技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫治療領(lǐng)域，尤其是免疫細胞體外擴增的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：免疫療法作為一類新型抗癌療法，和傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療構(gòu)成了治療癌癥的四大支柱。在免疫療法里，細胞免疫療法更是體現(xiàn)出極大的發(fā)展?jié)摿?。根?jù)所采用的免疫細胞，細胞免疫療法可分為兩大類型。一類采用非特異性的免疫細胞，比如NK細胞和CIK（CD3+CD56+）細胞，這兩種細胞殺傷癌細胞是非MHC限制性的，所識別的癌細胞表面靶點不是由MHC所呈遞出的抗原片段，而是NKG2D、DNAM-1、NKp30這類NK細胞所識別的靶點（PievaniA,BorleriG,etal.Blood.2011,118(12):3301-3310）。另一類療法采用特異性的免疫細胞，比如嵌合抗原受體修飾的T細胞，TCR修飾的T細胞，或者由腫瘤組織里分離出的TIL進一步在體外擴增，以及由外周血直接在體外與抗原呈遞細胞共培養(yǎng)擴增出的針對特定抗原的特異性T細胞（StraathofKC,BollardCM,etal.Blood.2005，105(5):1898-1904），后兩類擴增方法培養(yǎng)出的免疫細胞通過識別由MHC所呈遞出來的特定抗原而殺傷癌細胞。雖然利用特異性或非特異性的免疫療法治療癌癥都取得了一定療效（LeeJH,LeeJH，etal.Gastroenterology.2015,148(7):1383-1391.ChiaWK,TeoM,etal.MolTher.2014,22(1):132-139），但由于癌組織里癌細胞的異質(zhì)性，即不同的癌細胞在其細胞表明表達的特異性分子不同，單獨采用非特異性或特異性的細胞免疫療法很容易因腫瘤細胞的免疫逃逸而使治療失效（GarridoF,AptsiauriN,etal.CurrOpinImmunol.2016,39:44-51)。如果所用的免疫細胞同時具有非特異性及特異性的殺傷能力，則將有效降低因?qū)Π┘毎R別范圍不足所導(dǎo)致的免疫逃逸。采用目前常規(guī)方法培養(yǎng)出的抗原特異性T細胞存在增殖能力低下的問題：每輪7天與抗原呈遞細胞共培養(yǎng)后T細胞的擴增倍數(shù)不到4倍（RamosCA,NaralaN,etal.JImmunother.2013，36(1):66–76），要達到治療所需的幾十億的回輸細胞數(shù)目，需要經(jīng)過多達5輪的共刺激培養(yǎng)，耗時超過1個月。另一方面，常規(guī)方法培養(yǎng)出的特異性T細胞在經(jīng)過長時間的體外培養(yǎng)后，細胞表面大量表達PD-1。這些T細胞在回輸入患者體內(nèi)后，其活性會被患者的癌細胞表面的PD-L1所抑制，從而降低其療效（WeiF,ZhongS,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2013,110(27):E2480-2489）。本發(fā)明所述的抗原特異性T細胞培養(yǎng)方法克服了常規(guī)培養(yǎng)方法的局限，細胞增殖速度可達每7天20倍，培養(yǎng)出的T細胞表面只表達極低的PD-1，但大量表達CD56，同時具有對癌細胞特異性及非特異性殺傷力。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服目前常規(guī)方法培養(yǎng)出的抗原特異性T細胞對癌細胞識別范圍不夠廣、增殖緩慢、大量表達PD-1分子的缺點，本發(fā)明提供一種抗原特異性T細胞的高效制備方法，所培養(yǎng)出的T細胞大量表達CD56，既保持了對具備抗原呈遞能力的癌細胞的殺傷力，還兼有非MHC限制性殺傷力。本發(fā)明的技術(shù)方案是：(1)通過大幅提高抗原呈遞細胞對抗原特異性T細胞的比例，充分激活T細胞的TCR／MHC-抗原肽及共刺激途徑，從而提高T細胞增殖速度，促進T細胞表達NK細胞類的受體；(2)在培養(yǎng)基里加入高濃度的IL-15，以抵消T細胞被激活后所分泌的IL-2的AICD（活化誘導(dǎo)的細胞死亡）效應(yīng)（WaldmannT.ArthritisRes.2002，4(Suppl3):S161–S167），以進一步提高細胞增殖速度，降低PD-1的表達。(3)控制每一輪共培養(yǎng)的時間，避免因培養(yǎng)時間過長導(dǎo)致抗原呈遞細胞數(shù)目不足的問題。本發(fā)明的培養(yǎng)方法如圖1所示，具體包括以下步驟：(1)將分離出的外周血單個核細胞（PBMC）與抗原呈遞細胞以10:1至40:1的比例共培養(yǎng)，抗原呈遞細胞可為表達并呈遞EB病毒抗原的B淋巴母細胞（LCL），也可為已負載抗原的DC細胞，gamma-deltaT細胞，或被CD40L（CD154）激活的B細胞，這些細胞都為專職抗原呈遞細胞。此次共培養(yǎng)時間為8-12天，目的是為了激活并富集針對特定抗原的特異性T細胞，只用少量抗原呈細胞是為了避免非特異性的細胞如NK細胞的擴增。(2)將上述富集過的抗原特異性T細胞與抗原呈遞細胞以1:2至1:6的比例共培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基里加入終濃度為30ng/ml至120ng/ml的IL-15。所用的抗原呈遞細胞可為B淋巴母細胞，也可為已負載抗原的gamma-deltaT細胞，或被CD40L激活的B細胞，抗原呈遞細胞在共培養(yǎng)前可用40-80Gy的伽馬射線輻照處理。此次共培養(yǎng)時間為6-8天,超過這天數(shù)后細胞增殖速度會下降。(3)重復(fù)步驟2進一步擴增T細胞，直至達到所需的細胞數(shù)目。本發(fā)明的有益效果是：抗原特異性T細胞增殖速度快，步驟簡單，不需要繁瑣的磁珠分離純化步驟。所得的抗原特異性T細胞PD-1表達量低，但大量表達CD56，同時具有特異性及非特異性殺傷力，能有效殺傷通過MHC在細胞表面呈遞抗原的腫瘤細胞，也具有非MHC限制性的殺傷力，殺傷不表達MHC的腫瘤細胞。附圖說明圖1是本發(fā)明的細胞制備流程圖。圖2是EB病毒特異性T細胞對LCL細胞的殺傷活力圖。圖3是EB病毒特異性T細胞對K562細胞的殺傷活力圖。圖4是LMP2特異性T細胞對負載了LMP2的PHA細胞及K562細胞的殺傷活力圖。圖5是WT-1特異性T細胞對負載了WT-1的PHA細胞及K562細胞的殺傷活力圖。具體實施方式下面用實例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不以此為限。在下面的具體步驟里未注明具體條件的實驗方法，則按照常規(guī)條件，或制造廠商所建議的條件進行。一、使用本發(fā)明進行具有NK細胞特質(zhì)的EB病毒特異性T細胞的制備。（1）抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴細胞分離液Ficoll-PlaquePlus通過密度梯度離心分離出單個核細胞（PBMC），用PBS洗滌2次后將所得的細胞凍存。（2）取1×106的外周血單個核細胞用EB病毒感染，置于37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4周后，得到由B細胞轉(zhuǎn)化來的B淋巴母細胞系（LCL）。LCL能通過MHC-I在其細胞表面呈遞EB病毒相關(guān)的抗原。另外LCL作為被EB病毒激活的B細胞，與被CD40L激活的B細胞類似，都還在其表面大量表達CD86、4-1BBL（CD137L）等共刺激分子，成為專職抗原呈遞細胞（ZhuF,RamadanG,etal.ClinExpImmunol.2008,151(2):284-96）。當(dāng)LCL與外周血單個核細胞共培養(yǎng)時，其中EB病毒特異性的T細胞將被激活擴增，經(jīng)過幾輪的共培養(yǎng)，擴增所得的細胞即為EB病毒特異性T細胞。（3）將B淋巴母細胞以40Gy的伽馬射線輻照后，與外周血單個核細胞以1:40的比例置于24孔板里開始第一輪12天的共培養(yǎng)。（4）將第一輪富集過的EB病毒特異性T細胞與B淋巴母細胞以不同比例以及不同的細胞因子進行第二輪的共培養(yǎng)（表1），培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)3天后換新鮮的培養(yǎng)基，同時補充細胞因子。表1.不同培養(yǎng)條件下各類免疫細胞的比例。（4）按第二輪共培養(yǎng)的條件再進行一輪的共培養(yǎng)。（5）收集所得的EB病毒特異性T細胞，以臺盼蘭染色法在顯微鏡下檢測并計算出所收獲的總細胞數(shù)。取一部分細胞用流式細胞儀檢測其細胞類型。結(jié)果如表1所示?？梢娤啾扔诔Ｒ?guī)培養(yǎng)方法（T細胞與LCL的比例為4:1），在共培養(yǎng)時使用較多的LCL抗原呈遞細胞（T細胞:LCL為1:3），能將T細胞的增殖速度提高兩倍，同時PD-1表達下降，表達CD56的T細胞比例也有所增加；再進一步將所用的細胞因子由IL-2換為IL-15，細胞增殖速度達到每7天19倍，表達PD-1的T細胞只有1%，超過50%的T細胞同時表達CD56。（6）另取一部份所得的T細胞，以B淋巴母細胞（LCL）作為靶細胞，測試其特異性殺傷活性。檢測殺傷活性所用的試劑盒為PerkinElmer所產(chǎn)的DELFIA細胞毒性檢測試劑盒。結(jié)果如圖2所示，使用常規(guī)培養(yǎng)方法與本發(fā)明的培養(yǎng)方法所培養(yǎng)出的T細胞在同一效靶比下具有類似的特異性殺傷力，當(dāng)效靶比在2:1至40:1時，對LCL的特異性的裂解率都在40%至90%之間。（7）以不表達MHC-I的K562細胞作為靶細胞，使用常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的T細胞只有很低的非特異殺傷活力，即使在效靶高達40:1的情況下，也只有20%的裂解率；但利用本發(fā)明方法所培養(yǎng)出的T細胞，當(dāng)效靶比在2:1至40:1時，對K562的裂解率在50%至90%之間（如圖3所示）。這表明用本發(fā)明培養(yǎng)出的細胞同時具有很強的非MHC限制性殺傷力。（8）為了進一步確定共培養(yǎng)時T細胞與抗原呈遞細胞的最佳比例，將在不同細胞比例下所培養(yǎng)出的T細胞以流式細胞儀檢測其中的CD3+CD56+雙陽性細胞的比例。結(jié)果如表2所示，隨著LCL細胞量的增加，CD56+的T細胞比例也在不斷增加，在比例為1:2時接近50%，1:4時到最高53％，再增加至1:6也依舊接近50%，但若繼續(xù)增加LCL細胞數(shù)目，則所收獲的細胞里含有較高比例的死亡LCL細胞，所以T細胞與抗原呈遞細胞的比例應(yīng)選在1:2至1:6之間。表2.不同T細胞與抗原呈遞細胞的比例對所培養(yǎng)出的CD3+CD56+細胞量的影響。T細胞:LCL4:12:11:11:21:41:6CD3+CD56+（％）15.219.328.748.953.147.4（9）為了確定共培養(yǎng)時IL-15的最佳濃度，將在不同濃度下所培養(yǎng)出的細胞以流式細胞儀檢測其中的CD3+CD56+雙陽性細胞的比例。結(jié)果如表3所示，隨著IL-15濃度的增加，CD56+的T細胞比例也不斷增加，在濃度30ng/ml時接近50%，90ng/ml時達到最高51.3％，濃度再增加至120ng/ml也不再有增加，可見IL-15的最佳濃度應(yīng)選在30ng/ml以上，結(jié)合成本考慮，則不需超過120ng/ml。表3.不同IL-15濃度對所培養(yǎng)出的CD3+CD56+細胞量的影響。IL-15(ng/ml)715306090120CD3+CD56+（％）18.226.346.749.951.350.8（10）為了確定每輪共培養(yǎng)的最佳時間，將T細胞與LCL以1:3的比例共培養(yǎng)，所用IL-15的濃度為40ng/ml，每隔2天取樣檢測所擴增出的細胞數(shù)目。結(jié)果如表4所示，共培養(yǎng)的前6天細胞增殖迅速，但在第8天后擴增速度明顯下降。故每輪共培養(yǎng)的時間應(yīng)控制在6-8天，此后應(yīng)該加入更多的LCL開始新一輪的共培養(yǎng)。表4.不同共培養(yǎng)時間后的T細胞擴增倍數(shù)。共培養(yǎng)時間（天）246810細胞擴增倍數(shù)（與起始T細胞數(shù)目相比）2.77.816.324.226.9二、使用本發(fā)明進行具有NK細胞特質(zhì)的LMP2特異性T細胞的制備。本實驗的目的是為了驗證本發(fā)明的方法能以被CD40L激活的B細胞為抗原負載細胞來培養(yǎng)具有高CD56表達的、針對LMP2病毒抗原的特異性T細胞。（1）抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴細胞分離液Ficoll-PlaquePlus通過密度梯度離心分離出單個核細胞（PBMC），用PBS洗滌2次后將所得的細胞凍存?zhèn)溆?。?）以慢病毒轉(zhuǎn)染U251人膠質(zhì)瘤細胞系得到穩(wěn)定表達CD40L（CD154）的U251-CD40L細胞。先于24孔板內(nèi)培養(yǎng)U251-CD40L至細胞覆蓋整個底部，再以80Gy的伽馬射線輻照后加PBMC至1×105/ml進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入終濃度為1ug/ml的環(huán)孢素A（CyclosporinA）及100U/ml的IL-4,置于37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1周，所得的細胞再以4×105/ml的濃度與輻照過的U251-CD40L細胞進行多次共培養(yǎng)。PBMC里的B細胞能被CD40L激活并大量擴增，被激活的B細胞(Bblast)除了表達MHC-I外，還大量表達CD86、4-1BBL等共刺激分子，成為專職抗原呈遞細胞（KondoE,GryschokL,etal.ClinExpImmunol.2009，155(2):249-256），負載抗原后能有效刺激并擴增特異性T細胞。（3）細胞所負載的抗原為覆蓋EB病毒LMP2蛋白的多肽庫（購于JPTTechnology的PepMix，每個多肽長度為15個氨基酸，其中11個氨基酸與相鄰的多肽重疊）。將多肽庫以10ng/ml的終濃度加入被激活的B細胞1小時即可完成抗原負載。（4）將已負載了LMP2的B細胞與外周血單個核細胞以1:20的比例置于24孔板里開始第一輪10天的共培養(yǎng)。（5）將第一輪富集過的T細胞與負載了LMP2的B細胞以1:3比例進行第二輪的共培養(yǎng)，培養(yǎng)基里加IL-15至終濃度為40ng/ml，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)3天后換新鮮的培養(yǎng)基，同時補充IL-15。（6）按第二輪共培養(yǎng)的條件再進行一輪的共培養(yǎng)，收集所得的LMP2特異性的T細胞。以臺盼蘭染色法在顯微鏡下檢測并計算出所收獲的總細胞數(shù)。取一部分細胞用流式細胞儀檢測其細胞類型，檢測結(jié)果顯示其中CD3+CD56+雙陽性的細胞比例為46%，表達PD-1的細胞為2.3%。（7）制備PHA細胞（PHAblast)用于細胞殺傷力的檢測，具體制備步驟如下：取5×105/ml的PBMC，于培養(yǎng)基中加入植物血凝素（PHA）至5μg/ml，培養(yǎng)2天后添加IL-2至100U/ml，2天后將已擴增的細胞分至新的24孔板里，重復(fù)以上PHA和IL-2的刺激過程，收取所得的PHA細胞，一部分按上述方法負載LMP2抗原，另一部分沒有負載抗原作為對照組。（8）取所得的LMP2特異性T細胞，分別以負載了LMP2的PHA細胞、沒負載抗原的PHA以及K562細胞作為靶細胞，測試對它們殺傷活性。檢測殺傷活性所用的試劑盒為PerkinElmer所產(chǎn)的DELFIA細胞毒性檢測試劑盒。結(jié)果如圖4所示，使用本發(fā)明培養(yǎng)出的LMP2特異性T細胞對沒有負載抗原的PHA細胞沒有殺傷力，但對負載了抗原的PHA有很強的特異性殺傷力，當(dāng)效靶比在2:1至40:1時，特異性的裂解率在40%至90%之間。所培養(yǎng)的T細胞對不表達MHC-I的K562細胞也有很強的殺傷力，當(dāng)效靶比在2:1至40:1時，裂解率在40%至80%之間。這表明以被CD40L激活的B細胞作為抗原呈遞細胞，用本發(fā)明培養(yǎng)出的LMP2特異性T細胞同時具有很強的特異性及非MHC限制性的非特異性殺傷力。三、使用本發(fā)明進行具有NK細胞特質(zhì)的WT-1特異性T細胞的制備。本實驗的目的是為了驗證本發(fā)明的方法能以gamma-deltaT細胞為抗原負載細胞來培養(yǎng)具有高CD56表達的、針對WT-1癌癥抗原的特異性T細胞。（1）抽取志愿者100毫升外周血，用淋巴細胞分離液Ficoll-PlaquePlus通過密度梯度離心分離出單個核細胞（PBMC），用PBS洗滌2次后將所得的細胞凍存?zhèn)溆?。?）取5×107的外周血單個核細胞，于培養(yǎng)基中加入終濃度為5uM的唑來膦酸（Zometa）及200U/ml的IL-2,置于37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2周，PMBC里的gamma-deltaT細胞被激活并大量擴增，被激活的gamma-deltaT細胞除了表達MHC-I外，還大量表達CD86、4-1BBL等共刺激分子，成為專職抗原呈遞細胞（ManiarA,ZhangX,etal.Blood.2010,116(10):1726-1733），負載抗原后能有效刺激并擴增特異性T細胞。（3）細胞所負載的抗原為覆蓋癌癥特異性蛋白WT-1的多肽庫（購于JPTTechnology的PepMix，每個多肽長度為15個氨基酸，其中11個氨基酸與相鄰的多肽重疊）。將多肽庫以10ng/ml的終濃度加入被被激活的gamma-deltaT細胞1小時即可完成抗原負載。（4）將已負載了WT-1的gamma-deltaT細胞與外周血單個核細胞以1:20的比例置于24孔板里開始第一輪10天的共培養(yǎng)，同時加入IL-15至40ng/ml。（5）將第一輪富集過的T細胞與負載了WT-1的gamma-deltaT細胞以1:3比例進行第二輪的共培養(yǎng)，培養(yǎng)基里加IL-15至終濃度為40ng/ml，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)3天后換新鮮的培養(yǎng)基，同時補充IL-15。（6）按第二輪共培養(yǎng)的條件再進行一輪的共培養(yǎng)，收集所得的WT-1特異性的T細胞。以臺盼蘭染色法在顯微鏡下檢測并計算出所收獲的總細胞數(shù)。取一部分細胞用流式細胞儀檢測其細胞類型，檢測結(jié)果顯示其中CD3+CD56+雙陽性的細胞比例為58%，表達PD-1的細胞比例為1%。（7）制備PHA細胞用于細胞殺傷力的檢測。具體步驟如下：取5×105/ml的PBMC，于培養(yǎng)基中加入植物血凝素(PHA)至5μg/ml，培養(yǎng)2天后添加IL-2至100U/ml，2天后將已擴增的細胞分至新的24孔板里，重復(fù)以上PHA和IL-2的刺激過程，收取所得的PHA細胞，一部分按上述方法負載WT-1抗原，另一部分沒有負載抗原作為對照組。（8）取所得的WT-1特異性T細胞，分別以負載了WT-1的PHA細胞、沒負載抗原的PHA以及K562細胞作為靶細胞，測試對它們殺傷活性。檢測殺傷活性所用的試劑盒為PerkinElmer所產(chǎn)的DELFIA細胞毒性檢測試劑盒。結(jié)果如圖5所示，使用本發(fā)明培養(yǎng)出的WT-1特異性T細胞對沒有負載抗原的PHA細胞沒有殺傷力，但對負載了抗原的PHA有很強的特異性殺傷力，當(dāng)效靶比在2:1至40:1時，特異性的裂解率在30%至75%之間。所培養(yǎng)的T細胞對不表達MHC-I的K562細胞也有很強的殺傷力，當(dāng)效靶比在2:1至40:1時，裂解率在40%至80%之間。這表明以gamma-deltaT細胞作為抗原呈遞細胞，用本發(fā)明培養(yǎng)出的WT-1特異性T細胞同時具有很強的特異性及非MHC限制性的非特異性殺傷力。當(dāng)前第1頁1 2 3