)pH至10.5-11.5，攪拌至完全溶解，再用鹽酸酸化至pH5.0-6.0，冷藏過夜沉淀，將所得沉淀用純水洗滌2次，乙醚洗滌2次，真空干燥，得到白色針狀結(jié)晶的白藜蘆醇，其純度為99.2％。優(yōu)選地，在步驟一中，所述的篩為20目。優(yōu)選地，在步驟二和步驟三中，所述的回流溫度為60℃。優(yōu)選地，在步驟六和步驟八中所述的比重為1.15-1.20。優(yōu)選地，在步驟七中：所述的水沉溫度為85℃。優(yōu)選地，在步驟十二中：所采用的大孔樹脂為弱極性D101大孔樹脂。優(yōu)選地，上述方法包括如下步驟：步驟一：準(zhǔn)備：稱取虎杖，粉碎，過20目篩，投入到回流罐中；步驟二：回流：加入虎杖重量8倍的濃度80％的酒精，用1％KOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0，在60℃溫度下回流3小時(shí)；步驟三：二次回流：加入虎杖重量6倍的濃度80％的酒精，用1％KOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0，在60℃溫度下回流2小時(shí)；步驟四：過濾：合并兩次回流液體，用HCl中和至pH值為6.5-7.0，加入飽和硫酸銨至產(chǎn)生沉淀，過濾除去沉淀；步驟五：回收酒精：從濾液中回收酒精至酒精含量為15％以下，得到醇提液；步驟六：濃縮：將酒精含量為15％以下的醇提液濃縮至比重為1.2，得到濃縮浸膏；步驟七：水沉：將濃縮浸膏用5倍重量的90℃的熱水充分?jǐn)嚢枞芙?，保?.0小時(shí)后迅速高速離心過濾，除去水不溶性成分取上清液；步驟八：再濃縮：將步驟七得到的上清液濃縮至比重為1.2，得到濃縮浸膏；步驟九：再醇溶：將步驟八得到的濃縮浸膏用5倍重量的重量濃度80％的酒精溶解過夜，高速離心分離醇不溶沉淀，取上清液；步驟十：超濾：將從步驟九得到的上清液中回收酒精至酒精含量小于15％，將上清液用磺化聚醚砜平板超濾，收集超濾液，用水稀釋超濾液至酒精濃度為50％，看到絮狀物，冷凍過夜，收集沉淀和上清液；步驟十一：分離純化大黃素：將步驟十得到的沉淀加到5％碳酸鈉溶液中，再加入乙醚均勻混合，靜置后分為乙醚層和堿液層，取堿液層酸化沉淀，將酸化沉淀物用丙酮重結(jié)晶，得到橙色針狀結(jié)晶大黃素，其純度為99.8％；步驟十二：分離上清液：對步驟十得到的上清液用弱極性D101大孔樹脂吸附，分別洗脫收集40％酒精溶液的洗脫液和80％酒精溶液的洗脫液；步驟十三：分離純化虎杖甙：將步驟十二得到的40％酒精洗脫液蒸發(fā)至酒精含量15％以下，用5倍純水稀釋，用5％的Na2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，然后高速離心過濾得上清液，將該上清液用鹽酸酸化至pH5.0，過夜冷藏，然后離心分離收集沉淀，對得到的沉淀用冷純水洗滌5次，再用乙醚充分洗滌2次，然后將沉淀用10倍重量80％的酒精加熱溶解，冷卻后高速離心沉淀得到上清液，將上清液稀釋至酒精濃度為15％以下，酸化高速離心收集沉淀，對沉淀水洗5次，乙醚洗滌2次，真空干燥，得到無色針狀結(jié)晶的虎杖甙，其純?yōu)?9.5％以上；步驟十四：分離純化白藜蘆醇：將步驟十二得到的80％酒精洗脫液蒸發(fā)至酒精含量15％以下，5倍純水稀釋，用1％的KOH水溶液調(diào)節(jié)pH至11.0，完全溶解，然后離心過濾得上清液，將該上清液用鹽酸酸化至pH5.5，冷藏過夜，收集沉淀，對沉淀用純水洗滌5次，乙醚洗滌2次，再用1％的KOH水溶液調(diào)節(jié)pH至11.0，攪拌至完全溶解，再用鹽酸酸化至pH5.5，冷藏過夜沉淀，將所得沉淀用純水洗滌2次，乙醚洗滌2次，真空干燥，得到白色針狀結(jié)晶的白藜蘆醇，其純度為99.2％。(三)有益效果本發(fā)明方法所采用設(shè)備簡單，工藝簡單可行，便于工業(yè)化生產(chǎn)；所用溶劑無毒無殘留，不產(chǎn)生環(huán)境污染，后期洗滌結(jié)晶用的有機(jī)溶劑使用量小；本發(fā)明虎杖綜合利用高，所得回收率都在95％以上，所得大黃素、虎杖甙、白藜蘆醇純度很高，可直接用于藥品工業(yè)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不能用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所使用的溶劑、KOH、HCl、Na2SO4、乙醚、丙酮均為食用級或者分析純，不得使用工業(yè)級。實(shí)施例1：本實(shí)施例提取虎杖生物活性成分方法的步驟如下：1，取虎杖(干)500KG，(HPLC檢測含有大黃素0.61％、虎杖甙2.47％、白藜蘆醇0.72％)，粉碎過20目篩，投入回流提取罐；2)第一次回流提取：4000公斤80％酒精，1％KOH調(diào)節(jié)PH至9.0，溫度控制在60度，回流3小時(shí)；3)第二次回流：3000公斤80％酒精，1％KOH調(diào)節(jié)PH至9.0，溫度控制在60度，回流2小時(shí)；4)合并回流液并中和：合并兩次回流液體，用HCl中和至pH6.5-7.0，加入飽和硫酸銨，過濾除去沉淀；5)酒精回收：過濾后的提取液回收酒精至酒精含量15％以下得回收液2700公斤；6)濃縮：對回收酒精含量15％以下的醇提液濃縮至比重1.2得濃縮浸膏126公斤；7)水沉：濃縮的浸膏用620公斤的90度熱水充分?jǐn)嚢枞芙猓匾恍r(shí)后迅速高速離心過濾，除去水不溶性成分取上清液596公斤；8)再濃縮：步驟7)之上清液濃縮至比重1.2得浸膏74公斤；9)再醇溶：步驟8)的濃縮浸膏用370公斤80％酒精溶解過夜，高速離心分離醇不溶沉淀，取上清液421公斤；10)超濾：步驟9)之上清液回收酒精至酒精含量小于15％，該上清液用SPES平板超濾，收集超濾液，用水稀釋超濾液至酒精濃度為50％，看到絮狀物，冷庫冷凍過夜，收集沉淀(1)3.6公斤和上清液(11)97公斤；11)沉淀(1)的分離純化：沉淀(1)進(jìn)行分離純化，大黃素和別的醌類化合物不一樣，大黃素可以溶于5％碳酸鈉溶液，加入乙醚混合，除去雜質(zhì)游離雜質(zhì)醌，靜置后乙醚層和堿液層分開，取堿液層酸化沉淀(沉淀2)，取酸化沉淀物用丙酮重結(jié)晶，可得橙色針狀結(jié)晶大黃素純品2.61公斤，經(jīng)分析可達(dá)99.8％。12)上清液(11)的分離：對上清液(11)用大孔樹脂吸附虎杖甙及甙元后，收集40％酒精溶液的洗脫液(22)和80％酒精溶液洗脫液(33)，甙元極性較小都收集在80％洗脫液(33)中，虎杖甙極性較大洗脫較慢都收集在40％酒精洗脫液(22)中。13)步驟12)所得40％洗脫液(22)的分離純化：40％洗脫液(22)蒸發(fā)酒精至含酒精15％以下，用5倍純水稀釋，用5％Na2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0完全溶解充分?jǐn)嚢韬蟾咚匐x心過濾得上清液(221)，上清液用鹽酸酸化至pH5.0過夜冷藏后離心分離收集沉淀(222)，對沉淀(222)用冷純水洗滌5次，用乙醚充分洗滌2次得沉淀(223)，對沉淀(223)用10倍80％加熱溶解，冷卻高速離心沉淀得上清液，稀釋上清液酒精至酒精濃度15％以下酸化高速離心收集沉淀得沉淀(224),對沉淀水洗5次，乙醚洗滌2次真空干燥得到無色針狀結(jié)晶的10.70公斤虎杖甙純品(99.5％)；14)步驟12)所得80％洗脫液(33)分離純化：80％酒精洗脫液(33)蒸發(fā)酒精至酒精含量15％以下，5倍純水稀釋，用1％KOH調(diào)節(jié)pH至11.0完全溶解離心過濾得上清液(331)，對上清液(331)用鹽酸酸化至pH5.5，沉淀冷藏過夜收集沉淀(332)用純水洗滌5次乙醚充分洗滌2次得沉淀(333)，沉淀(333)再用5倍純水及1％KOH調(diào)節(jié)pH至11.0，攪拌溶解至完全溶解，再用鹽酸酸化pH5.5冷藏過夜沉淀所得沉淀用純水洗滌2次，乙醚洗滌兩次，真空干燥得白色針狀結(jié)晶為3.36公斤白藜蘆醇純品(99.2％)。實(shí)施例2：本實(shí)施例提取虎杖生物活性成分方法的步驟如下：1，取虎杖(干)500KG，(HPLC檢測含有大黃素0.63％、虎杖甙2.41％、白藜蘆醇0.75％)，粉碎過20目篩，投入回流提取罐；2)第一次回流提?。?000公斤80％酒精1％KOH調(diào)節(jié)pH9.0，溫度控制在60度回流3小時(shí)；3)第二次回流：3000公斤80％酒精，1％KOH調(diào)節(jié)pH9.0，溫度控制在60度，回流2小時(shí)；4)合并回流液并中和：合并兩次回流液體，用HCl中和至pH6.5-7.0，加入飽和硫酸銨，過濾除去沉淀；5)酒精回收：過濾后的提取液回收酒精至酒精含量15％以下得回收液2810公斤；6)濃縮：對回收酒精含量15％以下至醇提液濃縮至比重1.2得濃縮浸膏131公斤；7)水沉：濃縮的浸膏用650公斤的90度熱水充分?jǐn)嚢枞芙?，保溫一小時(shí)后迅速高速離心過濾，除去水不溶性成分取上清液670公斤；8)再濃縮：步驟7)之上清液濃縮至比重1.2得浸膏82公斤；9)再醇溶：步驟8)的濃縮浸膏用410公斤80％酒精溶解過夜，高速離心分離醇不溶沉淀，取上清液430公斤；10)超濾：步驟9)之上清液回收酒精至酒精含量小于15％，該上清液用SPES平板超濾，收集超濾液，用水稀釋超濾液至酒精度為50％，看到絮狀物，冷庫冷凍過夜，收集沉淀(1)4.1公斤和上清液(11)101公斤；11)沉淀(1)的分離純化：沉淀(1)進(jìn)行分離純化，大黃素和別的醌類化合物不一樣，大黃素可以溶于5％碳酸鈉溶液，加入乙醚混合，除去雜質(zhì)游離雜質(zhì)醌，靜置后乙醚層和堿液層分開，取堿液層酸化沉淀(沉淀2)，取酸化沉淀物用丙酮重結(jié)晶，可得橙色針狀結(jié)晶大黃素純品2.78公斤，經(jīng)分析可達(dá)99.6％。12)上清液(11)的分離：對上清液(11)用大孔樹脂吸附虎杖甙及甙元后，收集40％酒精溶液的洗脫液(22)和80％酒精溶液洗脫液(33)，甙元極性較小都收集在80％洗脫液(33)中，虎杖甙極性較大洗脫較慢都收集在40％酒精洗脫液(22)中。13)步驟12)所得40％洗脫液(22)的分離純化：40％洗脫液(22)蒸發(fā)酒精至含酒精含量15％以下，用5倍純水稀釋，用5％Na2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0完全溶解充分?jǐn)嚢韬蟾咚匐x心過濾得上清液(221)，上清液用鹽酸酸化至pH5.0過夜冷藏后離心分離收集沉淀(222)，對沉淀(222)用冷純水洗滌5次，用乙醚充分洗滌2次得沉淀(223)，對沉淀(223)用10倍80％加熱溶解，冷卻高速離心沉淀得上清液，上清液酒精稀釋至酒精濃度15％以下酸化高速離心收集沉淀得沉淀(224),對沉淀水洗5次，乙醚洗滌2次真空干燥得到無色針狀結(jié)晶的9.96公斤虎杖甙純品(99.6％)；14)步驟12)所得80％洗脫液(33)分離純化：80％酒精洗脫液(33)蒸發(fā)酒精至酒精含量15％以下，5倍純水稀釋，用KOH調(diào)節(jié)pH至11.0完全溶解離心過濾得上清液(331)，對上清液(331)用鹽酸酸化至pH5.5，沉淀冷藏過夜收集沉淀(332)用純水洗滌5次乙醚充分洗滌2次得沉淀(333)，沉淀(333)再用5倍純水，1％KOH調(diào)節(jié)pH至11.0，攪拌溶解至完全溶解，再用鹽酸酸化pH5.5冷藏過夜沉淀所得沉淀用純水洗滌2次，乙醚洗滌兩次，真空干燥得白色針狀結(jié)晶為3.44公斤白藜蘆醇純品(99.5％)。實(shí)施例3:本實(shí)施例提取虎杖生物活性成分方法的步驟如下：1，取虎杖(干)500KG，(HPLC檢測含有大黃素0.60％、虎杖甙2.44％、白藜蘆醇0.69％)，粉碎過20目篩，投入回流提取罐；2)第一次回流提取：4000公斤80％酒精1％KOH調(diào)節(jié)PH9.0，溫度控制在60度回流3小時(shí)；3)第二次回流：3000公斤80％酒精，1％KOH調(diào)節(jié)PH至9.0，溫度控制在60度，回流2小時(shí)；4)合并回流液并中和：合并兩次回流液體，用HCl中和至pH6.5-7.0，加入飽和硫酸銨，過濾除去沉淀；5)酒精回收：過濾后的提取液回收酒精至酒精含量15％以下得回收液2600公斤；6)濃縮：對回收酒精含量15％以下至醇提液濃縮至比重1.2得濃縮浸膏120公斤；7)水沉：濃縮的浸膏用600公斤的90度熱水充分?jǐn)嚢枞芙?，保溫一小時(shí)后迅速高速離心過濾，除去水不溶性成分取上清液550公斤；8)再濃縮：步驟7)之上清液濃縮至比重1.2得浸膏69公斤；9)再醇溶：步驟8)的濃縮浸膏用370公斤80％酒精溶解過夜，高速離心分離醇不溶沉淀，取上清液408公斤；10)超濾：步驟9)之上清液回收酒精至酒精含量小于15％，該上清液用SPES平板超濾，收集超濾液，用水稀釋超濾液至酒精度為50％，看到絮狀物，冷庫冷凍過夜，收集沉淀(1)3.5公斤和上清液(11)96公斤；11)沉淀(1)的分離純化：沉淀(1)進(jìn)行分離純化，大黃素和別的醌類化合物不一樣，大黃素可以溶于5％碳酸鈉溶液，加入乙醚混合，除去雜質(zhì)游離雜質(zhì)醌，靜置后乙醚層和堿液層分開，取堿液層酸化沉淀(沉淀2)，取酸化沉淀物用丙酮重結(jié)晶，可得橙色針狀結(jié)晶大黃素純品2.59公斤，經(jīng)分析可達(dá)99.8％。12)上清液(11)的分離：對上清液(11)用大孔樹脂吸附虎杖甙及甙元后，收集40％酒精溶液的洗脫液(22)和80％酒精溶液洗脫液(33)，甙元極性較小都收集在80％洗脫液(33)中，虎杖甙極性較大洗脫較慢都收集在40％酒精洗脫液(22)中。13)步驟12)所得40％洗脫液(22)的分離純化：40％洗脫液(22)蒸發(fā)酒精至含酒精含量15％以下，用5倍純水稀釋，用5％Na2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0完全溶解充分?jǐn)嚢韬蟾咚匐x心過濾得上清液(221)，上清液用鹽酸酸化至p5.0過夜冷藏后離心分離收集沉淀(222)，對沉淀(222)用冷純水洗滌5次，用乙醚充分洗滌2次得沉淀(223)，對沉淀(223)用10倍80％加熱溶解，冷卻高速離心沉淀得上清液，上清液酒精稀釋至酒精濃度15％以下酸化高速離心收集沉淀得沉淀(224),對沉淀水洗5次，乙醚洗滌2次真空干燥得到無色針狀結(jié)晶的9.77公斤虎杖甙純品(99.6％)；14)步驟12)所得80％洗脫液(33)分離純化：80％酒精洗脫液(33)蒸發(fā)酒精至酒精含量15％以下，5倍純水稀釋，用KOH調(diào)節(jié)PH至11.0完全溶解離心過濾得上清液(331)，對上清液(331)用鹽酸酸化至pH5.5，沉淀冷藏過夜收集沉淀(332)用純水洗滌5次乙醚充分洗滌2次得沉淀(333)，沉淀(333)再用5倍純水，1％KOH調(diào)節(jié)pH至11.0，攪拌溶解至完全溶解，再用鹽酸酸化pH5.5冷藏過夜沉淀所得沉淀用純水洗滌2次，乙醚洗滌兩次，真空干燥得白色針狀結(jié)晶為3.18公斤白藜蘆醇純品(99.5％)。對比例1:采用的虎杖甙的提取純化工藝為：虎杖打細(xì)粉，80％酒精40度回流提取2次，每次3小時(shí)，得初提物，對初提物用聚酰胺富集、氧化鋁除雜、活性炭脫色、結(jié)晶得98％虎杖甙1.26％。具體工藝為：500公斤虎杖粗粉，用10倍80％酒精在40度溫度下回流2次，每次3小時(shí)，合并兩次回流酒精液體1650公斤，真空濃縮至無酒精味道得濃縮液170公斤，加入750公斤純水充分?jǐn)嚢瑁缓蟾咚匐x心分離沉淀得上清液640公斤，過大孔樹脂后，先用純水將雜質(zhì)洗至樹脂無色，再用70％酒精洗脫，收集洗脫液，濃縮至比重1.2得到虎杖甙粗提物浸膏20.11公斤，浸膏用3倍90％酒精充分?jǐn)嚢枞芙膺^中性氧化鋁柱層析，收集90％酒精洗脫液得洗脫液得洗脫液66.8公斤，66.8公斤洗脫液用活性炭脫色得清亮液體49.6公斤，回收酒精濃縮至無酒精味道浸膏22.36公斤，加入50％乙醇加熱充分溶解，冷卻，冷庫過夜，高速離心分離結(jié)晶得沉淀6.29公斤虎杖甙。該方法過程多，過程中吸附材料使用也多，得率較低。對比例2：采用的分離提純工藝為傳統(tǒng)發(fā)酵法：對虎杖粗粉加入4倍水和40/1000的纖維素酶35-40度PH7.5左右發(fā)酵48小時(shí)然后溶劑法提取白藜蘆醇、大黃素及虎杖甙，然后分離純化。具體工藝為：500公斤虎杖粗粉加入2000公斤純水用碳酸鈉調(diào)節(jié)PH至7.2加入20公斤纖維素酶(酶先與水充分?jǐn)嚢柙偌尤牖⒄却址刍旌暇鶆颍?5-40度發(fā)酵48小時(shí)，加如90％酒精大約6000公斤，讓酒精度達(dá)到至少75％以上不要高于80％，60度回流3小時(shí)提取2次，合并濾液并濃縮至無酒精味道加入調(diào)節(jié)好PH9.0的純水充分溶解高速離心沉淀，除去沉淀得上清液，過大孔樹脂，收集洗脫液30％酒精洗脫液為大黃素、50％酒精洗脫液為虎杖甙、80％洗脫液為白藜蘆醇，三個(gè)洗脫液用酒精結(jié)晶，分別得到大黃素3.26公斤，白藜蘆醇12.7公斤、虎杖甙1.1公斤。結(jié)果顯示該方法與本申請方法比較收得率明顯偏低，經(jīng)分析產(chǎn)品純度與本申請方法相差明顯，所使用大孔樹脂投資較大，不利于推廣。實(shí)驗(yàn)例1：大黃素、虎杖甙、白藜蘆醇含量測定(范玲、嚴(yán)冬等南京中醫(yī)藥科大學(xué)，中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志2013年4月)1，儀器試劑Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站(Waters公司)，Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，Agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)，AgilentChemStation工作站；AgilentEclipseC18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，AgilentExtendC18(4.6mm×250mm，5μm)，HederaC18(4.6mm×250mm，5μm)，SunfireC18(4.6mm×250mm，5μm)，HypersilC18(4.6mm×250mm，5μm)、DiscoveryC18(4.6mm×250mm，5μm)，BP-211D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)，KQ-1000型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)?；⒄溶?批號110509，含量＞98％)，白藜蘆醇(批號110609，含量＞98％)兩者均購自四川維克奇生物科技有限公司。大黃素(批號100756-200211，含量＞98％)購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。2，原理：某一典型組分(有對照品供應(yīng)者)為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子，通過校正因子計(jì)算其他組分的含量fkm＝fk/fm＝Wk×Am/Wm×Ak(1)Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度；Am為其他組分m峰面積，Wm為其他組分m濃度。3，色譜條件色譜條件Hypercil-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)(洗脫程序見表1)，柱溫30℃，流速1.0mL·min－1，檢測波長采用306nm，280nm程序控制改變波長；理論塔板數(shù)以大黃素計(jì)不低于3000，上述色譜條件下，各組分分離度良好。4，對照樣品制備對照品溶液制備取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度分別為64.50，11.34，26.75，7.74mg·L－1的混合對照品溶液。5，供試樣品制備供試品溶液的制備取虎杖飲片粉末(過80目篩)0.1g，精密稱定，置于100mL錐形瓶，精密加入25mL甲醇，稱重，超聲40min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。6，線性關(guān)系線性關(guān)系精密吸取上述混合對照品溶液2，3，5，8，10，15，20μL進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量對峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，分別得虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的回歸方程見表2，各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性良好。3種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)確定大黃素、虎杖甙、白藜蘆醇得含量。表1：檢測結(jié)果樣品大黃素虎杖甙白藜蘆醇實(shí)施例199.8％99.5％99.2％實(shí)施例299.6％99.6％99.5％實(shí)施例399.8％99.6％99.5％對比例198.7％對比例293.2％93.7％94.3％以上實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限制。盡管參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行各種組合、修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3