本申請要求2010年3月1日提交的名稱為“生物粘附性衍生的超支化聚丙三醇”的美國臨時專利申請第61/309,304序列號的權(quán)益，通過引用將其全文并入。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于將藥物或其他的生物活性部分遞送至生物組織的治療、它們的用途以及方法。具體地說，本發(fā)明涉及基于衍生的超支化聚丙三醇(dHPG)的聚合物以及用于治療癌癥、感染、和炎癥性或自身免疫性疾病的方法。

背景

膀胱癌為第二最常見的泌尿生殖系惡性腫瘤。在最初診斷時，大約70％病例為非肌層侵潤性的。目前用于淺表性疾病的治療選擇包括通過用導(dǎo)尿管將化學(xué)治療劑膀胱內(nèi)灌注至膀胱來局部地治療膀胱癌。然而，這些治療選擇療效有限。盡管接受了膀胱內(nèi)化學(xué)療法和/或免疫療法，多達80％患有非肌層侵潤性膀胱癌的患者發(fā)展為復(fù)發(fā)性腫瘤，其中20-30％發(fā)展成為更有侵略性的，潛在致死性腫瘤(Dalbagni,G.(2007)Nat.Clin.Pract.Urol.4:254-260)。

人們認(rèn)為治療失敗部分地歸因于有效對抗膀胱中膀胱癌細(xì)胞的藥物的短駐留時間。例如，由于目前制劑在膀胱中不良的生物利用度，紫杉烷(taxanes)通常不用于膀胱內(nèi)灌注。已有文獻證明紫杉醇(Paclitaxel)在系統(tǒng)性膀胱癌治療中有抗腫瘤活性，因為它以比諸如絲裂霉素C(mitomycin C)的水溶性藥物的速率快20倍的速率滲透膀胱組織，甚至在灌注溶液除去后還允許治療劑量延長的停留。然而，它的膀胱內(nèi)用途受商品化制劑(Taxol^TM)中Cremophor^TM-EL的存在所阻 礙，因為其使藥物陷入水相環(huán)境并且減少了紫杉醇滲透至膀胱壁(Mugabe,C等.(2008)British J.Urology Int.102(7):978-986)。

當(dāng)許多活性劑為疏水性或水不溶性時，它們經(jīng)常需要基于水的或水相環(huán)境以用于眾多適應(yīng)癥的有效治療，所述適應(yīng)癥包括癌癥(諸如腸癌、肺癌、膀胱癌以及泌尿生殖系統(tǒng)癌)，感染(諸如消化道和氣道的那些)以及炎癥性或自身免疫性疾病(諸如刺激性膀胱、炎癥性腸疾病以及慢性和急性炎癥)。同樣地，已研發(fā)了多系統(tǒng)用作此類制劑的遞送媒介。這些系統(tǒng)的其中之一包括聚合物膠束的使用。

聚合物膠束為兩性分子的，具有疏水性內(nèi)核和親水性外殼，正因為如此，它們可以由于疏水相互作用而將疏水性分子封入內(nèi)核中。親水性外殼保持系統(tǒng)可溶于水。然而，由于稀釋效應(yīng)或者環(huán)境因素，這些系統(tǒng)可能在膀胱中為不穩(wěn)定的。

超支化聚丙三醇(“HPG”)為少數(shù)超支化聚合物的其中之一，所述超支化聚合物可以以可控的方式合成，具有預(yù)先確定的分子量和窄的多分散性(Kainthan,R.K.等.(2008)Biomacromolecules 9:886-895)。疏水性分子可被封入至HPG的疏水性內(nèi)核(WO2006/130978)。

發(fā)明概述

本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：本文所述的衍生的超支化聚丙三醇(“dHPG”)可用作用于將藥物或其他的生物活性部分遞送至泌尿道(例如尿道和膀胱)、消化道(例如口、食道以及結(jié)腸)、氣道(例如鼻和肺)、陰道腔和子宮頸以及腹膜腔的試劑，以治療適應(yīng)癥，諸如癌癥(例如，膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉癌、口腔癌、竇癌、陰道癌或子宮頸癌)、感染(例如，消化道或氣道感染)，和炎癥性或自身免疫性疾病(例如，刺激性膀胱、炎癥性腸疾病或慢性或急性炎癥)以及其他的適應(yīng)癥，其中要求將藥物或其他的生物活性部分遞送至組織或細(xì)胞。例如，本文所鑒定的聚合物可用于非肌層侵潤性膀胱癌的灌注治療。本文所鑒定的聚合物可顯示粘膜粘附特性，該特性可用于非肌層侵潤性膀胱癌的灌注治療。

本文所述的dHPG可用作藥物或其他的生物活性部分的載體并且 用于制備治療藥物，所述治療藥物用于將此類藥物或部分遞送至靶組織或細(xì)胞。具體地說，本文所述的dHPG可用作紫杉烷的載體，用于非肌層侵潤性膀胱癌的治療。

本文所述的凝聚的內(nèi)核dHPG具有特別滿足用于將藥物遞送至靶組織需要的令人驚奇的特性。具體地說，如本文所示，凝聚的內(nèi)核dHPG的毒性更小并且具有更高的耐受性。

根據(jù)一實施方案，提供了超支化聚丙三醇，所述超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生的超支化聚丙三醇，其中與內(nèi)核的邊緣相比，C₁-C₂₀烷基鏈與丙三醇單元的比率在內(nèi)核中心更大；外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。

根據(jù)另一實施方案，提供了將生物活性部分遞送至生物組織的方法，所述方法包括：將負(fù)載生物活性部分的超支化聚丙三醇給予生物組織，其中超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生的超支化聚丙三醇，其中與內(nèi)核的邊緣相比，C₁-C₂₀烷基鏈與丙三醇單元的比率在內(nèi)核中心更大；外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。該方法還包括將生物活性部分摻入超支化聚丙三醇。

根據(jù)其他的實施方案，提供了超支化聚丙三醇在用于將生物活性部分遞送至生物組織中的用途，其中超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生的超支化聚丙三醇，其中與內(nèi)核的邊緣相比，C₁-C₂₀烷基鏈與丙三醇單元的比率在內(nèi)核中心更大；外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

根據(jù)另一實施方案，提供了超支化聚丙三醇在制備藥物中的用途，所述藥物用于將生物活性部分遞送至生物組織，其中超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生的超支化聚丙三醇，其中與內(nèi)核的邊緣相比，C₁-C₂₀烷基鏈與丙三醇單元的比率在內(nèi)核中心更大； 外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

根據(jù)其他的實施方案，提供了包含超支化聚丙三醇與生物活性部分的藥物組合物，其中超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生的超支化聚丙三醇，其中與內(nèi)核的邊緣相比，C₁-C₂₀烷基鏈與丙三醇單元的比率在內(nèi)核中心更大；外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

根據(jù)一實施方案，提供了超支化聚丙三醇，其包含內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生的超支化聚丙三醇；以及外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中至少一種親水性取代基包含至少一種選自以下的官能團：-NH₂,＝NH₂⁺,-NH₃⁺,以及-NR₃⁺，其中每一R為獨立地C₁-C₆烷基或一個R為獨立地C₁-C₆烷基并且兩個R一起形成C₃-C₁₂環(huán)烷基，從而使得R₃與氮形成季胺，而且其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

根據(jù)其他的實施方案，提供了超支化聚丙三醇在用作預(yù)處理或聯(lián)合治療以增加組織中的藥物攝取中的用途，超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含超支化聚丙三醇；以及外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中至少一種親水性取代基包含至少一種選自以下的官能團：-NH₂,＝NH₂⁺,-NH₃⁺,以及-NR₃⁺，其中每一R為獨立地C₁-C₆烷基或一個R為獨立地C₁-C₆烷基并且兩個R一起形成C₃-C₁₂環(huán)烷基，從而使得R₃與氮形成季胺，而且其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇，預(yù)處理。在一實施方案中，內(nèi)核還可用C₁-C₂₀烷基鏈衍生。

根據(jù)另一實施方案，提供了用作預(yù)處理或聯(lián)合治療以增加組織中的藥物攝取的超支化聚丙三醇，其包含：內(nèi)核，其包含超支化聚丙三醇；以及外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，其中其中至少一種親水性取代基包含至少一種選自以下的官能團：-NH₂、＝NH₂⁺、-NH₃⁺以及-NR₃⁺，其中每一R為獨立地C₁-C₆烷基或一個R為獨立地C₁-C₆烷基并且兩個R一起形成C₃-C₁₂環(huán)烷基，從而使得R₃與氮形成季胺，而且其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇預(yù)處理。在一實施方案中，內(nèi)核還可用C₁-C₂₀烷基鏈衍生。在一實施方案中，增加組織中的藥物攝取可能引起組織的雨傘細(xì)胞的缺失。在一實施方案中，增加組織中的藥物攝取可能沒有引起組織的壞死和/或炎癥。

根據(jù)另一實施方案，提供了超支化聚丙三醇，超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含來自于丙三醇環(huán)氧化物和C₁-C₂₀烷基環(huán)氧化物或C₁-C₂₀烷基縮水甘油醚聚合的超支化聚丙三醇，其中在所有或基本上所有的丙三醇環(huán)氧化物聚合之前，所有或基本上所有的C₁-C₂₀烷基環(huán)氧化物或C₁-C₂₀烷基縮水甘油醚為聚合的；以及外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基共價結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。根據(jù)其他的實施方案，提供了合成超支化聚丙三醇的方法，所述方法包括：聚合丙三醇環(huán)氧化物與C₁-C₂₀烷基環(huán)氧化物或C₁-C₂₀烷基縮水甘油醚，從而使得在所有或基本上所有的丙三醇環(huán)氧化物聚合之前，所有或基本上所有的C₁-C₂₀烷基環(huán)氧化物或C₁-C₂₀烷基縮水甘油醚為聚合的以形成超支化聚丙三醇；以及用至少一種親水性取代基衍生超支化聚丙三醇的羥基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。丙三醇環(huán)氧化物可為縮水甘油。C₁-C₂₀烷基環(huán)氧化物可為1,2-環(huán)氧十八烷。C₁-C₂₀烷基縮水甘油醚可為C₈-C₁₀烷基縮水甘油醚。

根據(jù)另一實施方案，提供了超支化聚丙三醇，超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生并負(fù)載多西紫杉醇(docetaxel)的超支化聚丙三醇；外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基共價結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

根據(jù)其他的實施方案，提供了超支化聚丙三醇在用于將多西紫杉醇遞送至生物組織中的用途，其中超支化聚丙三醇包含：內(nèi)核，其包 含用C₁-C₂₀烷基鏈衍生并負(fù)載多西紫杉醇的超支化聚丙三醇；以及外殼，其包含至少一種與內(nèi)核的羥基共價結(jié)合的親水性取代基，其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

超支化聚丙三醇可能還包括生物活性部分。超支化聚丙三醇可用作用于增加生物活性部分的藥物攝取的預(yù)處理或聯(lián)合治療。生物活性部分可為一種或多種疏水性藥物。生物活性部分可選自以下(或更多)其中一種：戊柔比星(valrubicin)、順鉑(cisplatin)、紫杉醇、多西紫杉醇。生物活性部分可為紫杉烷或其類似物。紫杉烷可為紫杉醇或其類似物。紫杉烷可為多西紫杉醇或其類似物。生物活性部分可為絲裂霉素或其類似物。絲裂霉素可包括所有的絲裂霉素類似物。絲裂霉素及其類似物可包括，例如，絲裂霉素A、絲裂霉素B、絲裂霉素C、絲裂霉素D、絲裂霉素F、絲裂霉素G、絲裂霉素H、絲裂霉素K以及其類似物。生物活性部分可為絲裂霉素C。生物活性部分可為絲裂霉素F。生物活性部分可為戊柔比星。生物活性部分可為長春花堿(vinblastine)。生物活性部分可為順鉑。生物活性部分可為甲氨蝶呤(methotrexate)。生物活性部分可為多柔比星(doxorubicin)或其類似物。生物活性部分可為表柔比星(epirubicin)。生物活性部分可為吉西他濱(gemcitabine)。生物活性部分可為依維莫司(everolimus)。生物活性部分可為蘇拉明(suramin)。生物活性部分可為部分的組合。部分的組合可為甲氨蝶呤、長春花堿以及多柔比星(M-VAC)。部分的組合可為M-VAC與順鉑。

親水性取代基可為聚乙二醇(PEG)(200-450g/ml)，或甲氧基聚乙二醇(MPEG)(200-450g/ml)，或其組合。至少一種親水性取代基可為MePEG或PEG。至少一種親水性取代基可為MePEG。至少一種親水性取代基可為PEG。至少一種親水性取代基可包含至少一種官能團，該官能團為-OH、-COOH、-NHS、-SH、-NH₂、-NH₃⁺或-NR₃⁺，其中每一R為獨立地C₁-C₆烷基或一個R為獨立地C₁-C₆烷基并且兩個R一起形成C₃-C₁₂環(huán)烷基，從而使得R₃與氮形成季胺。

至少一種官能團可為-NH₂、-NH₃⁺或-NR₃⁺，其中每一R為獨立地C₁-C₆烷基或一個R為獨立地C₁-C₆烷基并且兩個R一起形成C₃-C₁₂環(huán)烷基，從而使得R₃與氮形成季胺。至少一種官能團可為-NH₂或-NH₃⁺。至少一種官能團可為胺?？蛇x擇地，至少一種官能團可為-NH₂。

超支化聚丙三醇可包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約1摩爾-約100摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約1摩爾-約40摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約5摩爾-約40摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約10摩爾-約40摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約10摩爾-約30摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約30摩爾-約40摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約5摩爾-約15摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。所述至少一種親水性取代基可結(jié)合約1％-約40％羥基。所述至少一種親水性取代基可結(jié)合約5％-約30％羥基。所述至少一種親水性取代基可結(jié)合約20％羥基。

可通過測量超支化聚丙三醇的分子量以及測量存在于超支化聚丙三醇總量中的親水性取代基的量確定親水性取代基的量/摩爾超支化聚丙三醇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可利用不同的方法測量超支化聚丙三醇的分子量，例如，利用具有多角度激光散射探測的凝膠滲透色譜分析法。例如可通過滴定法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的親水性取代基的量。滴定法可為正向滴定法。滴定法可為反向滴定法。例如，其中親水性取代基包含至少一種可為-NH₂的官能團，抗諸如HCl酸的正向滴定法可用于測量親水性取代基存在于HPG總量的量。其中親水性取代基包含至少一種可為-NH₂的官能團，可使用利用已知量的諸如HCl酸的反向滴定法并且滴定抗諸如NaOH的堿。例如可通過比色法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的親水性取代基的量。例如可通過熒光法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的親水性取代基的量。其中親水性取代基包含至少一種可為-NH₂的官能團，可使 用熒光胺測定?？赏ㄟ^多于一種方法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的親水性取代基的量以及通過多于一種方法所測量的親水性取代基的量的平均值可用于計算親水性取代基的摩爾/摩爾超支化聚丙三醇。其中親水性取代基包含至少一種可為-NH₂的官能團，熒光胺測定可為優(yōu)選的方法以確定存在于超支化聚丙三醇總量中的親水性取代基的量。

超支化聚丙三醇可包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約1摩爾-約100摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約1摩爾-約40摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約5摩爾-約40摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約10摩爾-約40摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約10摩爾-約30摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約30摩爾-約40摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。超支化聚丙三醇可包含約5摩爾-約15摩爾的所述至少一種官能團/摩爾超支化聚丙三醇。

可通過測量超支化聚丙三醇的分子量以及測量存在于超支化聚丙三醇總量中的官能團的量確定官能團的量/摩爾超支化聚丙三醇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可利用不同的方法測量超支化聚丙三醇的分子量，例如，凝膠滲透色譜分析法。例如，利用具有多角度激光散射探測的凝膠滲透色譜分析法測量超支化聚丙三醇的分子量。例如可通過滴定法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的官能團的量。滴定法可為正向滴定法。滴定法可為反向滴定法。例如，其中所述至少一種官能團可為-NH₂，抗諸如HCl酸的正向滴定法可用于測量-NH₂存在于HPG總量的量。其中所述至少一種官能團可為-NH₂，可使用利用已知量的諸如HCl酸的反向滴定法并且滴定抗諸如NaOH的堿。例如可通過比色法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的官能團的量。例如可通過熒光法測量存在于超支化聚丙三醇總量中的官能團的量。其中所述至少一種官能團可為-NH₂，可使用熒光胺測定?？赏ㄟ^多于一種方法 測量存在于超支化聚丙三醇總量中的官能團的量以及通過多于一種方法所測量的官能團的量的平均值可用于計算官能團的摩爾/摩爾超支化聚丙三醇。其中所述至少一種官能團可為-NH₂，熒光胺測定可為優(yōu)選的方法以確定存在于超支化聚丙三醇總量中的官能團的量。

C₁-C₂₀烷基鏈可為C₅-C₂₀烷基鏈。C₁-C₂₀烷基鏈可為C₈-C₁₈烷基鏈。C₁-C₂₀烷基鏈可為C₈-C₁₀烷基鏈。

至少一種親水性取代基的一部分可位于內(nèi)核中。

生物組織可為粘膜的膜。生物組織可為細(xì)胞。生物組織可為膀胱的尿路上皮表面。

如本文所述的dHPG可通過普通命名法來描述，所述普通命名法鑒定基礎(chǔ)的超支化結(jié)構(gòu)、內(nèi)核屬性、以及如下的表面屬性：

HPG-內(nèi)核(x)-外殼₁(y₁)-外殼₂(y₂)…-外殼_n(y_n) (I)

其指定了由超支化聚丙三醇組成的聚合物，其包含衍生的選自疏水基的取代基的內(nèi)核，所述疏水基諸如C₈、C₁₀、C₁₂或C₁₈烷基，其為直鏈的或分支的或包含芳基取代基，其中內(nèi)核取代基的量為x，用摩爾數(shù)或作為百分比表達。聚合物也具有外殼上n個取代基，諸如PEG或MePEG，或具有如本文所述的羧基(COOH)、羥基、胺(NR₂)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、帶電荷的胺(NR₃⁺)、巰基(SH)等的取代基。每一外殼取代基可屬于如存在于某一量y₁、y₂或y_n并且用摩爾數(shù)或作為百分比表達。在一些符號中，通常的分類可屬于相同的方式，而沒有明確地鑒定每個的量。另外，當(dāng)外殼取代基為PEG或MePEG時，還可通過這一聚合組分的鏈長度定義，例如MePEG350、PEG200等。然而對于通常的分類，分子量可以省略。

例如，HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-NH₂分別屬于內(nèi)核(x)C_8/10。術(shù)語“HPG-C_8/10-MePEG”，諸如此類，在本文任何之處都可以與術(shù)語“HPG-C10-MePEG”互換地使用。在某些情況下，不鑒定內(nèi)核(x)并且可以假設(shè)為C_8/10。然而，可使用其他的具有C₁-C₂₀的烷基。根據(jù)其他的實施方案，提供了本文所述的dHPG在用于將藥物遞送至靶組織中的用途。根據(jù)其他的實施方案，提供了本文所述的dHPG在制備用于將藥物遞送至靶組織的藥物中的用途。根據(jù)其他的實施方案，提供了本 文所述的dHPG用作預(yù)處理或聯(lián)合治療以增加組織中藥物攝取中的預(yù)處理用途。根據(jù)其他的實施方案，提供了本文所述的dHPG用于治療非肌層侵潤性膀胱癌的用途。根據(jù)其他的實施方案，提供了本文所述的dHPG作為增加組織中用于治療非肌層侵潤性膀胱癌的藥物攝取的預(yù)處理或聯(lián)合治療。根據(jù)其他的實施方案，提供了本文所述的dHPG在制備用于治療非肌層侵潤性膀胱癌的藥物中的用途。非肌層侵潤性膀胱癌的治療可在哺乳動物中。哺乳動物可為人類。根據(jù)另一實施方案，提供了包含如本文所列的dHPG的藥物組合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。根據(jù)其他的實施方案，提供了一種或多種本文所述的用于將藥物遞送至靶組織的dHPG。根據(jù)其他的實施方案，提供了用于制備本文所述的dHPG的方法。

本文所述的聚合物意指包括所有外消旋混合物和所有單獨的結(jié)構(gòu)同分異構(gòu)體或變體，尤其是通過HPG結(jié)構(gòu)內(nèi)分支模式或在表面取代基與HPG物理連接方面所定義的。

附圖簡要說明

圖1顯示了多西紫杉醇(DTX)樣品的超高效液相色譜(UPLC)的色譜圖。

圖2顯示了DTX洗脫液和它的差向異構(gòu)體(7-表-DTX)的峰面積與時間的函數(shù)以確定如本文所述的dHPG摻入DTX的穩(wěn)定性。

圖3A顯示了DTX與7-表-DTX離子(+H⁺)m/z 808.5在摻入DTX的HPG-C_8/10中單一的離子記錄(SIR)。

圖3B顯示了DTX與7-表-DTX離子(+H⁺)m/z 808.5在摻入DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH2中的SIR。

圖4顯示了對摻入DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH2而言的總離子流(TIC)。

圖5顯示了針對DTX所提出的現(xiàn)有技術(shù)破碎模式。

圖6顯示了對pH7.4和pH6.0時摻入DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂而言，DTX(和7-表-DTX)洗脫液的峰面積與時間的函數(shù)。

圖7A顯示了對正常的內(nèi)核(NC)制劑和凝聚的內(nèi)核(CC)制劑而言，KU7細(xì)胞增殖的百分比與HPG-C_8/10的濃度的函數(shù)。

圖7B顯示了對于正常的內(nèi)核(NC)制劑和凝聚的內(nèi)核(CC)制劑而言，KU7細(xì)胞增殖的百分比與HPG-C_8/10-MePEG的濃度的函數(shù)。

圖8顯示了KU7細(xì)胞增殖的百分比與聚合物濃度的函數(shù)以確定各種dHPG的生物相容性。

圖9顯示了HPG-C_8/10在分別代表樹狀的、直鏈的1-3、以及直鏈的1-4單元的D₆-DMSO.D、L₁₃以及L₁₄中的異核單量子相關(guān)譜(HSQC)光譜和400MHz質(zhì)子(頂部)。

圖10顯示了(A)HPG-C_8/10-MePEG_6.5的400MHz HSQC質(zhì)子(頂部)和HSQC光譜以及(B)MePEG350環(huán)氧化物、O/DGE、以及HPG-C_8/10-MePEG₁₃聚合物的疊加的400MHz HSQC光譜。

圖11顯示了(A)PTX酯鍵的堿催化的乙醇分解以產(chǎn)生巴卡亭(Baccatin)III以及它的側(cè)鏈乙酯(N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸乙酯)和(B)示例在利用未純化的HPG-C_8/10-MePEG制備制劑中通過UPLC-MS/MS測定PTX降解產(chǎn)物的鑒定的代表性色譜圖。

圖12顯示了示例HPG-C_8/10-MePEG₁₃的純化對通過UPLC UV分析所測量的PTX的化學(xué)穩(wěn)定性(2.1分鐘的停留時間)的影響的代表性色譜圖。(A)PTX的色譜圖，該PTX配制于磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)中新鮮組成的未純化的HPG中，(B)(A)中相同的制劑，老化48h的色譜圖，以及(C)PTX的色譜圖，該PTX配制于PBS(pH7.4)中新鮮組成的純化的HPG中。

圖13顯示了人造尿液中37℃下自HPG-C_8/10-MePEG釋放的PTX與DTX。(A)自HPG-C_8/10-MePEG(6與13mol)釋放的累積的DTX。(B)自人造尿液中HPG-C_8/10-MePEG(pH4.6與6.5)釋放的累積的PTX。

圖14顯示了示例1h暴露后HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA納米顆粒完全攝取的KU7細(xì)胞的共聚焦熒光成像。(A)具有苯基吲哚(DAPI)染色未處理的KU7細(xì)胞允許細(xì)胞核可視為藍色(如圖中白色所示)。(B)已與HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA納米顆粒孵育1h的KU7細(xì)胞。

圖15顯示了商品化制劑與抗KU7-熒光素酶細(xì) 胞系的負(fù)載PTX和/或DTX的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒、低級的(RT4,MGHU3)與高級的(UMUC3)人尿路上皮癌細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性效應(yīng)。

圖16顯示了膀胱內(nèi)紫杉烷制劑對原位膀胱癌異種移植的治療效應(yīng)。媒介對照(PBS&空白的HPG-C_8/10-MePEG)、(1mg/ml,Bristol-Myers-Squibb)、(0.5mg/ml,Sanofi-Aventis)或負(fù)載紫杉醇(PTX,1mg/ml)或多西紫杉醇(DTX,0.5mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG。

圖17顯示了來自不同的治療組，取自隨機某天、18天以及33天的小鼠的生物熒光成像的代表性序列。右側(cè)，相同的小鼠在PBS對照、 以及負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG治療組中的代表性膀胱橫截面。

圖18顯示了最終收獲的膀胱的代表性組織切片，其來自接受了各種處理的小鼠：A)PBS,B)(1mg/ml),C)HPG-C_8/10-MePEG/PTX(1mg/ml),D)(0.5mg/ml),E)HPG-C_8/10-MePEG/DTX(0.5mg/ml),F)HPG-C_8/10-MePEG(無藥物)。

圖19顯示了(A)HPG-C_8/10-MePEG的一維質(zhì)子譜(頂部曲線)和HSQC光譜，和(B)在9.4T磁場強度處獲得的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎的一維質(zhì)子譜(頂部曲線)和HSQC光譜。

圖20顯示了通過粘蛋白-顆粒方法所評估的HPG的粘膜粘附特性。

圖21顯示了(A)若丹明(rhodamine)標(biāo)記的HPG的體外Ku7-熒光素酶結(jié)合以及(B)暴露于HPG溶液的Ku7-熒光素酶細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖22顯示了自HPG-C_8/10-MePEG與pH6.5人造尿液中HPG-C_8/10-MePEG-NH₂納米顆粒釋放的累積的DTX。

圖23顯示了(A)來自除了PBS對照以外每一治療組取自腫瘤接種后2天、8天、12天的小鼠的生物熒光成像以及(B)單一的膀胱內(nèi)DTX制劑對原位膀胱癌異種移植的處理效應(yīng)。右側(cè)圖板，除了PBS和 (0.5mg/ml)組以外治療組的詳細(xì)視圖。

圖24顯示了下列負(fù)載0.2mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎單一膀胱內(nèi)治療的小鼠的生物熒光成像。

圖25顯示了抗KU7熒光素酶細(xì)胞的DTX制劑以及低級的(RT4,MGHU3)與高級的(UMUC3)人尿路上皮癌細(xì)胞系二者的體外細(xì)胞毒性。

圖26顯示了單一的膀胱內(nèi)DTX制劑對原位膀胱癌異種移植的治療效應(yīng)。小鼠的生物熒光成像顯示于左側(cè)面板。

圖27顯示了研究結(jié)束時，來自于接受了0.2mg/ml DTX的各種制劑：(A)HPG-C_8/10-MePEG-NH₂,(B)HPG-C_8/10-MePEG,(C)的小鼠所收獲的膀胱的代表性組織切片。治療組中，A、B和C，數(shù)字1-3屬于不同的放大率。

圖28顯示了與DTX(Taxotere ^TM)和PTX(Taxol^TM)的商品制劑相比，對摻入DTX或紫杉醇(PTX)的HPG-C_8/10-MePEG而言，腫瘤生物熒光與時間的函數(shù)。

圖29顯示了HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂中50μg DTX灌注后2小時DTX在膀胱內(nèi)的停留。

圖30顯示了用PBS、游離的若丹明(TMRCA)、HPG-C_8/10-MePEG標(biāo)記的若丹明(HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA)、HPG-C_8/10-MePEG-NH₂標(biāo)記的若丹明(HPG-C_8/10-MePEG-NH₂-TMRCA)灌注的原位膀胱癌。(B)膀胱腫瘤內(nèi)的熒光量，(C)腫瘤組織中所觀察到的若丹明熒光與距離膀胱腔的函數(shù)。

圖31顯示了氘代甲醇(methanol-d₄)中HPG-C_8/10-MePEG-COOH的(A)¹H核磁共振譜與(B)¹³C核磁共振譜。

圖32顯示了HPG聚合物中的結(jié)構(gòu)單元。每一樹狀的(D)、末端的(T)以及直鏈(L₁₃或L₁₄)單元以主要的(p)和次要的(s)單元存在。對未修飾的聚合物而言，R)HPG，對未修飾的聚合物而言，R)HPG、C_8/10、MePEG或COOH。編號方案適用于Dp單元。

圖33顯示了(A)HPG-C_8/10-OH、(B)HPG-C_8/10-COOH(高的COOH)、以及(C)HPGC_8/10-MePEG_6.5的代表性多重編輯的HSQC光譜。光譜表明了代表性分配。

圖34顯示了(A)HPG-C_8/10-OH與(B)HPG-C_8/10-COOH的HSQC光譜的擴展區(qū)域。給出了代表性分配。

圖35顯示了HPG-C_8/10-MePEG_6.5(頂部)、HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃(中心)以及HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈(底部)的FT-IR光譜。

圖36顯示了結(jié)合順鉑的HPG-C_8/10-MePEG-COOH的代表性結(jié)構(gòu)。

圖37顯示了順鉑與(空白的三角)HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃或(實心的方塊)HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈在調(diào)至pH6.0的蒸餾水中的結(jié)合。

圖38顯示了在藥物濃度1mg/ml和聚合物濃度10mg/ml時游離的順鉑(空白的菱形)或與(A)HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃或(B)HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈結(jié)合的順鉑的體外釋放。釋放介質(zhì)為37℃下pH4.5(實心的方塊)、6.0(空白的三角)、7.4(倒三角)的1mM PBS或人造尿液(空白的方塊)。

圖39顯示了與HPG-C_8/10-OH(實心的方塊)、HPG-C_8/10-MePEG_6.5(空白的三角)、HPGC_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃(實心的圓圈)以及HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈(空白的菱形)孵育(A)2小時和(B)72小時后KU-7-熒光素酶細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖40顯示了與游離的順鉑(實心的圓圈)、負(fù)載順鉑的HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃(空白的三角)以及HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈(實心的方塊)孵育(A)2小時和(B)72小時后KU-7-熒光素酶細(xì)胞的活力。

圖41顯示了暴露于含0.5mg/ml DTX(實心的圓圈)的Tween 80、含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(37摩爾胺/聚合物摩爾)(空白的方塊)、含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(10摩爾胺/聚合物摩爾)(空白的三角)、含0.5mg/ml的DTXHPG-C_8/10-MePEG(實心的倒三角)后豬膀胱組織內(nèi)DTX的組織橫向-縱向曲線。四種制劑的重復(fù)游程數(shù)的平均值，與Tween 80相比(例如Taxotere制劑)，利用具有遞增的胺含量的HPG聚合物比較滲透力。每一游程數(shù)中，進行5-6次重復(fù)次數(shù)。

圖42顯示了伴隨及無預(yù)處理1小時暴露于不同的DTX制劑后豬膀胱組織內(nèi)DTX的組織橫向-縱向曲線。含0.5mg/ml DTX的Tween 80 伴隨殼聚糖預(yù)處理(空白的圓圈)，含0.5mg/ml DTX的Tween 80伴隨HPG-C_8/10-MePEG-NH₂預(yù)處理(空白的菱形)，含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂無預(yù)處理(空白的倒三角)，以及含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG伴隨殼聚糖預(yù)處理。

圖43顯示了對伴隨及無預(yù)處理1小時不同的DTX制劑而言DTX的AUCs。含0.5mg/ml DTX的Tween 80伴隨殼聚糖預(yù)處理，含0.5mg/ml DTX的Tween 80伴隨HPG-C_8/10-MePEG-NH₂預(yù)處理，含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂無預(yù)處理，含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂伴隨殼聚糖預(yù)處理，以及含0.5mg/ml DTX的HPG-C_8/10-MePEG伴隨殼聚糖預(yù)處理。在post-hoc Tukey分析中，有意義的單因素方差分析結(jié)果p＝0.0007后，線條(bars)表示組間無顯著性差異(p>0.05)。誤差線表示S.E.M。

圖44顯示了伴隨預(yù)處理1小時暴露于絲裂霉素制劑后絲裂霉素F在豬膀胱組織中的組織橫向-縱向曲線。伴隨HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(10摩爾胺/HPG摩爾)預(yù)處理的絲裂霉素F(空白的方塊)以及伴隨HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(37摩爾胺/HPG摩爾)預(yù)處理的絲裂霉素F(實心的菱形)。

圖45顯示了用HPG遞送媒介:對照(臺氏(Tyrode’s)緩沖液，殼聚糖&具有0摩爾胺/摩爾聚合物的HPG-C_8/10-MePEG)體外處理的豬膀胱的SEM圖像。

圖46顯示了用HPG遞送媒介:HPG-C_8/10-MePEG-NH₂ 10&37摩爾胺/摩爾聚合物,0.1,1&10％w/v溶液體外處理的豬膀胱的SEM圖像。

圖47顯示了用PBS灌注2小時處理的小鼠膀胱的表面的SEM圖像。圖像取自2小時灌注時間段后就收獲的膀胱。

圖48顯示了用HPG-MePEG 10％溶液灌注2小時處理的小鼠的膀胱的表面的SEM圖像。圖像取自2小時灌注時間段后，灌注后B)6以及C)24小時后就收獲的膀胱。

圖49顯示了用HPG-MePEG-NH₂(10mol/mol)10％溶液灌注2小時處理的小鼠的膀胱的表面的SEM圖像。圖像取自A)2小時灌注時間段 后，灌注后B)6以及C)24小時后就收獲的膀胱。箭頭表示單一的雨傘細(xì)胞缺失，暴露了上皮的底層。

圖50顯示了用HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)1％溶液灌注2小時處理的小鼠的膀胱的表面的SEM圖像。圖像取自A)2小時灌注時間段后，灌注后B)6以及C)24小時后就收獲的膀胱。

圖51顯示了用HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)10％溶液灌注2小時處理的小鼠的膀胱的表面的SEM圖像。圖像取自A)2小時灌注時間段后，灌注后B)6以及C)24小時后就收獲的膀胱。

圖52顯示了在除去灌注導(dǎo)管的點上(2小時，對所有的組而言N＝6)以及在膀胱收獲時(2、6、24小時，對6與24小時取樣時間而言n＝1-3)自小鼠所收獲的尿液中的細(xì)胞計數(shù)。

圖53顯示了在A)HPG-MePEG 10％溶液,B)HPG-MePEG-NH₂(低的)10％溶液,C)HPG-MePEG-NH₂(高的)1％溶液,D)HPG-MePEG-NH₂(高的)10％溶液,CN)PBS緩沖液(對照)灌注后2、6和24小時小鼠血液中以及U)未處理的動物循環(huán)的TNFα水平。結(jié)果以用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)液顯示。虛線代表最低標(biāo)準(zhǔn)液的信號(0.6pg/mL標(biāo)準(zhǔn)液濃度)。

發(fā)明的詳細(xì)描述

本文所述的新的聚合物包括通式I中所示的那些，其所有似乎都與HPG有關(guān)系。早先已描述了HPG的合成，其包括兩性共聚物與兩性嵌段共聚物的產(chǎn)生，所述共聚物的產(chǎn)生包括與各種官能團的衍生物和/或共聚物與嵌段共聚物的產(chǎn)生(諸如烷基通過酯鍵的添加和聚亞烷基乙二醇基的添加)。描述HPG制備的出版物包括：美國專利5,112,876；美國專利6,469,218；美國專利6,765,082；美國專利6,822,068；WO 2000/77070；Sunder,A.等，(1999)Macromolecules 32:4240-46,(2000)Macromolecules 33:309-14,(2000)Macromolecules 33:1330-37，以及(2000)Adv.Mater 12:235-239；Knischaka,R.等,(2000)Macromolecules 33:315-20；Haag,R.,等，(2000)Macromolecules 33:8158-66,以及(2002)J.Comb.Chem.4:112-19；Kautz,H.等，(2001) Macromol.Symp.163:67-73；Karger-Kocsis,J.等，(2004)Polymer,45:1185-95；Gao,C.&Yan,D.(2004)Prog.Polym.Sci.29:183-275；以及Tziveleka,L等(2006)Macromol.Biosci.6:161-169)。Sunder,A等,(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38:3552-55包含兩性修飾的HPG的制備以及此類聚合物的衍生的描述，所述衍生包括與各種取代基及官能團的衍生。

本文所述的dHPG可包括C₁-C₃₀烷基鏈或其他類似的烷基鏈。然而，本文所述的dHPG也可包括C₁-C₂₀烷基鏈或其他類似的烷基鏈。術(shù)語“烷基”如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并且經(jīng)常指的是具有1個-20個碳原子的單價飽和的脂肪族的烴基，除非另有定義。碳?xì)浠衔锟蔀橹辨湹幕蛑ф湹牟⑶铱砂h(huán)族的或芳基取代基。烷基鏈可選自C₁-C₂₀烷基鏈的其中之一或更多。可選擇地，烷基鏈可選自C₂-C₁₉或C₃-C₁₈或C₄-C₁₇烷基鏈的其中之一或更多?？蛇x擇地，烷基鏈可選自C₅-C₁₆或C₆-C₁₅或C₇-C₁₄烷基鏈的其中之一或更多?？蛇x擇地，烷基鏈可選自C₈-C₁₃或C₉-C₁₂或C₁₀-C₁₅烷基鏈的其中之一或更多?？蛇x擇地，烷基鏈可選自C₅-C₁₅或C₅-C₁₀或C₅-C₂₀烷基鏈的其中之一或更多。烷基鏈或?qū)?nèi)核而言所選的鏈可取決于對dHPG的預(yù)期用途。例如，對負(fù)載紫杉醇而言，C₁₈烷基以及C_8/10不起效。

本文所述的HPG可包括具有官能團的取代基衍生的HPG從而使得衍生的HPG(“dHPG”)為粘膜粘附的，一般而言，為生物粘附的。在該術(shù)語最通常的意義中，dHPG將形成鍵或與生物組織相互作用，所述生物組織可為細(xì)胞或細(xì)胞外物質(zhì)。鍵或相互作用可為任何類型的，其包括范德華(van der Waals)相互作用、氫鍵、靜電相互作用、離子鍵或共價鍵。

術(shù)語“粘膜粘附”或“粘膜粘附的”如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并且經(jīng)常指的是發(fā)生在聚合物材料與生物組織間的粘附現(xiàn)象，所述生物組織可以包括細(xì)胞表面、細(xì)胞表面的粘液或覆蓋粘膜的粘液凝膠層。因為粘蛋白存在于膀胱的尿路上皮表面，所以含有粘膜粘附官能團的dHPG可用于將靶向藥物遞送至膀胱表面以及其他的粘膜。

通常，本文所述的dHPG具有其包括的“內(nèi)核”，啟動因子(例如三 羥甲基丙烷(TMP))以及超支化聚丙三醇。在一實施方案中，超支化聚丙三醇內(nèi)核可用C₁-C₂₀烷基鏈衍生。在一實施方案中，“內(nèi)核”可裹入“外殼”中，其中外殼包含至少一種與內(nèi)核的羥基結(jié)合的親水性取代基，并且其中超支化聚丙三醇包含約1摩爾-約200摩爾的所述至少一種親水性取代基/摩爾超支化聚丙三醇。

本文所用的“啟動因子”定義為包含烷基組分以及多于一個，但是優(yōu)選多于兩個羥基的小分子。然而，啟動因子可具有三個或四個或更多的羥基。啟動因子的一個實例為三羥甲基丙烷(TMP)。

本文所用的“凝聚的內(nèi)核”定義為其中與內(nèi)核的邊緣相比，C₁-C₂₀烷基鏈與丙三醇單元的比率在內(nèi)核中心更大的內(nèi)核。例如，C₁₀烷基鏈可摻入至該結(jié)構(gòu)中從而使得遍及整個的超支化結(jié)構(gòu)，相對于丙三醇，它并不是均勻分布的，而是它的分布使得它在超支化內(nèi)核結(jié)構(gòu)的中心(例如鄰近啟動因子)中比靠近它的邊緣緊鄰于外殼的取代基更凝聚。內(nèi)核體系結(jié)構(gòu)為“凝聚的”的程度可通過試劑的添加而控制。術(shù)語“中心的”可定義為具有零體積點的精確的中心?？蛇x擇地，dHPG可具有半徑“r”，其中具有半徑“rc”的中心體積中烷基與丙三醇的比率比dHPG整體中烷基與丙三醇的總比率更大，其中rc<r。

對“常規(guī)的”或“正常的”內(nèi)核而言，丙三醇環(huán)氧化物(超支化組分單體)與烷基環(huán)氧化物(其給予內(nèi)核疏水性)于反應(yīng)自始至終可以恒定的比率增加。對凝聚的內(nèi)核而言，烷基環(huán)氧化物在反應(yīng)的最早期以較高的比例增加并且在反應(yīng)的后期以較低的比例(低至零)減少。這一減少可連續(xù)地發(fā)生或以不連續(xù)的階段發(fā)生，存在著兩個不連續(xù)的階段的最小量。

內(nèi)核體系結(jié)構(gòu)可在組分添加的比率方面定義。例如，凝聚的內(nèi)核聚合物可以多步驟合成，每一步驟具有確定比率的內(nèi)核單體，一個為丙三醇環(huán)氧化物并且另一個為疏水性烷基環(huán)氧化物?？赏ㄟ^早期步驟中添加與后期或最后步驟中所添加的組分的比率相比具有更高比率的烷基環(huán)氧化物制造凝聚的內(nèi)核分子?？蛇x擇地，比率可能在隨時間進程中改變，從而使得對反應(yīng)期間第一的(或早期的)時間段而言，添加更高的烷基環(huán)氧化物與丙三醇環(huán)氧化物的比率，所述比率比后期時間 段中所添加的比率高。在這一方法中，比率在整個反應(yīng)中隨著梯度不斷地變化。

聚合物剩余的羥基可用諸如MePEG或PEG的其他親水性取代基“衍生”以形成親水性外殼，其包括具有羥基、羧基、胺(其包括一級的、二級的以及三級的胺)NHS、醚、巰基、鹵素、硫醚、酯、硫酯、酰胺、琥珀酰亞胺以及其他類似的官能團的取代基。外殼形成期間，外殼取代基的部分可能與位于朝著聚合物中心的羥基反應(yīng)。即使此類反應(yīng)發(fā)生，內(nèi)核仍維持它的疏水性特征。

如本文所用的，術(shù)語“兩性的”或“兩性的聚合物”如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并且經(jīng)常指的是單一的分子中疏水性與親水性部分二者的存在。疏水性指的是任一物質(zhì)或其部分，其在非極性溶劑中比在極性溶劑中更可溶的?？赏ㄟ^分子中包含非極性基團給予疏水性，所述非極性基團包括但不限于長鏈飽和的與不飽和的脂肪族烴基團并以及通過一個或多個芳族的、脂環(huán)族的或雜環(huán)的基團所取代的此類基團。親水性指的是任一物質(zhì)或其部分，其在極性溶劑中比在非極性溶劑中更可溶的。親水性特征衍生自極性或帶電荷的基團的存在，所述極性或帶電荷的基團諸如碳水化合物、磷酸酯、羧基的、硫酸根、氨基的、巰基、硝基、羥基以及其他類似的基團。親水性部分可包含MePEG、胺、羧酸或NHS。

術(shù)語“聚乙二醇”或“PEG”如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并且經(jīng)常指的是具有分子量約200-約20,000的此類化合物，所述分子量取決于聚合物鏈中環(huán)氧乙烷單元的數(shù)量。優(yōu)選的分子量為約200-約400，約200-約1000以及約200-約2000，盡管約2000-約8000的分子量也可使用。

術(shù)語“甲氧基聚(環(huán)氧乙烷)”或“MePEG”如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并且經(jīng)常指的是具有約350-約10,000分子量的此類化合物，所述分子量取決于聚合物鏈中環(huán)氧乙烷的數(shù)量。優(yōu)選的分子量為約350-約550，約350-約750，以及約350-約2000，盡管約2000-約5000的分子量也可使用。

短語“局部的或靶向遞送”如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并 且經(jīng)常指的是化合物直接遞送至有機體中靶位點。

在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可用于局部的或靶向治療泌尿道(例如尿道和膀胱)、消化道(例如口、食道以及結(jié)腸)、氣道(例如鼻和肺)、陰道腔和子宮頸以及腹膜腔的適應(yīng)癥以治療適應(yīng)癥，諸如癌癥(例如，膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉癌、口腔癌、竇癌、陰道癌或子宮頸癌)、感染(例如，消化道或氣道感染)，和炎癥性或自身免疫性疾病(例如，刺激性膀胱、炎癥性腸疾病或慢性或急性炎癥)以及其他的適應(yīng)癥，其中要求將藥物或其他的生物活性部分遞送至組織或細(xì)胞。例如，如本文所述的dHPG可用于非肌層侵潤性膀胱癌的局部的或靶向治療。在一些實施方案中，如本文所述的聚合物可用于藥物或組合物的制備，所述藥物或組合物用于一種或多種本文所列的適應(yīng)癥(例如非肌層侵潤性膀胱癌)的局部或靶向治療。本發(fā)明的一些方面使用包含本文所述的dHPG的組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。也提供了治療一種或多種本文所列的適應(yīng)癥(例如非肌層侵潤性膀胱癌)的方法。此類方法可包括給予需要其個體如本文所述的dHPG或如本文所述的dHPG的組合物，或如本文所述的dHPG或如本文所述的dHPG的組合物的有效量，其中將生物活性劑摻入dHPG。

在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可用作預(yù)處理或聯(lián)合治療以增加組織內(nèi)藥物攝取。在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可用作預(yù)處理或聯(lián)合治療以增加藥物的藥物攝取，所述藥物用于局部的或靶向治療泌尿道(例如尿道和膀胱)、消化道(例如口、食道以及結(jié)腸)、氣道(例如鼻和肺)、陰道腔和子宮頸以及腹膜腔的適應(yīng)癥以治療適應(yīng)癥，諸如癌癥(例如，膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉癌、口腔癌、竇癌、陰道癌或子宮頸癌)、感染(例如，消化道或氣道感染)，和炎癥性或自身免疫性疾病(例如，刺激性膀胱、炎癥性腸疾病或慢性或急性炎癥)以及其他的適應(yīng)癥，其中要求將藥物或其他的生物活性部分遞送至組織或細(xì)胞。例如，如本文所述的dHPG可作為預(yù)處理或聯(lián)合治療使用以增加用于局部或靶向治療非肌層侵潤性膀胱癌的藥物的藥物攝取。在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可作為用于增加組織內(nèi)藥物攝取的預(yù)處理使用。在一些實施方案中，如本文所述的dHPG 可作為用于增加組織內(nèi)藥物攝取的聯(lián)合治療使用。在一實施方案中，作為聯(lián)合使用的dHPG的用途可包括其中在用藥物或生物活性部分治療期間，藥物或生物活性部分沒有負(fù)載在dHPG中。在一實施方案中，作為聯(lián)合使用的dHPG的用途可包括其中在用藥物或生物活性部分治療期間，部分或所有的藥物或生物活性部分都負(fù)載在dHPG中。在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可作為用于增加組織內(nèi)藥物攝取的預(yù)處理和聯(lián)合治療使用。在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可作為用于增加組織內(nèi)藥物攝取的預(yù)處理和聯(lián)合治療使用，與缺少預(yù)處理或聯(lián)合治療時組織中藥物攝取比較。在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可作為用于增加組織內(nèi)藥物攝取的預(yù)處理和聯(lián)合治療使用而沒有引起組織的壞死和/或炎癥。在一些實施方案中，增加組織內(nèi)藥物攝取可包括引起雨傘細(xì)胞缺失。在一些實施方案中，增加組織內(nèi)藥物攝取可包括引起雨傘細(xì)胞缺失而沒有引起組織的壞死和/或炎癥。在一些實施方案中，雨傘細(xì)胞可為膀胱的尿路上皮表面的雨傘細(xì)胞。“增加藥物攝取”的表達如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的使用并且經(jīng)常指的是增加細(xì)胞或組織中藥物的濃度或積聚。

在一些實施方案中，可在藥物攝取的平均濃度(Cavg)增加方面測量藥物攝取增加，利用作為預(yù)處理或聯(lián)合治療的dHPG，與沒有預(yù)處理或聯(lián)合治療時藥物攝取的濃度比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可在組織深度的不同范圍或點上測量濃度。例如可在組織深度的0>3350,0>1500,200>3350,或200>1500μm范圍測量濃度。在一實施方案中，伴隨作為預(yù)處理或聯(lián)合治療的dHPG使用，藥物攝取的濃度可增加1.3-4.0,1.8-2.8,1.3-2.4,2.0-2.6,1.5,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3.0,3.2,3.4,3.6,3.8或4.0倍，與沒有預(yù)處理或聯(lián)合治療時藥物攝取的濃度比較。在一些實施方案中，可在藥物攝取的峰值濃度(Cmax)增加方面測量藥物攝取增加，利用作為預(yù)處理或聯(lián)合治療的dHPG，與沒有預(yù)處理或聯(lián)合治療時藥物攝取的濃度比較。在一實施方案中，伴隨作為預(yù)處理或聯(lián)合治療的dHPG使用，藥物攝取的濃度可增加1.3-4.0,1.8-2.8,1.3-2.4,2.0-2.6,1.5,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3.0,3.2,3.4,3.6,3.8或4.0倍，與沒有預(yù)處理或聯(lián)合治療時藥物攝取的峰值濃度比較。在一些實 施方案中，可在藥物攝取的曲線下面積(AUC)(x-y)增加方面測量藥物攝取增加，利用作為預(yù)處理或聯(lián)合治療的dHPG，與沒有預(yù)處理或聯(lián)合治療時藥物攝取的曲線下面積(x-y)比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可在組織深度的不同范圍或點上測量曲線下面積(x-y)。例如可在組織深度的0>無限,0>3350,0>1500,200>無限,200>3350或200>1500μm范圍測量曲線下面積(x-y)。在一實施方案中，伴隨作為預(yù)處理或聯(lián)合治療的dHPG使用，藥物攝取的曲線下面積(x-y)可增加1.3-4.0,1.8-2.8,1.3-2.4,2.0-2.6,1.5,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3.0,3.2,3.4,3.6,3.8或4.0倍，與沒有預(yù)處理或聯(lián)合治療時藥物攝取的曲線下面積(x-y)比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解存在用于測量藥物攝取增加的可選擇的方法，例如滲透性增強比，R，計算方法為預(yù)處理或聯(lián)合治療存在以及不存在時滲透性的系數(shù)，如可使用Grabnar等，(International Journal of Pharmaceutics 256(2003)167-173)所報道的。

在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可以為溶劑添加形式。dHPG可與溶劑、水和/或緩沖液的非化學(xué)計量有關(guān)，通常表示成重量或容積百分比。例如，并且不限于，溶劑可為藥學(xué)上可接受的溶劑或其他的生物相容性溶劑，其包括乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇200(PEG200)、聚乙二醇300(PEG300)、環(huán)氧二元醇(Transcutol)或Solutol。

如本文所述的dHPG包括所有可能的立體化學(xué)的替代選擇，其包括示例或本文所述的那些。

在一些實施方案中，如本文所述的dHPG包括諸如具有不同支鏈模式的幾何異構(gòu)體的同分異構(gòu)體。通過本文所公開的方法合成的dHPG為隨機分支的HPG并且將包含丙三醇單體，所述丙三醇單體為充分反應(yīng)的，例如以三個方向連接，或部分反應(yīng)的，以一個或兩個方向連接另外的單體。可通過分析技術(shù)(例如2D NMR HSQC實驗)確認(rèn)每一分支的體系結(jié)構(gòu)的存在。

根據(jù)本文所述的一些實施方案，組合物與dHPG可以任一各種已知的途徑給藥。dHPG可作為下列形式給藥：膀胱內(nèi)計量溶液或其他的引起灌洗功能的組合物(其包括口服灌洗、腹膜內(nèi)沖洗溶液或用于鼻 或陰道腔的沖洗)、滴眼劑、待被吞食的口服溶液、氣霧劑、或作為噴霧用于吸入的溶液、或作為半固體待被插入至緊鄰諸如粘膜表面的生物組織。

應(yīng)理解限制本文所述的摻入藥物或其他的生物活性劑的dHPG遞送至靶組織或要求藥物遞送的細(xì)胞是潛在有利的。例如預(yù)期所述的摻入生物活性劑的dHPG選擇性遞送至患有或懷疑患有非肌層侵潤性膀胱癌個體的膀胱尿路上皮表面可提供治療效應(yīng)而不在身體的其他組織中產(chǎn)生顯著的副作用。可適用于如本文所述的摻入紫杉烷的dHPG給藥的一方法實例為膀胱內(nèi)灌注。膀胱內(nèi)灌注也為適用于如本文所述的dHPG給藥的一方法實例，所述dHPG給藥用于作為預(yù)處理或聯(lián)合治療以增加組織藥物攝取。膀胱內(nèi)灌注為憑借將溶液插入至諸如膀胱的囊的一種藥物遞送手段。在遞送至膀胱中，溶液通常借助插入的導(dǎo)管穿過尿道至膀胱給藥。灌注溶液，通常停留在膀胱內(nèi)一段時間，諸如約1小時或約2小時。灌注的通常容量為約10mL-約50mL的范圍。停留時間后，將抽空溶液容量以及任何累積的已稀釋了溶液的尿液以結(jié)束程序。停留時間代表膀胱內(nèi)治療期間最大的藥物暴露時間，因為在抽空步驟期間除去了藥物的大多數(shù)。其他的組合物或促進使組織遞送局部化的方法的實例對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。例如，如本文所述的可使用的dHPG可在藥物組合物中，其中dHPG在dHPG內(nèi)核中包含紫杉烷或其他的疏水性藥物，連同第二種藥物，所述藥物也可配制至HPG中，或第二種藥物可與dHPG在溶液中組合用于遞送。而且，dHPG可與靶向劑(例如，表皮生長因子受體的抗體，其在膀胱腫瘤、赫賽汀(Herceptin)或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)中過表達)組合。

可通過本領(lǐng)域已知的方法配制適合的藥物組合物并且通過技術(shù)人員確定它們的給藥模式和劑量。對膀胱內(nèi)灌注而言，摻入生物活性劑的dHPG可溶解于灌注媒介或緩沖系統(tǒng)以控制pH處于有利的水平，諸如約pH6-8，或另外適合的范圍，例如約pH4-6或約pH8，所述灌注媒介諸如水、含水的共溶劑系統(tǒng)、諸如生理鹽水或水中5％右旋糖的等滲的水溶液?？煽刂苝H處于特定的范圍以提供利于最佳化藥物釋放動力學(xué)、藥物穩(wěn)定性、最大的粘膜粘附、最大的溶解度或其組合。 也預(yù)期用于可溶于水的藥物遞送系統(tǒng)給藥的其他藥學(xué)上可接受的媒介。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多技術(shù)描述于Remington-The science and practice of pharmacy”(雷明頓-藥物科學(xué)與實踐),20th Edition(第20版),Jennaro等(Phila,Lippencott,Williams,and Wilkens,2000)。

如本文所用的藥物組合物的“有效量”包括治療上有效量或預(yù)防上有效量。“治療上有效量”指的是劑量有效的并且持續(xù)必要的一段時間的量以獲得理想的治療結(jié)果，諸如減少癌細(xì)胞增殖、延長壽命或延長預(yù)期壽命。摻入生物活性劑的dHPG的治療上有效量可根據(jù)因素而變化，諸如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個體的體重、以及生物活性劑引起個體內(nèi)期望的反應(yīng)的能力?？烧{(diào)整給藥方案以提供最佳的治療反應(yīng)。治療上有效量也為其中治療上有利作用超過任何制劑的毒性或有害作用的量?！邦A(yù)防上有效量”指的是劑量有效的并且持續(xù)必要的一段時間的量以獲得理想的預(yù)防結(jié)果，諸如預(yù)防或適應(yīng)癥進展的預(yù)防。通常在疾病之前或疾病的較早期，個體中使用預(yù)防劑量。

應(yīng)注意的是劑量值可隨著待被緩解的狀況的嚴(yán)重性而變化。對任一特別的個體而言，特定的給藥方案可根據(jù)個人需要和給藥或監(jiān)管組合物給藥的人員的專業(yè)判斷隨時間調(diào)整。組合物的量可根據(jù)因素諸如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個體的體重而變化?？烧{(diào)整給藥方案以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可快速灌注方式給藥，可隨時間分次劑量給藥或劑量可如治療情況的緊急狀態(tài)所示的按比例地減少或增加。以劑量單位形式配制組合物有利于減輕劑量給藥及一致性。

在一些實施方案中，如本文所述的dHPG可用于，例如并且不限于，與其他的治療方法聯(lián)合。例如，如本文所述的摻入生物活性劑的dHPG可與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他的治療聯(lián)合，作為新輔助的(之前)、附加的(期間)，和/或輔助的(之后)治療使用。

通常，如本文所述的dHPG可用于減少毒性。可利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)確定本文所述的dHPG的毒性，例如通過測試細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镆约按_定治療指數(shù)，即LD50(50％群體致死的劑量)與LD100(100％群體致死的劑量)間的比率。在某些情況下，然而，諸如在嚴(yán)重的疾病狀況下，需要給予大量超額的組合物。在某些濃度時，本發(fā)明的一些dHPG為有毒的。滴定法研究可用于確定有毒的與無毒的濃度。通過檢查特別的dHPG或組合物對細(xì)胞系的特異性評估毒性。動物研究也可用于提供聚合物是否具有對其他組織任何作用的指征。

可給予個體如本文所述的dHPG。如本文所用的，“個體”可為人類、非人類的靈長類動物、大鼠、小鼠、牛、馬、綿羊、山羊、狗、貓等。可懷疑個體患有或處于患有癌癥或其他的與具有粘膜表面的組織有關(guān)的疾病的危險中。此類適應(yīng)癥可為泌尿道(例如尿道和膀胱)、消化道(例如口、食道以及結(jié)腸)、氣道(例如鼻和肺)、陰道腔和子宮頸以及腹膜腔。癌癥(例如，膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉癌、口腔癌、竇癌、陰道癌或子宮頸癌)、感染(例如，消化道或氣道感染)，和炎癥性或自身免疫性疾病(例如，刺激性膀胱、炎癥性腸疾病或慢性或急性炎癥)以及其他的適應(yīng)癥可為本文所述的dHPG的理想的靶標(biāo)，所述dHPG用于藥物或其他的生物活性部分遞送。用于癌癥、感染以及炎癥或性或自身免疫性疾病的診斷方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些。

例如，本文所述的dHPG可用于非肌層侵潤性膀胱癌的治療。本文所述的dHPG可用于藥物制備，所述藥物用于非肌層侵潤性膀胱癌的治療。本文所述的dHPG可用于治療非肌層侵潤性膀胱癌的方法中。所述方法包含給予需要其的個體有效量的本文所述的摻入生物活性劑(例如紫杉烷)的dHPG。例如，本文所述的dHPG可作為預(yù)處理或聯(lián)合治療使用以增加藥物的藥物攝取，所述藥物用于非肌層侵潤性膀胱癌的治療。

參考已知的化學(xué)合成原則，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解制備或合成本文所述的dHPG的方法。例如WO2006/130978描述了適合的合成程序，所述程序可被認(rèn)為是或者適當(dāng)?shù)貙⑵湔{(diào)整以制備本文所述的聚合物。

用于dHPG的化學(xué)合成的通常的方法描述于下列非限制的示例性方案：

第二步，單體的添加，進一步地通過22-24小時內(nèi)添加單體速率所定義。對凝聚的內(nèi)核聚合物而言，烷基環(huán)氧化物的添加速率在反應(yīng)期的早期較快而丙三醇環(huán)氧化物的添加速率在反應(yīng)期的早期較慢。然而，不要求調(diào)整添加速率，只要組分的比率利于烷基組分在反應(yīng)的早期的添加，相對于晚期。

本文描述了各種可選擇的實施方案與實施例。這些實施方案與實施例為示例性并且不應(yīng)理解為限制了本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1：衍生的HPG的合成與特征

所有的化學(xué)藥品均購于Sigma-Aldrich Canada Ltd(Oakville,Canada)并且沒有進一步的純化使用。所有的溶劑為來自于Fisher Scientific(Ottawa,Canada)的高效液相色譜(HPLC)等級并且沒有進一步的純化使用。

在配有機械攪拌器的三頸圓底燒瓶中進行聚合作用。第二個頸連接至雙歧管史蘭克線，以及第三個靠近穿過其添加試劑的橡膠隔片。典型的用于HPG-C_8/10-MePEG聚合反應(yīng)的程序如下。在氬氣氣氛下， 向燒瓶添加啟動因子三羥甲基丙烷(TMP)，然后添加含甲醇鉀的甲醇溶液(20wt％)。利用磁性攪拌棒攪拌混合物15分鐘，然后在真空中除去過量的甲醇。保持燒瓶在95℃下油浴中，并且利用注射泵在12小時內(nèi)逐滴添加縮水甘油。單體添加結(jié)束后，再攪拌混合物5小時。然后添加辛基/癸基縮水甘油醚并且攪拌混合物24小時以形成HPG-C_8/10。在12小時內(nèi)逐滴添加MePEG350至該混合物然后再攪拌5小時。MePEG優(yōu)選于PEG，因為MePEG的甲基保護單體的一端從而使得單體沒有變成二價的，所述二價的可能導(dǎo)致dHPG分子間交聯(lián)。也關(guān)注其他的保護基，包括合成后可以除去的那些。用這種方式，可與表面上的PEG鏈制備HPG，這可通過添加其他的化學(xué)基團或生物分子進一步地修飾，所述生物分子包括肽、糖肽、蛋白等?？尚薷谋境绦蛞院铣刹煌腍PG，例如縮水甘油添加后可添加1,2-環(huán)氧十八烷至混合物以形成HPG-C₁₈。

然后將產(chǎn)物溶解于甲醇并且通過將其穿過陽離子交換柱(Amberlite^TMIRC-150)三次使其中和。通過己烷萃取除去未反應(yīng)的辛基/癸基縮水甘油醚。除去甲醇，利用醋酸纖維素透析袋(MWCO:1000g/mol,Spectrum Laboratories Inc.)，水作參比，伴隨三次水變化/天，透析聚合物三天。然后通過冷凍干燥和熱干燥獲得干燥的聚合物。

可修改本程序以便合成凝聚的內(nèi)核dHPG，其中烷基鏈為集中朝著聚合物的中心，代替常規(guī)的內(nèi)核dHPG，其中遍及聚合物隨機置放烷基鏈。通過以不同的速率和/或不同的比例將丙三醇環(huán)氧化物與烷基單體添加至反應(yīng)混合物修飾聚合物的內(nèi)核。為了形成凝聚的內(nèi)核dHPG，在丙三醇環(huán)氧化物添加結(jié)束之前添加所有烷基單體，從而使得超支化結(jié)構(gòu)的表面部分不包含任何烷基組分。反而烷基組分位于朝著HPG的內(nèi)核。

通過首先制備如上文所述的HPG-C_8/10合成HPG-C_8/10-COOH。方案II顯示了羧酸官能團的添加與HPG-C_8/10的反應(yīng)：

添加吡啶(50mL)至HPG-C_8/10(0.5g)并且快速攪拌以溶解聚合物。添加二甲氨基吡啶(0.2g,0.0016摩爾)，然后緩慢添加琥珀酸酐(12g,0.12摩爾)。室溫下(大約22℃)攪拌過夜反應(yīng)。添加水(100mL)并且攪拌混合物30分鐘。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，伴隨周期性添加水，除去溶劑，通過共沸蒸餾以使吡啶能夠更好地蒸發(fā)。將殘余物溶解于甲醇并且利用Spectra/Por透析膜(MWCO:3500g/mol)，蒸餾水作參比，透析16小時。改變透析介質(zhì)四次，每次用更高的甲醇濃度。透析介質(zhì)的最終組合物為含70％甲醇的蒸餾水。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑并且在真空烘箱中干燥聚合物過夜。

方案II顯示了試圖添加琥珀酰亞胺基碳酸酯至HPG-C_8/10的第一反應(yīng)方案。簡單地說，真空、110℃下干燥HPG-C_8/10然后冷卻至室溫。添加乙腈與DCM以溶解聚合物。然后添加N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯至燒瓶。排空燒瓶然后用氬氣凈化并且允許反應(yīng)在添加吡啶后室溫下過夜進行。反應(yīng)后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大多數(shù)乙腈。添加甲基叔丁基醚以沉淀聚合物。輕輕倒出上清液并且添加DCM以溶解聚合物。穿過10-15μm布氏漏斗(Buchner funnel)過濾物質(zhì)以獲得澄清的溶液，將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DCM。添加MTBE以沉淀聚合物。真空室溫下干燥最終的HPG-C_8/10-NHS產(chǎn)物。

在顯示了第一次嘗試由此得到的高反應(yīng)性、達到甚至儲存在-20℃也不穩(wěn)定，導(dǎo)致基質(zhì)交聯(lián)的程度的HPG-C_8/10-NHS后，嘗試第二合成途徑。方案IV顯示了嘗試用于HPG-C_8/10-NHS產(chǎn)生的第二反應(yīng)方案。合成涉及產(chǎn)生如上文所述的作為中間體的HPG-C_8/10-COOH，然后進一步地將其與NHS反應(yīng)以產(chǎn)生HPG-C_8/10-COOH-NHS。

HPG-C_8/10與琥珀酸酐溶解于吡啶中并且在室溫下反應(yīng)24小時，二甲氨基吡啶(DMAP)作為催化劑。通過添加等量的水終止反應(yīng)并且通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液除去吡啶。透析HPG-C_8/10-COOH的水溶液72小時(MWCO:3500g/mol)以除去殘余的溶劑，并且冷凍干燥。進一步地在室溫下將二甲基甲酰胺(DMF)中的HPG-C_8/10-COOH與N-羥基琥珀酰胺(NHS)反應(yīng)24小時，N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作為催化劑。在反應(yīng)的最后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DMF。如上文所述的分離產(chǎn)物。用MTBE沉淀，乙腈中過濾，干燥之前用MTBE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及沉淀。

利用下列的，方案V中所總結(jié)的程序產(chǎn)生具有各種胺密度的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂批次。各種試劑的化學(xué)計量學(xué)用于每一批次，表1中所述。

將HPG-C_8/10-MePEG(4g)溶解于15ml無水1,4-二氧己環(huán)。用己烷漂洗氫化鉀(0.45g)三次并且在真空下干燥。聚合物溶液與KH組合并且在室溫下攪拌直至形成澄清的溶液，大約20％HPG-C_8/10-MePEG上的OH基為去質(zhì)子化的。通過溶解于二氯甲烷干燥N-(2,3-環(huán)氧丙基)鄰苯二甲酰亞胺)(EPP)(1.184g)并且與Na₂SO₄或MgSO₄攪拌過夜。過濾溶液并且在真空下干燥以除去二氯甲烷。將干燥的EPP溶解于無水1,4-二氧己環(huán)并且添加至聚合物，約85-90℃下攪拌過夜。通過將其穿過陽離子交換柱(Amberlite^TMIRC-150)三次中和產(chǎn)物然后自乙醚沉淀三次以除去未反應(yīng)的EPP。通過NMR，將15.5％苯鄰二甲酰亞胺加入HPG-C_8/10-MePEG。通過肼解作用實現(xiàn)苯鄰二甲酰亞胺功能的剪切(用水合肼回流)。添加過量的水合肼溶液(2mL)至含聚合物的甲醇溶液并且將混合物回流48小時?；亓骱?，蒸發(fā)甲醇，利用MWCO:1000g/mol膜透析48小時，水作參比并且冷凍干燥。

表1用于產(chǎn)生HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的試劑化學(xué)計量學(xué)

通過NMR、FTIR、DSC以及TGA表征獲得的聚合物。NMR特別適用于確定支鏈結(jié)構(gòu)和添加至聚合物外殼的表面基團的存在。對一些表面化學(xué)而言，F(xiàn)TIR分析也用于確定羥基與它們被其他基團替代的消耗量，其中那些基團的化學(xué)提供了來自于其余的HPG結(jié)構(gòu)的獨特的紅外光譜(IR spectrum)，例如C＝O鍵的添加。例如，F(xiàn)TIR可用于確定-COOH基團添加至表面或通過酯鍵的基團添加。

實施例2：紫杉醇或多西紫杉醇封裝至dHPG

紫杉醇或多西紫杉醇連同dHPG可溶解于少量的乙腈中并且在60℃下烘箱內(nèi)干燥1小時，然后用氮氣流閃耀以清除有機溶劑的痕跡。由此得到的dHPG/紫杉醇或dHPG/多西紫杉醇基質(zhì)可與10mM磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)形成水合物，渦旋2分鐘，60℃下烘箱內(nèi)孵育1小時。由此得到的溶液通常為澄清的。在那些觀察到白色沉淀的實例中，離心溶液(18000g,10分鐘)并且將上清液轉(zhuǎn)移至新的容器，保持在陰涼處直至使用。

實施例3：dHPG中多西紫杉醇與紫杉醇的穩(wěn)定性

在DTX對失活的分解產(chǎn)物降解以及生物活性差向異構(gòu)體(“7-表-DTX”)的互變現(xiàn)象方面表征摻入至dHPG的多西紫杉醇(“DTX”)的穩(wěn)定性。已知紫杉醇與多西紫杉醇差向異構(gòu)體的形成以均衡的形式出現(xiàn)而失活的分解產(chǎn)物的降解為不可逆的。利用超高效液相色譜(UPLC)分析各種dHPG中所述的穩(wěn)定性。Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱(2.1x50mm,1.7μm)用于主要降解峰的分離。注射量為3μL。流動相為10mM醋酸銨溶液，其通過稱量0.385g鹽并將它溶解于500mL HPLC等級的水制備。利用醋酸將pH調(diào)至pH4.0。在甲醇中制備DTX的儲備溶液(2mg/mL)并且儲存在-20℃冰箱。一組含DTX的標(biāo)準(zhǔn)液制備于在0.5-100μg/mL范圍的50/50甲醇/水。檢測限度(LOD)與定量限度(LOQ)為1μg/mL。1-100μg/mL的校正曲線與DTX的0.9998R²成線性關(guān)系。應(yīng)用A 1/x加權(quán)。在LOQ(1μg/mL)與中距(10μg/mL)處驗證方法準(zhǔn)確度與精密度。在每個實例中，進行5次重復(fù)注射。表2總結(jié)了在DTX這些濃度處所獲得的準(zhǔn)確度與精密度。

表2通過UPLC檢測DTX所獲得的準(zhǔn)確度與精密度

進行DTX的強迫降解以產(chǎn)生用于方法特異性評估的樣品。通過制備含300μL的甲醇、150μL的5％氫氧化銨以及50μL的儲備的DTX前體藥物的溶液實現(xiàn)DTX的降解，所述DTX前體藥物在堿性pH下幾分鐘內(nèi)降解為DTX。監(jiān)測DTX前體藥物轉(zhuǎn)化為DTX以及DTX降解兩個多小時。2.2小時實驗(室溫)后，所有的前體藥物有效地降解為DTX和其他的組分。利用上文所述的方法分析降解的樣品以確定DTX前體藥物、DTX以及相關(guān)的降解產(chǎn)物的分辨率。

利用以上的UPLC方法，DTX為2.99分鐘處的洗脫液并且7-表-DTX為3.15分鐘處的洗脫液。樣品色譜顯示于圖1中。1.4-2.0分鐘的峰值為DTX與7-表-DTX的降解產(chǎn)物。根據(jù)時間計算DTX與7-表-DTX峰面積，然后用于確定殘留在dHPG中DTX或表-DTX的百分比。結(jié)果顯示于圖2中。如圖2中可見到的，當(dāng)HPG聚合物為HPG-C_8/10與HPG-C_8/10-MePEG時，那些包含DTX的制劑為穩(wěn)定的，所述制劑在緩沖至pH7.3PBS中，經(jīng)過72小時，以DTX與7-表-DTX的形式保留超過90％摻入的DTX。藥物的殘余量已降至使組分失活并且通過質(zhì)譜分析法MRM實驗鑒定這些，這些的每個都貢獻出多于2％的總樣品數(shù)。這些實驗旨在鑒定與DTX已知的降解產(chǎn)物有關(guān)的離子片段。

分別在圖3A與3B中比較含DTX與7-表-DTX離子(+H⁺)m/z808.5的HPG-C_8/10與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂制劑的單一離子記錄(SIR)。色譜圖顯示了7-表降解產(chǎn)物的存在，盡管它以更大的比例存在于HPG-MePEG-NH₂樣品中。對圖3A與3B而言，最高的峰為DTX而較低的峰為7-表-DTX。盡管總離子色譜圖由于制劑中聚合的成分顯示了非常高的信號(圖4)，鑒定已知匹配DTX降解片段的附加質(zhì)量(Kumar等，2007，多西紫杉醇藥物物質(zhì)中降解雜質(zhì)及其制劑的分離與特征，Kumar等,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 12 March 2007 43(4):1228-1235)，與最大的降解產(chǎn)物峰一致。在1.5分鐘處觀察到226與282的M/z，這對應(yīng)來自DTX側(cè)鏈的片段。然而，存在583的m/z，這對應(yīng)10-脫乙酰巴卡亭III+K⁺，表明紫杉烷包含內(nèi)核與側(cè)鏈二者。也觀察到320與562的M/z。2分鐘處的峰具有m/z＝581和583，這可分別對應(yīng)10-氧-10-脫乙酰巴卡亭III+K⁺和10-脫乙酰巴卡亭III+K⁺。該峰值位置也在其中期望觀察到巴卡亭降解產(chǎn)物的色譜圖區(qū)域內(nèi)。

可通過調(diào)節(jié)制劑的pH進一步地增加一些制劑的穩(wěn)定性。例如，含摻入DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的組合物，按比例與緩沖鹽溶解于水介質(zhì)以便獲得pH5.5-6.5，比相同的不包括緩沖鹽的組合物或具有改變的緩沖鹽組合物的組合物，例如產(chǎn)生pH7.4的PBS緩沖液，更穩(wěn)定。適當(dāng)?shù)木彌_鹽包括磷酸鹽緩沖鹽。可選擇地，可通過添加諸如HCl的酸至組合物降低組合物的pH。而且，通過改變組合物的pH顯著減慢DTX的降解。

實施例4：dHPG的體外生物相容性

通過檢測不同的dHPG制劑是否能夠殺死KU7癌細(xì)胞測量dHPG的毒性。利用沒有摻入任何藥物或生物活性部分的dHPG進行這些實驗。結(jié)果顯示于圖7A與7B中。圖7A顯示了KU7細(xì)胞增殖的百分比與HPG-C_8/10的濃度的函數(shù)，對常規(guī)的內(nèi)核制劑和凝聚的內(nèi)核制劑二者而言。改變內(nèi)核體系結(jié)構(gòu)不會顯著地影響HPG-C_8/10的穩(wěn)定性。圖7B顯示了KU-7細(xì)胞的活力與HPG-C_8/10-MePEG的濃度的函數(shù)，對常規(guī)的內(nèi)核制劑和凝聚的內(nèi)核制劑二者而言。與常規(guī)的內(nèi)核聚合物相比，具有凝聚的內(nèi)核聚合物顯示了高于細(xì)胞活力IC50 10倍。具有凝聚內(nèi)核的dHPG對細(xì)胞的耐受性好于具有常規(guī)內(nèi)核的dHPG。凝聚的內(nèi)核制劑對KU-7細(xì)胞的毒性比常規(guī)的內(nèi)核制劑更小。表3顯示了用于制備圖7A與7B中所示制劑的單體的體積比。

表3用于制備圖7A與7B中所示制劑的單體的體積比

圖8顯示了無MePEG外殼的HPG-C_8/10聚合物為其中耐受性最小的，并且無MePEG外殼，自常規(guī)的內(nèi)核改變?yōu)槟鄣膬?nèi)核體系結(jié)構(gòu)在改善細(xì)胞活力方面沒有益處。HPG-OH表示它為表面上無MePEG的HPG。然而，當(dāng)添加MePEG時，益處變得顯而易見的。HPG-C_8/10-MePEG_6.5通式(具有6.5mol MePEG/HPG)顯示比得上HPG-C_8/10的耐受性，當(dāng)比較正常的內(nèi)核版本時，但是當(dāng)使用凝聚的內(nèi)核體系結(jié)構(gòu)時，HPG-C_8/10-MePEG_6.5的耐受性改善了常規(guī)的內(nèi)核HPG-C_8/10-MePEG13的水平，其使外殼中的MePEG的量加倍。早先公開的HPG-MePEG聚合物(Mugabe C等，2008BJUI 103:978-986)也具有更高的MePEG量，盡管沒有對它們定量，估計它們>15mol％并且耐受良好。

實施例5：體外細(xì)胞攝取測定顯示dHPG被運輸至細(xì)胞內(nèi)

檢查KU7細(xì)胞對熒光素標(biāo)記的HPG-C_8/10-COOH-NHS與HPG-C_8/10-COOH的攝取。以1mg/mL將dHPG溶解于無胎牛血清(FBS)基質(zhì)中。在12孔平板的每個平板中，將250μL dHPG暴露于蓋玻片上的細(xì)胞。用PBS洗滌平板兩次然后用含3.7％甲醛的PBS固定10分鐘。再用PBS洗滌平板兩次。利用具有苯基吲哚(DAPI)Prolong Gold^TM固定蓋玻片。

也觀察HPG-C_8/10-COOH的Z電勢以便確定聚合物實際上進入了KU-7細(xì)胞并且不只是留在細(xì)胞表面。因為以所有的觀察角度觀察熒光，所以發(fā)現(xiàn)dHPG在細(xì)胞內(nèi)部。這些結(jié)果顯示dHPG進入了細(xì)胞并且未引起細(xì)胞內(nèi)任何不良反應(yīng)。體外數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)HPG暴露于細(xì)胞時，HPG-C_8/10-COOH-NHS與HPG-C_8/10-COOH以1小時進入。然而，在體內(nèi)，接觸不如體外方案完全，要求延長暴露時間以促進這一攝取。

實施例6：紫杉烷負(fù)載至凝聚的內(nèi)核和常規(guī)的內(nèi)核dHPG

研究凝聚的與常規(guī)的內(nèi)核HPG-C_8/10-MePEG的最大藥物負(fù)載。將DTX與PTX負(fù)載至HPG-C_8/10-MePEG以靶向0.5,1.0,2.0及3.0mg/mL的藥物濃度。制備含100mg/mL聚合物的四氫呋喃(THF)溶液并且添加DTX或PTX。N₂流下干燥THF約2小時，然后在排風(fēng)罩中干燥過夜。HPG-C_8/10-MePEG/PTX和HPG-C_8/10-MePEG/DTX基質(zhì)與PBS緩沖液(pH 7.4)形成水合物。以14000轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)減慢由此得到的溶液約15分鐘。通過HPLC檢測上層清液的液體以獲得封入HPG-C_8/10-MePEG的藥物的濃聚物。結(jié)果顯示于表4中。

表4DTX與PTX至凝聚的內(nèi)核(“CC”)和常規(guī)的內(nèi)核(“RC”)HPG-C_8/10-MePEG的理論與實際負(fù)載

發(fā)現(xiàn)DTX負(fù)載優(yōu)于PTX。

實例例7：HPG-C_8/10與HPG-C_8/10-MePEG的合成及特征

根據(jù)報道的方案(Kainthan,R.K.,Mugabe,C.,Burt,H.M.,Brooks, D.E.,2008.Biomacromolecules 9,886-895)，用基于環(huán)氧化物的開環(huán)聚合反應(yīng)的單一的鍋合成程序進行辛基/癸基縮水甘油醚(O/DGE，C_8/10)內(nèi)核修飾的HPG的聚合作用。

所有化學(xué)品均購于Sigma-Aldrich(Oakville,ON)并且所有溶劑為來自Fisher Scientific(Ottawa,ON)的HPLC等級。從MePEG 350、氫氧化鈉以及環(huán)氧氯丙烷的反應(yīng)合成α-環(huán)氧樹脂、ω-甲氧基聚乙二醇350(MePEG 350環(huán)氧化物)。從Sigma–Aldrich獲得辛基/癸基縮水甘油醚、甲醇鉀以及三羥甲基丙烷(TMP)并且沒有進一步純化使用。

將120mg啟動因子(TMP)與1.5ml甲醇鉀溶液混合在甲醇(25％,w/v)中并且在氬氣下添加至三頸圓底燒瓶。在105℃下攪拌混合物1小時，在之后真空下除去過量的甲醇，然后，利用注射泵，以1.4ml/小時的速率將13ml縮水甘油與9ml O/DGE混合物注射至啟動因子。利用數(shù)字化頭頂攪拌系統(tǒng)(BDC2002)將攪拌速率固定在68轉(zhuǎn)速。單體添加完成后，再將混合物攪拌6小時。通過己烷萃取以除去未反應(yīng)的辛基/癸基縮水甘油醚獲得純化的聚合物。然后將產(chǎn)物溶解于甲醇中并且通過穿過陽離子交換柱(Amberlite IRC-150,Rohmand Haas Co.,Philadelphia,PA)三次中和。真空下除去甲醇然后利用醋酸纖維素透析袋(MWCO 10,000g/mol,Spectrum Laboratories)，水作參比，透析聚合物的水溶液三天，換水三次/天。

¹HNMR(400MHz,D₆-DMSO)δ_H:0.75-0.82(-CH₃,TMP)；0.82-0.91(O/DGE上-CH₃-烷基)；1.16-1.53(-CH₂-,O/DGE上烷基)；2.46(溶劑,D₆-DMSO)；3.16-3.80(-CH與-CH₂-,來自HPG內(nèi)核)；4.8(-OH)。

制備含不同MePEG量的HPG-C_8/10-MePEG并且指定HPG-C_8/10-MePEG_6.5與HPG-C_8/10-MePEG₁₃表示添加供給的MePEG量(分別為6.5與13mol MePEG/HPG摩爾)。以如HPG-C_8/10反應(yīng)類似的方式進行合成，除了在合成的最終步驟中添加不同的MePEG量至反應(yīng)混合物。烷基(R)衍生的HPG-C_8/10-MePEG的一鍋合成反應(yīng)圖解總結(jié)于方案VI中。

將120mg啟動因子(TMP)與1.5ml甲醇鉀溶液混合在甲醇(25％,w/v)中并且在氬氣下添加至三頸圓底燒瓶。在105℃下攪拌混合物1小時，在之后真空下除去過量的甲醇，然后，利用注射泵，以1.4ml/小時的速率將13ml縮水甘油與9ml O/DGE混合物注射至啟動因子。所有縮水甘油與O/DGE的混合物注射后，反應(yīng)繼續(xù)約6小時。然后添加0.1ml氫化鉀(KH)至燒瓶。攪拌混合物1小時，之后利用注射泵，以1.4ml/小時的速率，添加10ml或20ml MePEG 350環(huán)氧化物作為“一鍋”合成法中的最終步驟。根據(jù)HPG上的靶標(biāo)密度添加MePEG 350量(即10ml MePEG 350支持每摩爾HPG上6.5mol MePEG靶標(biāo))。然后增加攪拌速率至90轉(zhuǎn)速并且在105℃下連續(xù)地進行反應(yīng)過夜。通過己烷萃取除去未反應(yīng)的辛基/癸基縮水甘油醚的任何痕跡。產(chǎn)物溶解于甲醇中并且通過穿過陽離子交換柱(Amberlite IRC-150,Rohm與Haas Co.,Philadelphia,PA)三次中和。真空下除去甲醇然后利用醋酸纖維素透析袋(MWCO 10,000g/mol,Spectrum Laboratories)，水作參比，透析聚合物的水溶液三天，換水三次/天以除去未反應(yīng)的MePEG環(huán)氧化物。然后通過冷凍干燥獲得干燥的聚合物。

¹HNMR(400MHz,D₆-DMSO)δ_H:0.75-0.82(-CH₃,TMP)；0.82-0.92(O/DGE上-CH₃-烷基)；1.15-1.55(-CH₂-,O/DGE上烷基)；2.50(溶劑,D₆-DMSO)；3.15-3.80(-CH與-CH₂-,來自HPG內(nèi)核)；3.23(-OCH₃-來自MePEG),3.32(殘留水)；4.8(-OH)。

利用甲醇鉀通過來自于部分去質(zhì)子化的三羥甲基丙烷(TMP)的縮水甘油的陰離子開環(huán)多支鏈聚合作用制備HPG-C_8/10(無MePEG鏈的HPG)。HPG-C_8/10具有許多的末端羥端基，數(shù)量/分子大致等于聚合度。 用C_8/10烷基鏈衍生HPG-C_8/10內(nèi)核以產(chǎn)生疏水性內(nèi)核，以允許藥物負(fù)載，例如紫杉烷。MePEG鏈與HPG上的羥基連接。因為在其他組分反應(yīng)后將MePEG 350環(huán)氧化物添加至聚合反應(yīng)，形成了親水性外殼以增加HPG的水溶解度。

NMR實驗旨在表征HPG聚合物的結(jié)構(gòu)。利用氘化溶劑，通過Bruker Avance 400MHz NMR光譜儀上所記錄的異核單量子相關(guān)譜(HSQC)NMR實驗(Cambridge Isotope Laboratories,99.8％D)估算HPG上的MePEG與烷基鏈的分?jǐn)?shù)。殘留溶劑峰引用化學(xué)位移。利用Sparky(T.D.Goddard and D.G.Kneller,Sparky 3,University of California,San Francisco)分析HSQC光譜。圖9和10顯示了HPG-C_8/10與HPG-C_8/10-MePEG聚合物的代表性質(zhì)子與2維HSQC光譜。將所有峰分配給HPG的結(jié)構(gòu)組分，利用原料光譜作為起始參考(圖10B)。質(zhì)子NMR光譜類似于所報道的那些(Kainthan,R.K.,Janzen,J.,Kizhakkedathu,J.N.,Devine,D.V.,Brooks,D.E.,2008.Biomaterials 29,1693–1704；Kainthan,R.K.,Mugabe,C.,Burt,H.M.,Brooks,D.E.,2008.Biomacromolecules 9,886–895)。HSQC NMR數(shù)據(jù)確認(rèn)HPG結(jié)構(gòu)具有光譜中明顯的分支體系結(jié)構(gòu)的超支化聚合物(圖9和10)。通過HSQC實驗中體積積分計算每一取代基的分?jǐn)?shù)。通過比較MePEG甲氧基與O/DGE甲基的積分和TMP CH₃基積分，計算對每一HPG聚合物而言的O/DGE與MePEG(mol/mol)的分?jǐn)?shù)。HSQC數(shù)據(jù)顯示了未反應(yīng)的環(huán)氧化物單體的缺失(圖10)，這表明通過未反應(yīng)的單體聚合物污染的缺失。

通過具有多角度激光散射檢測的凝膠滲透色譜(GPC-MALLS)確定dHPG聚合物的分子量與多分散性。分子量為約80,000g/mol(表5)。

dHPG的物理化學(xué)特征總結(jié)于表5中。

表5負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-OH與HPG-C_8/10-MePEG的物理特征

¹Tg，取自轉(zhuǎn)化正中心的玻璃化轉(zhuǎn)變。

²Td，取自最大重量損失的降解溫度。

³PTX與DTX在HPG-C_8/10-MePEG的最大負(fù)載能力時負(fù)載。

M_w，通過與MALIS檢測儀連接的凝膠滲透色譜法(GPC-MALLS)所確定的重量平均分子量。

M_w/M_n多分散性。

ND，未確定的。

實施例8：純化方法對dHPG的熱力特性的影響以及對負(fù)載PTX與DTX的dHPG的物理及化學(xué)穩(wěn)定性的影響

通過差示掃描量熱法(DSC)和熱重量分析(TGA)評估純化方法對dHPG的熱力及降解特性的影響。將已經(jīng)過各種純化步驟的聚合物稱為純化的dHPG，所述純化步驟，例如己烷萃取以除去未反應(yīng)的C_8/10烷基鏈，隨后通過陽離子交換柱中和，然后透析。

利用TA儀器DSC Q100及TGA Q50進行熱力分析。通過經(jīng)過以10℃/分，-90℃-85℃溫度范圍內(nèi)的“熱-冷-熱”循環(huán)使在氣密封口鋁鍋中的稱出試樣循環(huán)，獲得DSC產(chǎn)量。以恒定的升溫程序(20.0℃/分-500℃/分)，40ml/min的氣流量(氮氣)進行TGA產(chǎn)量。記錄實時重量百分比和TGA室溫。利用TA通用分析2000軟件(TA Universal Analysis 2000software)(4.2E版本,TA儀器)進行數(shù)據(jù)分析以發(fā)現(xiàn)起始點。利用配備AB104-S平衡的Mettler Toledo DL39Karl Fisher電量計， 通過滴定法確定dHPG的水含量。將已知量的dHPG溶解于無水甲醇中并且用試劑(Sigma)滴定。通過減去來自于無水甲醇的背景讀數(shù)獲得最終的結(jié)果。

隨著MePEG含量自0(HPG-C_8/10)下降至4.6mol MePEG/HPG(表5)，在溫度自-38℃下降至-55℃時，HPG-C_8/10與HPG-C_8/10-MePEG表現(xiàn)出玻璃化轉(zhuǎn)變。觀察到純化方法對dHPG的Tg值沒有影響并且沒有觀察到純化方法對熱穩(wěn)定性的顯著影響。純化的與未純化的dHPG二者在溫度高達300℃時為穩(wěn)定的，沒有熱分解的跡象(表6)。

也評估純化方法對負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-MePEG的物理及化學(xué)穩(wěn)定性的影響。PTX與DTX二者均負(fù)載至純化的或未純化的HPG-C_8/10-MePEG并且通過觀察藥物自PBS(pH 7.4)中沉淀的起始評估物理穩(wěn)定性。通過LC/MS/MS評估化學(xué)穩(wěn)定性以確定PTX與DTX的量以及它們的降解產(chǎn)物。

純化方法影響負(fù)載PTX與DTX的dHPG的物理及化學(xué)穩(wěn)定性。對未純化的聚合物而言，最大可獲得的PTX與DTX負(fù)載量更大并且發(fā)現(xiàn)這些制劑比用純化的HPG所制備的制劑的物理性更穩(wěn)定(表6)。未純化的聚合物所制備的樣品在幾天內(nèi)(>3天)未沉淀，紫杉烷負(fù)載高達5％(w/w)而純化的聚合物所制備的那些及5％(w/w)紫杉烷負(fù)載在幾小時內(nèi)沉淀或就在PBS中組成(表6)。然而，觀察到PTX與DTX在未純化的dHPG中化學(xué)性不穩(wěn)定并且在制劑制備期間大部分紫杉烷降解。約75-80％PTX緊跟著負(fù)載在未純化的HPG-C_8/10-MePEG中就降解，不管其是否為干燥的(聚集的)基質(zhì)或是否在其在PBS(pH 7.4)中重組后(表6)。然而，一旦緩沖液中無進一步的PTX降解發(fā)生，相反，干燥的基質(zhì)中的PTX就繼續(xù)降解24小時。圖11B顯示了來自未純化的HPG-C_8/10-MePEG中PTX制劑的具有對應(yīng)于PTX的峰及源自幾個降解產(chǎn)物形成的其他峰的色譜圖。自干燥溶劑后(例如聚集狀態(tài)下，在PBS中組成之前)就溶解于乙腈的制劑中獲得色譜圖。通過分別具有587及854m/z值的LC/MS/MS鑒定兩個主要的降解產(chǎn)物?；谶@些質(zhì)量及這些峰的相對保留時間，假設(shè)它們的身份分別為巴卡亭III(m/z587,圖11A)和7-表-紫杉酚(m/z 854)。未純化的制劑中也觀察到其他的 降解產(chǎn)物(峰A&B,圖11B)?；谒鼈兊南鄬ΡＡ魰r間，峰面積以及紫杉烷的已知降解機制，據(jù)信峰B(圖11B)為巴卡亭V，其為7-表-巴卡亭III，而據(jù)信峰A為10-脫乙酰-巴卡亭III。然而負(fù)載在純化的聚合物中的紫杉烷，展現(xiàn)了不同的行為。發(fā)現(xiàn)PTX在聚集及溶液中幾天內(nèi)化學(xué)性穩(wěn)定并且在制劑制備期間沒有觀察到主要的降解產(chǎn)物(表6和圖12C)。觀察到PTX與DTX在未純化的HPG中快速降解并且據(jù)信這歸因于未純化的聚合物中堿性雜質(zhì)的存在。最可能的基本雜質(zhì)來自于過量的甲醇鉀及HPG合成期間所添加的氫化鉀。甲醇鉀與氫化鉀二者為強堿并且與聚合物中殘留水分結(jié)合將創(chuàng)造利于C7位置上的差向異構(gòu)作用和PTX的酯剪切的環(huán)境以產(chǎn)生巴卡亭III(或?qū)TX而言，10-脫乙酰-巴卡亭III)(圖11A)。dHPG聚合物在蒸餾水中的pH的測量顯示未純化的聚合物具有堿性pH而純化的聚合物具有酸性pH(由于用Amberlite IRC-150，陽離子交換樹脂處理)，對紫杉烷而言更穩(wěn)定的環(huán)境。已報道了紫杉烷的最大穩(wěn)定性為在3-5pH范圍內(nèi)(Dordunoo,S.K.,Burt,H.M.,1996.Int.J.Pharm.133,191-201；Tian,J.,Stella,V.J.,2010.J.Pharm.Sci.99,1288-1298)。純化的聚合物在這一pH范圍內(nèi)(表6)，因此改善了負(fù)載的紫杉烷的化學(xué)穩(wěn)定性。通過負(fù)載藥物的大多數(shù)降解為比母體紫杉烷更小的并且更加親水的分子(巴卡亭III與巴卡亭V)的事實解釋負(fù)載在未純化的dHPG聚合物中的紫杉烷具有明顯更高的藥物負(fù)載量及更大的化學(xué)穩(wěn)定性，提示這些降解的分子更有效地負(fù)載至dHPG中。

表6聚合物純化對聚合物特性的影響，以及對純化的及未純化的HPG-C_8/10-MePEG₁₃所制備的負(fù)載紫杉烷的制劑的物理與化學(xué)穩(wěn)定性的影響

HPG-C_8/10-MePEG₁₃中¹PTX與DTX負(fù)載量(％,w/w)，也組成等價的水濃度(mg/ml)。

²“聚集的”基質(zhì)表示通過在與PBS緩沖液組成之前溶劑蒸發(fā)制備的負(fù)載紫杉烷的HPG-C_8/10-MePEG₁₃聚合物。對聚集的基質(zhì)而言t＝0為就在其最終的制備步驟之后，干燥以除去溶劑。

實施例9：MePEG衍生作用對dHPG的熱力特性、表面電荷以及顆粒大小的影響

利用Malvern NanoZS顆粒大小分析儀進行顆粒大小與Z電勢分析，每個分析使用DTS0012一次性定徑比色皿。在1mM NaCl中制備濃度15mg/ml的聚合物溶液并且用0.22μm注射器式濾器(PALLAcrodisc具有13mm尼龍膜)過濾。樣品采集參數(shù)為：角度為具有自動衰減的173°反散射；游程數(shù)11(10s/游程)；分散劑為25℃水(粘性0.8872cP，阻力指數(shù)(RI)1.330)；Mark-Houwink參數(shù)A＝0.428及K＝7.67e-05cm²/s。假定dHPG具有與RI＝1.460及0.01吸收的聚乙二醇(PEG)相似的折射率。最終的數(shù)據(jù)代表所有游程的平均值。

具有PTX與DTX負(fù)載的dHPG顆粒大小始終直徑小于10nm， 所述PTX與DTX負(fù)載對HPG-MePEG無影響(未顯示數(shù)據(jù))。負(fù)載HPG的藥物形成小于10nm的非常小的納米顆粒。

HPG表面上MePEG鏈的存在對這些納米顆粒上的總體表面電荷沒有顯著的影響，如通過Z電勢所測量的如下：HPG-C_8/10＝-1.29±0.97mV；HPG-C_8/10-MePEG_6.5＝-0.92±1.68mV；HPG-C_8/10-MePEG₁₃＝0.18±0.16mV。

觀察到隨著遞增的MePEG密度，對玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的影響。分別對HPG-C_8/10聚合物而言，Tg自-37.5℃下降至-45.2℃，對HPG-C_8/10-MePEG_6.5與HPG-C_8/10-MePEG₁₃而言，Tg自-37.5℃下降至-55.4℃(表5)。PTX或DTX負(fù)載也使Tg下降(表5)。

實施例10：dHPG中PTX與DTX的負(fù)載量、量化和穩(wěn)定性以及來自于dHPG的PTX與DTX的釋放

將PTX或DTX與dHPG溶解于含1ml乙腈溶液的4ml小瓶中并且在烘箱中60℃下干燥1小時，氮氣閃耀以清除有機溶劑的痕跡。由此得到的dHPG/紫杉烷基質(zhì)與1ml 50℃下溫?zé)岬?0mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)形成水合物并且渦旋2分鐘。由此得到的溶液通常為澄清的但是如果在其中觀察到白色顆粒，離心溶液(18,000×g 10分鐘)并且將上清液轉(zhuǎn)移到新的小瓶。

通過如早先所述的反相HPLC確定PTX與DTX摻入至HPG的量(Jackson,J.K.,Smith,J.,Letchford,K.,Babiuk,K.A.,Machan,L.,Signore,P.,Hunter,W.L.,Wang,K.,Burt,H.M.,2004.Int.J.Pharma.283,97-109)。將100μl dHPG/PTX或DTX溶液與900μl乙腈/水(60:40,v/v)溶解并且轉(zhuǎn)移至HPLC小瓶(Canadian Life Science,Peterborough,ON)。利用具有含乙腈、水以及甲醇(58:37:5,v/v/v)混合物的流動相對稱性C18柱(Waters Nova-Pak,Milford,MA)，以1ml/min的流速進行藥物含量分析。樣品注射體積為20μl并且利用處于232nm波長的UV檢測進行檢測。HPG-C_8/10具有有限的水溶性，導(dǎo)致紫杉烷的低藥物負(fù)載量(未顯示數(shù)據(jù))。dHPG中烷基(C_8/10)鏈的存在對疏水性藥物的負(fù)載是重要的，然而它也顯著地降低了它們的水溶性。為增加HPG的水溶 性，在這些分子合成期間，反應(yīng)的末期添加MePEG 350鏈。dHPG中MePEG量的相對少的增加導(dǎo)致HPG-C_8/10-MePEG₁₃增加的藥物負(fù)載量，對PTX與DTX二者而言。HPG中DTX負(fù)載量高于PTX的負(fù)載量。負(fù)載DTX的dHPG顯示了比PTX制劑更大的物理穩(wěn)定性。HPG-C_8/10-MePEG₁₃中DTX的最大負(fù)載量(5％,w/w)高于PTX的最大負(fù)載量(2％,w/w)。

評估負(fù)載紫杉烷的dHPG的物理與化學(xué)穩(wěn)定性。通過目視觀測制劑的澄清度評估物理穩(wěn)定性，小于24小時內(nèi)的沉淀被認(rèn)為物理學(xué)上不穩(wěn)定的制劑。PBS中再水合一發(fā)生就觀察樣品(t＝0)，或室溫下1,3,6,24,48以及72小時后。通過上文所述的HPLC方法監(jiān)測PTX與DTX的化學(xué)穩(wěn)定性。通過質(zhì)譜分析法，利用Waters TQD質(zhì)譜儀鑒定降解產(chǎn)物。電噴射離子源阻斷溫度150℃，脫溶劑溫度350℃，采樣錐電壓45kV，毛細(xì)管電壓0.70kV，提取器電壓3kV，RF電壓0.1kV，進樣錐氣體流速25l/h，脫溶劑氣體流速600l/h以及碰撞氣體流速0.2ml/min。分子經(jīng)受陽離子模式的電噴霧離子阱。

通過透析方法確定HPG釋放的PTX與DTX。稱量100mg dHPG(HPG-C_8/10-MePEG_6.5或HPG-C_8/10-MePEG₁₃)并且1mg PTX或DTX在1ml乙腈溶液中混合，用15uCi ³H-DTX或³H-PTX(15μl)脈沖并且在氮氣流下干燥以除去溶劑。自Moravek Biochemicals and Radiochemicals(Brea,CA)獲得放射性藥物(³H-DTX或³H-PTX)。dHPG/紫杉烷基質(zhì)與2ml PBS形成水合物并且轉(zhuǎn)移至透析袋，以500ml人造尿液(pH 4.5或6.5)作參比，100轉(zhuǎn)速震動透析。透析膜管購于Spectrum Laboratories(Rancho Dominguez,CA)。根據(jù)Brooks等的方法(Brooks,T.,Keevil,C.W.,1997.Lett.Appl.Microbiol.24,203–206)制備人造尿液，未添加蛋白胨或酵母提取物。利用0.1M HCl將溶液的pH調(diào)至pH4.5和/或6.5。在不同的時間點，測量透析袋的體積并且取10μl樣品用于透析袋中殘余的放射性的測量并且將全部的對外釋放介質(zhì)與新鮮的介質(zhì)交換以維持下沉狀態(tài)。通過β閃爍計數(shù)器(Beckman Coulter Canada,Mississagua,ON)確定每一時間點透析袋中殘留的³H-DTX或 ³H-PTX的濃度。通過減去來自實驗開始時藥物的初始量的每一時間點 殘留的藥物的量計算所釋放藥物的累積百分比。數(shù)據(jù)表達成根據(jù)時間所釋放的藥物的累積百分比。數(shù)據(jù)代表三個獨立的實驗的平均值(SD)。

尿液的pH通常為酸性的但是已知在寬的范圍(pH 4.5-8)內(nèi)變化，因此評估pH對負(fù)載在HPG-C_8/10-MePEG中PTX與DTX釋放度的影響。通過連續(xù)控制釋放與很少或無釋放的突發(fā)相以及隨后較慢的緩釋相表征來自于HPG的紫杉烷的釋放度。自HPG-C_8/10-MePEG釋放DTX比PTX迅速(2天后75％對50％藥物釋放)幾乎所有DTX釋放在6-7天，與對PTX而言12-14天相比。據(jù)信這由于DTX更大的疏水性而更疏水的PTX可具有更大的相容性并且與HPG內(nèi)核的烷基鏈(C₈/C₁₀)相互作用導(dǎo)致較慢的藥物釋放速率。觀察到HPG上MePEG密度的增加對藥物釋放沒有影響(圖13A)。觀察到釋放介質(zhì)的pH變化(pH4.5-6.5)對來自于HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒的藥物釋放沒有影響(圖13B)。利用各種動力學(xué)模型(包括一階，higuchi以及korsmeyer模型)來自于HPG納米顆粒的PTX與DTX釋放度的評估表明一階與higuchi動力學(xué)二者提供了最佳匹配r²＝0.98-0.99(數(shù)據(jù)未顯示)。在藥物釋放速率方面，制劑間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例11：HPG-C_8/10-MePEG₁₃的若丹明標(biāo)記與若丹明標(biāo)記的HPG-C_8/10-MePEG₁₃細(xì)胞攝取

根據(jù)Huang等的方法，稍加改動(Huang,S.N.,Phelps,M.A.,Swaan,P.W.,2003.J.Pharmacol.Exp.Ther.306,681-687)，將四甲基若丹明-5-羧基疊氮化物(TMRCA)共價標(biāo)記于HPG-C_8/10-MePEG₁₃。將500mg HPG-C_8/10-MePEG₁₃溶解于5ml無水1,4-二氧己環(huán)中。將適當(dāng)量的TMRCA溶解于無水1,4-二氧己環(huán)以產(chǎn)生1mg/ml的最終濃度。將對應(yīng)于大約20mol％HPG的這一熒光探針的675μl等分試樣添加至HPG-C_8/10-MePEG₁₃溶液并且在80℃下、油浴中，氮氣流下加熱攪拌5小時。以二甲基甲酰胺(DMF)(MWCO 12,000-14,000)作參比，透析溶液直至透析液為無色的，然后以蒸餾水作參比，透析24小時。冷凍干燥熒光標(biāo)記的聚合物(HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA)并且儲存在-80℃下琥珀色小瓶中。

允許KU7細(xì)胞生長在幾個位于10cm有蓋培養(yǎng)皿的底部的顯微鏡1cm×1cm蓋玻片上，直到達到～75％細(xì)胞覆蓋，其對應(yīng)于大約7×10⁴個細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。用溫?zé)岬腜BS洗滌這些包含細(xì)胞的蓋玻片三次然后將其置于保鮮膜襯里的有蓋培養(yǎng)皿，細(xì)胞側(cè)朝上。將250μl HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA溶液(1mg/ml溶解于改良培養(yǎng)基(DMEM))添加至蓋玻片。細(xì)胞與HPG-C_8/10MePEG₁₃-TMRCA孵育1,4,8及24小時。為對照，將KU7細(xì)胞孵育于沒有任何補充的DMEM中。然后用PBS緩沖液用力地洗滌蓋玻片四次，輕輕地吸干過量的PBS，添加250μl 3.7％多聚甲醛以固定細(xì)胞10分鐘。用PBS再洗滌蓋玻片三次并且沉入水中。吸干過量的液體后，用具有苯基吲哚(DAPI)的 不變色的試劑(分子探針,Invitrogen)將細(xì)胞染色并且在顯微鏡載玻片上，玻片裝載的細(xì)胞側(cè)朝下。通過無色指甲油密封蓋玻片的邊緣以避免干燥。黑暗中孵育樣品過夜以確保細(xì)胞的合適染色。在配備有DAPI(λ_ex 340-380nm；λ_em,435-485nm；二向色分離器,400nm)與若丹明(λ_ex 530-560nm；λ_em,590-650nm；二向色分離器,570nm)濾器的Olympus FV-1000倒置共聚焦顯微鏡下觀察樣品。進行直接對比(DIC)以顯現(xiàn)細(xì)胞膜并且用405nm激光激活。為了清楚地顯示標(biāo)記的聚合物在細(xì)胞內(nèi)部，通過熒光與DIC分析圖像。

通過KU7細(xì)胞的共聚焦顯微鏡顯現(xiàn)若丹明標(biāo)記的HPG-C_8/10-MePEG₁₃(HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA)。孵育1小時后，存在HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA攝取至KU7細(xì)胞的證據(jù)。HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA在1h時攝取的代表性圖像顯示于圖14中。面板A顯示了DAPI染色的未處理的KU7細(xì)胞，其允許細(xì)胞核以藍色顯現(xiàn)(圖像中顯示為白色)。圖像為直接對比信號(其顯示了細(xì)胞的輪廓)與熒光信號(其顯示細(xì)胞核(白色)以及任何其他的熒光缺失)的疊加。面板B顯示已與HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA納米顆粒孵育了1小時的KU7細(xì)胞。通過細(xì)胞核(DAPI染色的藍色)周圍聚合物的紅色熒光(紅色熒光在圖像中顯示為白色部分。細(xì)胞核周圍的紅色熒光在圖像中顯示為深色部分)顯示HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA在細(xì)胞漿中的存在。來自于面板B的相同細(xì)胞群體的堆疊(未顯示堆疊)證明了紅色 熒光的納米顆粒存在遍及細(xì)胞漿，而不是僅僅粘附或存在于細(xì)胞膜。這些納米顆粒似乎均勻地分布于細(xì)胞漿中，盡管觀察到一些點狀結(jié)構(gòu)，所述點狀結(jié)構(gòu)表明HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA被包裝至用于細(xì)胞運輸?shù)男∶浇橹?。KU7細(xì)胞的細(xì)胞核腔室內(nèi)沒有檢測到來自聚合物的熒光。通過1小時的孵育，KU7細(xì)胞吸收HPG-C_8/10-MePEG₁₃-TMRCA納米顆粒并且在1,4,8或24小時時間點所獲得的圖像中沒有差別。

實施例12：HPG-C_8/10-MePEG的體外細(xì)胞毒性研究

根據(jù)如上文所述的報道的方案(Kainthan RK,Mugabe C,Burt HM,Brooks DE.Biomacromolecules,9(3),886-895(2008))，制備HPG-C_8/10-MePEG。¹H NMR(400MHz,D₆-DMSO)δH:0.75-0.82(-CH₃,TMP)；0.82-0.92(-CH₃-烷基在O/DGE上)；1.15-1.55(-CH₂-,烷基在O/DGE上)；2.50(溶劑,D₆-DMSO)；3.15-3.80(-CH與-CH₂-,來自HPG內(nèi)核)；3.23(-OCH₃-來自MePEG),3.32(殘留水)；4.8(-OH)。

通過異核單量子相關(guān)譜(HSQC)NMR實驗估算MePEG與HPG上的烷基鏈的分?jǐn)?shù)?；瘜W(xué)位移參考?xì)堄嗟娜軇┓?。通過凝膠滲透色譜法與多角度激光散射儀(GPC-MALLS)確定聚合物的分子量與多分散性：分子量＝83,000g/mol，多分散性1.22(數(shù)據(jù)未顯示)。

利用Malvern NanoZS顆粒大小分析儀進行顆粒大小分析。負(fù)載HPG-C_8/10-MePEG藥物形成小于10nm的納米顆粒(7.5±3.4nm-7.8±2.7nm,數(shù)據(jù)未顯示)。

通過將PTX(1mg)或DTX(0.5mg)與HPG-C_8/10-MePEG(100mg)溶解于4ml小瓶中的1ml乙腈溶液中并且在60℃下烘箱中干燥1小時以及氮氣流閃耀以清除有機溶劑的痕跡，制備負(fù)載的dHPG的PTX或DTX。紫杉醇(PTX)粉末獲取自Polymed Therapeutics,Inc.(Houston,TX)。多西紫杉醇(DTX)粉末獲取自Natural Pharmaceuticals Inc.(Beverly,MA)。由此得到的HPG-C_8/10-MePEG/紫杉烷基質(zhì)與1ml10mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH 6)形成水合物并且渦旋2分鐘。通過反相HPLC確定摻入至HPG-C_8/10-MePEG的PTX與DTX的量。通過溶劑蒸發(fā)方法，PTX與DTX可以高藥物負(fù)載量(最大負(fù)載量分別為2和5％w/w)負(fù)載。

評估商品化制劑與以及負(fù)載PTX和/或DTX的HPG-C_8/10-MePEG制劑針對KU7-熒光素酶細(xì)胞系、低級的(RT4,MGHU3)與高級的(UMUC3)人尿路上皮癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。來自于Bristol-Myers-Squibb(Princeton,NJ)。來自于Sanofi-Aventis Canada Inc.(Laval,Quebec)。人膀胱癌細(xì)胞系RT4與UMUC3購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)。保持細(xì)胞在含10％熱滅活的胎牛血清的McCoy’s介質(zhì)(Invitrogen,Burlington,ON)中并且保持在37℃下，濕潤的5％CO₂大氣中。作為慷慨的禮物，MGHU3細(xì)胞獲取自Dr.Y.Fradet(L’Hotel-Dieu de Quebec,Quebec,Canada)并且保持在補充了10％胎牛血清與2mM左旋谷氨酰胺的MEM(Invitrogen)中。Dr.C.Dinney(MD Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)友好地提供了KU7并且保持在含5％胎牛血清的DMEM中。出于顯示的目的，通過Dr.Graig Logsdon(M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)用含螢火蟲熒光素酶基因的慢病毒感染KU7細(xì)胞，并且這些亞克隆被命名為如早先報道的KU7-熒光素酶(Hadaschik BA,Black PC,Sea JC等.BJU Int,100(6),1377-1384(2007))。細(xì)胞以5,000個細(xì)胞/孔沉積于100μl體積的補充了10％FBS的McCoy’s介質(zhì)96孔平板中并且在添加新鮮制備的負(fù)載PTX的HPG-C_8/10-MePEG或負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG溶液前允許平衡24小時。細(xì)胞暴露于藥物制劑2小時以模擬目前的用于灌注治療的臨床標(biāo)準(zhǔn)并且如早先報道的(Hadaschik BA,ter Borg MG,Jackson J等，BJU Int,101(11),1347-1355(2008))，利用CellTiter96水的非放射性細(xì)胞增殖測定(CellTiter96Non-Radioactive Cell Proliferation)(MTS)(Promega,Madison,WI)在72小時后確定細(xì)胞活力。每一實驗重復(fù)三次并且MTS值適合于所有細(xì)胞系的線性吸光率。

所有制劑都導(dǎo)致所有測試的細(xì)胞系增殖的濃度依賴性抑制(圖15)。DTX制劑比PTX制劑的細(xì)胞毒性更大，盡管組間沒有顯著性差異(P>0.05,單因素方差分析)。的IC₅₀比的IC₅₀低約2-5 倍。發(fā)現(xiàn)負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒分別與商品化制劑與的細(xì)胞毒性一樣(圖15)。對照的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒(無藥物)顯示在15-1,500nM的濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示)，而與Tween 80已顯示了即使在低濃度下對細(xì)胞的毒性(Iwase K,Oyama Y,Tatsuishi T等，ToxicolLett,154(1-2),143-148(2004)；Henni-Silhadi W,Deyme M,Boissonnade MM等，Pharm Res,24(12),2317-2326(2007))。

實施例13：膀胱內(nèi)的PTX與DTX制劑在膀胱癌原位模型中的功效

在總數(shù)為60只裸鼠中完成體內(nèi)研究以評估膀胱內(nèi)的(1mg/ml,Bristol-Myers-Squibb)；(0.5mg/ml,Sanofi-Aventis)；負(fù)載PTX(1mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG；以及負(fù)載DTX(0.5mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG在膀胱癌的小鼠異種移植模型中的功效。已報道過這一原位的小鼠模型(Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK等.BJU Int,103(7),978-986(2009)；Hadaschik BA,Black PC,Sea JC等.BJU Int,100(6),1377-1384(2007)；Hadaschik BA,ter Borg MG,Jackson J等.BJU Int,101(11),1347-1355(2008))。根據(jù)加拿大動物管理委員會要求進行動物研究。用異氟烷麻醉11周大小的雌性裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)。在將潤滑的24號Jelco血管導(dǎo)管(Medex Medical Ltd.,Lancashire,UK)穿過尿道至膀胱之前將表淺的6-0聚丙烯荷包縫合置于尿道口周圍。膀胱的PBS單一沖洗后，灌注200,0000個KU7-熒光素酶細(xì)胞作為50μl單一細(xì)胞懸浮液并且將荷包縫合結(jié)扎2.5小時。為定量體內(nèi)腫瘤負(fù)載，在4,11,18,25以及33天腹膜內(nèi)注射150mg/kg熒光素后，用IVIS200成像系統(tǒng)(Xenogen/Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)在仰臥位對動物成像15分鐘。利用Living Image軟件(Xenogen)獲取及分析數(shù)據(jù)。在腫瘤接種后第5天，小鼠隨機接受50μlPBS(對照)；HPG-C_8/10-MePEG(無藥物)；(1mg/ml)；負(fù)載PTX(1mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG；0.5mg/ml)；負(fù)載DTX(0.5mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG膀胱內(nèi)處理。在腫瘤接種后第5 天和第19天，給予膀胱內(nèi)治療。生物熒光水平在組中是相等的，然而，因為腫瘤因個體的小鼠而異，為統(tǒng)計分析，每只小鼠中在第4天，以最初的通量做參比，將處理后的腫瘤生物熒光標(biāo)準(zhǔn)化。腫瘤接種后第33天進行尸檢。移除整個膀胱，固定于10％緩沖的福爾馬林并且埋入石蠟中。制備5μm切片并且利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)用H&E染色。在BLISS顯微鏡成像工作站(Bacus Laboratories Inc.,Lombard,IL)上評估及掃描所有的載玻片。KU7-熒光素酶癌細(xì)胞膀胱內(nèi)接種后，所有的小鼠發(fā)展為膀胱腫瘤。然而，兩只小鼠沒有從麻醉中恢復(fù)過來并且在死于腫瘤接種的同一天。發(fā)現(xiàn)一只組的小鼠在成像的最后一天死亡(腫瘤接種后第33天)，在本組早先的測量中這只小鼠具有最大的腫瘤。由于不可逆的體重減輕(15％體重減輕)，對在負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG中另一只小鼠實行安樂死。為統(tǒng)計分析，將這些小鼠排除在研究之外?？偟膩碚f，小鼠都很好地耐受了膀胱內(nèi)的PTX與DTX，無論商品化與還是HPG-C_8/10-MePEG制劑，并且沒有觀察到主要的毒性或體重減輕。在腫瘤接種后第5天及第19天給予膀胱內(nèi)治療。與對照組小鼠(PBS&空白的HPG-C_8/10-MePEG)相比，負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-MePEG顯著地抑制了腫瘤生長(P<0.001，雙因素方差分析，Bonferroni測試后)(圖16)。在與對照組比較時，不同于(1mg/ml)顯著地減少了腫瘤生長(P<0.01，雙因素方差分析，Bonferroni測試后)。然而在與 處理組間未觀察到顯著的差異?；谠缦汝P(guān)于PTX的報道(Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK等.BJU Int,103(7),978-986(2009))選擇PTX(1mg/ml)與DTX(0.5mg/ml)的膀胱內(nèi)灌注劑量并且體外細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)顯示DTX比PTX更有效(圖15)。研究的最后，負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒中的腫瘤生長分別被抑制了87％與97％，與PBS對照組相比。與分別顯示了43％與65％腫瘤生長抑制。每一處理組中小鼠隨時間變化的代表性生物熒光成像顯示于圖17中。膀胱組織的組織學(xué)檢查顯示KU7-熒光素酶腫瘤展現(xiàn)了積極的生長模式與頻繁的多灶性，但是腫瘤接種后33天，處理組中大多數(shù)的腫瘤通常限于固有層及與高級pT1階段疾病有 關(guān)(圖18)。

推測HPG的低納米大小范圍可允許粘蛋白鏈間滲透并且與尿路上皮的雨傘細(xì)胞接觸，導(dǎo)致這些納米顆粒至包括腫瘤組織的膀胱壁增強的胞吞作用。也可能的是HPG上表面的MePEG鏈可通過鏈纏結(jié)與粘蛋白糖蛋白接觸，導(dǎo)致這些納米顆粒陷入粘蛋白層中，引起負(fù)載藥物的納米顆粒在膀胱中延長的停留時間。表7顯示負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒展現(xiàn)了比商品化制劑或高2-3倍的膀胱組織積聚。

實施例14：藥代動力學(xué)

為評估膀胱內(nèi)PTX與DTX制劑的藥代動力學(xué)特性，用(1mg/ml,n＝3)；(0.5mg/ml,n＝4)；負(fù)載PTX的HPG-C_8/10-MePEG(1mg/ml,n＝4)；和/或負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG(0.5mg/ml,n＝4)灌注小鼠。在膀胱內(nèi)灌注后0、30以及60分鐘時取尾部血液樣品。2小時后，利用CO₂窒息殺死所有的小鼠并且通過心臟穿刺除去額外的血液。在微血細(xì)胞比容管(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)或血清分離管(Becton Dicknson)中離心血液樣品并且在液氮中快速冷凍血清。也收獲每只小鼠的尿液和膀胱并且在冷凍前，將膀胱切開以暴露內(nèi)腔，并且在五次連續(xù)的10ml PBS洗滌液中強力地洗滌。所有樣品儲存于-80℃。由集成的超高壓液相色譜(Waters Acquity UPLC)分離系統(tǒng)組成的UPLC-MS/MS系統(tǒng)用于分析，結(jié)合利用Waters TQD質(zhì)譜儀的質(zhì)譜分析。在以下情況下操作系統(tǒng)：電噴射離子源阻斷溫度150℃，脫溶劑溫度350℃，采樣錐電壓45kV，毛細(xì)管電壓0.70kV，提取器電壓3kV，RF電壓0.1kV，進樣錐氣體流速25l/h，脫溶劑氣體流速600l/h以及碰撞氣體流速0.2ml/min。分子經(jīng)受陽離子模式的電噴霧離子阱。通過溶劑/溶劑提取方法從小鼠血清提取DTX。將50μl等分的小鼠血漿和標(biāo)準(zhǔn)液與150μl含0.1％甲酸的乙腈混合于96孔平板并且在室溫下渦旋1分鐘。在4℃下以5,500轉(zhuǎn)速離心樣品10分鐘。然后將100μl上清液與50μl蒸餾水混合，混合并且渦旋30秒。稱重膀胱組織并且在0.1％甲酸/甲醇中利用氧化鋯珠(Biospec Products)及裝備有微量試管架的微型珠攪拌器(Biospec Products)均質(zhì)化60秒。在4℃下以14,000轉(zhuǎn)速(Allegra^TM 25R centrifuge,Beckman-Coulter)離心樣品2分鐘。添加150μl含0.1％三氟乙酸的甲醇至樣品，混合并且在4℃下以14,000轉(zhuǎn)速(Allegra^TM25R centrifuge,Beckman-Coulter)渦旋15分鐘。利用UPLC-MS/MS進行所有的樣品分析。DTX的定量限為10ng/ml，具有從加入標(biāo)準(zhǔn)的對照樣品97％的恢復(fù)。

幾個血清樣品具有不可計量的或不可檢測的水平。通常，PTX與DTX的血清水平是低的(5-20ng/ml)，隨后膀胱內(nèi)灌注。血清水平在不同組間和/或在不同的時間點沒有顯著的差異(P>0.05)(表7)。然而，膀胱組織水平比血清水平高約100-500倍。負(fù)載PTX與DTX的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒顯示了比商品化制劑高2-3倍的膀胱組織積聚，盡管差異沒有統(tǒng)計學(xué)意(P>0.05,單因素方差分析,Bonferroni’s多重比較檢定)。尿液中最終的藥物濃度比初始的計量溶液低約3-5倍。這歸因于在膀胱內(nèi)灌注2小時期間尿液稀釋。然而，PTX與DTX的最終尿液濃度在不同的處理組間沒有顯著的差異(P>0.05,單因素方差分析)。通常，PTX與DTX的血清水平是低的(5-20ng/ml)隨后膀胱內(nèi)灌注。血清水平在不同組間和/或在不同的時間點沒有顯著的差異(P>0.05)(表7)。

表7膀胱內(nèi)PTX與DTX制劑在原位異種移植中的藥代動力學(xué)

¹膀胱內(nèi)灌注2小時后通過HPLC所測量的小鼠尿液中最終濃度。

²2小時膀胱內(nèi)灌注后通過LC/MS/MS所測量的小鼠膀胱組織中的PTX或DTX濃度。

³取自膀胱內(nèi)灌注后1小時及2小時通過LC/MS/MS所測量的小鼠血清中PTX或DTX的濃度。

所示數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

實施例15：HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的合成

根據(jù)實施例7中所述的方案制備HPG-C_8/10-MePEG。¹H NMR(400MHz,D₆-DMSO)δH:0.75-0.82(-CH₃,TMP)；0.82-0.92(-CH₃-烷基在O/DGE上)；1.15-1.55(-CH₂-,烷基在O/DGE上)；2.50(溶劑,D₆-DMSO)；3.15-3.80(-CH與-CH₂-,來自HPG內(nèi)核)；3.23(-OCH₃-來自MePEG),3.32(殘留水)；4.8(-OH)。利用下列程序合成具有胺基取代的各種靶標(biāo)量的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂。所用試劑的量總結(jié)于表8中。靶標(biāo)胺基取代代表NH₂摩爾的靶標(biāo)號/HPG摩爾并且通過HPG-C_8/10-MePEG-NH_2(X)表示，其中x為NH₂的61,121及161摩爾/HPG摩爾。HPG-C_8/10-MePEG溶解于15ml無水1,4-二氧己環(huán)。用無水己烷漂洗氫化鉀(KH)三次以除去礦物油并且在真空下干燥。聚合物溶液與KH組合并且在室溫下攪拌直至形成澄清的溶液。通過溶解于二氯甲烷并且在Na₂SO₄或MgSO₄上攪拌過夜干燥N-(2,3-環(huán)氧丙基)-苯鄰二甲酰亞胺)(EPP)(Sigma-Aldrich)。過濾溶液并且在真空下干燥以除去二氯甲烷。將干燥的EPP溶解于無水1,4-二氧己環(huán)并且添加至聚合物在85-90℃下攪拌過夜。通過將其穿過陽離子交換樹脂(Amberlite IRC-150)三次中和產(chǎn)物，然后從乙醚沉淀三次以除去未反應(yīng)的EPP。通過與水合肼的肼解作用實現(xiàn)苯鄰二甲酰亞胺功能的剪切。添加過量的水合肼溶液(2ml)至含聚合物的甲醇溶液中并且回流混合物72小時。回流后，蒸發(fā)甲醇，利用10,000MWCO膜，水作參比，透析聚合物48小時并且冷凍干燥。¹HNMR(400MHz,D₆-DMSO)δ_H:0.75-0.82(-CH₃,TMP)；0.82-0.92(O/DGE上-CH₃-烷基)；1.15-1.55(-CH₂-,O/DGE上烷基)；2.50(溶劑,D₆-DMSO)；2.60-2.80(-CH與-CH₂-,來自HPG內(nèi)核)；3.15-3.80(-CH與-CH₂-,來自HPG內(nèi)核)；3.23(-OCH₃-來自 MePEG)。用于具有N-(2,3-環(huán)氧丙基)-苯鄰二甲酰亞胺(EPP)的HPG-C_8/10-MePEG聚合物上一些羥基(10-20％)的表面修飾，隨后通過肼解作用剪切苯鄰二甲酰亞胺功能基團以產(chǎn)生HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的反應(yīng)方案總結(jié)于Scheme VII(R,代表基于烷基(C₈/C₁₀)鏈混合物的疏水性內(nèi)核。()7,代表基于MePEG 350的親水性外殼)。

選擇HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎用于藥物負(fù)載及進一步的動物研究中的評估。

NMR與GPC

自利用氘化溶劑的Bruker Avance 400MHz(磁場強度9.4T)NMR光譜儀(Cambridge Isotope Laboratories,99.8％D)所記錄的異核單量子相關(guān)譜(HSQC)NMR實驗估算MePEG與HPG上烷基鏈的分?jǐn)?shù)。通過具有多角度激光散射檢測的凝膠滲透色譜法(GPC-MALLS)確定聚合物的分子量與多分散性。

圖19A顯示了HPG-C_8/10-MePEG的代表性2維HSQC光譜。通過2維HSQC光譜確認(rèn)具有N-(2,3-環(huán)氧丙基)-苯鄰二甲酰亞胺)HPG-C_8/10-MePEG的表面修飾，其中鑒定芳族的苯鄰二甲酰亞胺CH基團(¹H化學(xué)位移7.2-7.8ppm&¹³C化學(xué)位移125-135ppm)。通過1維NMR與2維HSQC實驗監(jiān)控通過肼解作用剪切苯鄰二甲酰亞胺基團以產(chǎn)生游離胺基的成功。圖19B顯示了HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎的代表性2維HSQC光譜，其中顯示成功地剪切苯鄰二甲酰亞胺保護基團以產(chǎn)生胺基(2.60-2.80ppm&¹³C化學(xué)位移45ppm,圖19B)。HSQC NMR數(shù)據(jù)確認(rèn)dHPG的結(jié)構(gòu)為具有光譜中明顯的分支體系結(jié)構(gòu)的超支化聚合物(圖19)?？蓮腍SQC實驗中的信號積分計算C_8/10烷基鏈與dHPG上MePEG的摩爾分?jǐn)?shù)。通過比較MePEG甲氧基和辛基/癸基縮水甘油醚(O/DGE)甲基的積分與TMP CH₃基團的積分，計算對每個dHPG聚合物而言的MePEG分?jǐn)?shù)以及O/DGE(mol/mol)(表10)。

電導(dǎo)滴定和熒光胺測定

通過利用HCl和NaOH的電導(dǎo)滴定測量HPG-C_8/10-MePEG聚合物上衍生的胺基的摩爾分?jǐn)?shù)。25℃下在YSI模型35電導(dǎo)度計及具有鉑電極的3403電池上完成電導(dǎo)滴定。注射泵(Harvard Instruments)用于以恒定的流量0.0102ml/min注射稀釋的NaOH溶液。對典型的滴定而言，將大約10mg HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶解于蒸餾水中并且首先用0.05N HCl滴定，隨后用0.05N NaOH回滴定。每隔30秒測量溶液的電導(dǎo)。鄰苯二甲酸氫鉀(0.05N)用于標(biāo)準(zhǔn)化氫氧化鈉溶液。基于電導(dǎo)滴定與分子量測量，計算胺基/HPG分子摩爾數(shù)量并且所獲得的值在50-119mol/mol的范圍，所述值由NH₂/HPG-C_8/10-MePEG-NH₂摩爾的靶向摩爾比率組成(表8&10)。

表8用于HPG-C_8/10-MePEG-NH₂合成的試劑的化學(xué)計量學(xué)

KH，氫化鉀；EPP，N-(2,3-環(huán)氧丙基)-苯鄰二甲酰亞胺。HPG-C_8/10-MePEG的分子量特性，Mw＝83,000并且Mw/Mn＝1.22。

也可利用熒光及分子量測量計算胺基/HPG分子的摩爾數(shù)量。例如，可使用用于NH₂的熒光胺測定(表9)。通過測量>5mg HPG-NH₂至2ml LC/MS玻璃小瓶并且添加適當(dāng)量的去離子水以產(chǎn)生濃縮的儲備溶液，然后對混合物進行聲處理直至將HPG-NH₂溶解，將儲備溶液稀釋至1mg/ml去離子水/HPG-NH₂mg，制備HPG-NH₂樣品。

通過測量大約1mg苯丙氨酸至鋁微重盤并且將其轉(zhuǎn)移至20ml玻璃小瓶，然后添加5ml去離子水/苯丙氨酸mg，對混合物進行聲處理直至將苯丙氨酸溶解(0.2mg/mL，苯丙氨酸儲備溶液)制備苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。將60μL0.2mg/ml苯丙氨酸儲備溶液轉(zhuǎn)移至玻璃的LC/MS小瓶。添加90μL去離子水，并且渦旋以混合溶液(80ng/mL苯丙氨酸起效標(biāo)準(zhǔn)液)。

將40μL 1mg/mL HPG-NH₂儲備液轉(zhuǎn)移至96孔平板，添加10μL去離子水(或添加50μL,40μL,30μL,20μL,10μL或0μL 80ng/mL苯丙氨酸起效標(biāo)準(zhǔn)液并且用去離子水加滿至50μL，如果有必要的話)；用移液器吸取樣品混合。添加12.5μL硼酸鈉緩沖液至平板并且用移液器吸取混合。吸管端用0.03％熒光胺溶液漂洗兩次以包被尖端及防止滴水。添加12.5μL 0.03％熒光胺溶液至樣品孔。用移液器吸取樣品混合然后將其放在平板振動器上，覆蓋并搖晃1分鐘。添加175μL去離子水以與過量的熒光胺反應(yīng)并且用移液器吸取混合，并且暫時地置于平板振動器上。通過熒光平板讀取器，設(shè)定390nm激發(fā)波長，475nm發(fā)射波長以及激發(fā)與發(fā)射波長二者的5nm帶寬，分析樣品。

表9通過熒光胺測定所測量的胺摩爾/HPG摩爾

^aEPP-A(EPP來自于Atlantic)純度:通過UPLC，78％以及通過NMR 69％。

^bEPP-S(EPP來自于Sigma-Aldrich)純度:通過UPLC，91％以及通過NMR 95％。

熱分析

差示掃描量熱法(DSC)與熱重量分析法(TGA)用于評估dHPG的熱及降解特性。利用TA Instruments DSC Q100及TGA Q50進行熱分析。通過使稱重的樣品在氣密封口的鋁鍋上以10℃/分鐘，-90℃-85℃溫度范圍內(nèi)通過“熱-冷-熱”循環(huán)獲得DSC游程數(shù)。TGA游程數(shù)主要以“逐步等溫的”模式進行，其中在等溫條件下觀察降解過程中每一重量減輕相并且將HPG加熱直到500℃下接近100％重量減輕。表10顯示了HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂樣品的熱事件。HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂樣品顯示了相似的玻璃化DSC/TGA屬性。HPG顯示玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在-45℃--58℃。胺基的存在產(chǎn)生了HPG的Tg有小幅上升。在300℃以上溫度觀察主要的降解事件，其顯示了HPG良好的熱穩(wěn)定性特性。大約3-5％重量減輕發(fā)生在溫度低于100℃，很可能是由于HPG中一些殘余的溶劑或水。HPG良好的熱穩(wěn)定性適合于藥物應(yīng)用以允許熱滅菌方法的潛在用途。

顆粒大小與Z電勢

利用Malvern NanoZS顆粒大小分析儀進行顆粒大小與Z電勢分析，每一分析使用DTS0012一次性定徑比色皿。用0.2μm直列式注射器式濾器過濾樣品(PALL Acrodisc具有13mm尼龍膜)。樣品采集參數(shù)為：角度為具有自動衰減的173°反散射；游程數(shù)11(10s/游程)；分散劑為25℃水(粘性0.8872cP，阻力指數(shù)(RI)1.330)；Mark-Houwink參數(shù)A＝0.428及K＝7.67e^-05(cm²/s)。假定dHPG具有與RI＝1.460及0.01 吸收的聚乙二醇(PEG)相似的折射率。最終的數(shù)據(jù)代表所有游程的平均值。HPG為具有流體力學(xué)半徑<10nm的小納米顆粒。HPG形成小于10nm極其小的納米顆粒。表10顯示了HPG的顆粒大小及Z電勢特征。具有胺基的HPG-C_8/10-MePEG的表面衍生對它們的顆粒大小沒有影響，然而，觀察到對Z電勢有顯著的影響。端胺基HPG聚合物的Z電勢在低pH時高度正性，并且在堿性狀態(tài)中轉(zhuǎn)變?yōu)檩p微的負(fù)性值。表面電荷中這一pH可確定的改變由胺基的質(zhì)子化/去質(zhì)子化引起。在生理的pH7.4時，電離了HPG上一些胺基，并且因此，預(yù)期正性的Z電勢(表10)。然而，在pH值大于8時基本上所有的胺基都是不帶電荷的從而在pH11時所觀察到的輕微的負(fù)電荷很可能是由于這些HPG上存在的帶負(fù)電的羥基。HPG的藥物負(fù)載對它們的顆粒大小沒有顯著的影響并且HPG仍然作為單分子的膠束良好地分散于溶液中。負(fù)載DTX的HPG納米顆粒為物理性質(zhì)穩(wěn)定的，在室溫下1周儲存期間沒有觀察藥物沉淀或聚集。

表10用C_8/10烷基鏈衍生以及用MePEG與胺基修飾的HPG的物理化學(xué)特征

*選擇這一批用于藥物負(fù)載及體內(nèi)研究；¹Tg，取自轉(zhuǎn)變中點的玻 璃化轉(zhuǎn)變；²Td，取自最大的重量減輕時降解溫度。

實施例16：粘膜粘附特性的評估

為評估HPG的粘膜粘附特性，使用Thongborisute與Takeuchi研發(fā)的粘蛋白顆粒方法(Thongborisute,J.；Takeuchi,H.Int.J.Pharm.2008,354,204-209)。該方法基于顆粒大小的改變，所述顆粒大小的改變由于作為粘附的聚合物與粘蛋白間相互作用結(jié)果的超微粘蛋白聚集。將超微粘蛋白溶液與相同體積的HPG(10％w/v)在100mM醋酸緩沖液中混合，在37℃下渦旋及孵育30分鐘。通過利用3000HS Zetasizer(Malvern Instruments,San Bernardino,CA)的光散射測量監(jiān)控顆粒大小的改變。每一測試以一式三份的進行并且將殼聚糖溶液(1％w/v)用作陽性對照。在與殼聚糖(1％w/v)或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎(10％w/v)溶液孵育后，粘蛋白的顆粒大小顯著地增加(圖20)。HPG-C_8/10-MePEG(10％w/v)對粘蛋白顆粒的大小沒有影響。超微粘蛋白增加的顆粒大小是由于聚集的粘蛋白顆粒與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂納米顆粒并且可歸因于粘蛋白與胺取代的HPG間的粘膜粘附力。殼聚糖，眾所周知的粘膜粘附的聚合物，被用作陽性對照。然而，由于它的高分子量及水溶液中低溶解度，使用殼聚糖的稀釋溶液(1％w/v)。甚至共孵育后，該稀釋溶液在粘蛋白的顆粒大小中表現(xiàn)出顯著的改變。據(jù)信殼聚糖與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的粘膜粘附是由于正電荷的胺基與負(fù)電荷的粘蛋白顆粒間靜電相互作用，而且其他的因素諸如氫鍵結(jié)合，疏水效應(yīng)以及鏈纏結(jié)也有影響。然而，HPG-C_8/10-MePEG的粘膜粘附的缺乏提示靜電吸引好像是HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的粘膜粘附特性的主要因素。

實施例17：細(xì)胞增殖/結(jié)合以及攝取研究

細(xì)胞增殖

KU7-熒光素酶以5,000個細(xì)胞/孔沉積于96孔平板100μl體積的補充了10％FBS的McCoy’s介質(zhì)中并且允許在添加新鮮制備的HPG-C_8/10-MePEG和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(溶解于PBS,pH 7.4, 0-150μg/ml)溶液前，平衡24小時。細(xì)胞暴露于HPG溶液2小時并且利用早先所述的CellTiter96水非放射性細(xì)胞增殖測定(Promega,Madison,WI)(Mugabe,C.；Hadaschik,B.A.；Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.；So,A.I.；Gleave,M.E.；Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978-986)，72小時后確定細(xì)胞活力。

HPG的若丹明標(biāo)記

用如早先報道的(Savic,R.；Luo,L.；Eisenberg,A.；Maysinger,D.Science 2003,300,615-618)四甲基若丹明-羰基疊氮化物(TMRCA)共價地標(biāo)記HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎聚合物。四甲基若丹明-羰基疊氮化物(TMRCA)購于Invitrogen Canada Inc.(Burlington,ON)。簡而言之，將500mg HPG(HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎)溶解于5ml無水的1,4-二氧己環(huán)。將適當(dāng)量的四甲基若丹明-5-羰基疊氮化物(TMRCA,MW 455.47)溶解于2ml無水的1,4-二氧己環(huán)以產(chǎn)生最終的濃度1mg/ml。將該675μl熒光探針的等分，其對應(yīng)大約20mol％HPG，添加至HPG溶液并且在80℃下，氮氣流下，油浴中加熱并且攪拌5小時。通過DMF(MWCO12,000-14,000)作參比，透析直至透析液為無色的，然后蒸餾水作參比，透析24小時，除去未反應(yīng)的探針。冷凍干燥熒光標(biāo)記的聚合物(HPG-TMRCA)并且儲存于-80℃下琥珀色小瓶中。

細(xì)胞結(jié)合與攝取

KU7-熒光素酶細(xì)胞用于評估若丹明標(biāo)記的HPG的結(jié)合及攝取。細(xì)胞以10,000個細(xì)胞/孔沉積于96孔平板100μl體積的補充了10％FBS的McCoy’s介質(zhì)中并且允許平衡24小時。除去介質(zhì)并將細(xì)胞與若丹明標(biāo)記的HPG(HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA,1.56-200μg/ml)孵育2小時。孵育期后，用PBS洗滌細(xì)胞3次并且用200μl 0.5％Triton X-100(PBS中pH 8)溶解細(xì)胞而且通過熒光光譜(Synergy 4.0)以激發(fā)/發(fā)射545/578測量細(xì)胞的熒光結(jié)合量。標(biāo)準(zhǔn)液制備于Triton X-100與PBS(pH 8)中若丹明標(biāo)記的HPG(0.781-6.25μg/ml)。細(xì)胞攝取或表面結(jié)合的若丹明標(biāo)記的HPG量表示為所添加至每一孔上聚合物的總量的百分比。

細(xì)胞攝取的共聚焦熒光分析

KU7-熒光素酶細(xì)胞生長于10cm培養(yǎng)皿，盤底上1cm x 1cm蓋玻片用于細(xì)胞在其上生長，直至達到～75％聚焦，其對應(yīng)于7x 10⁴個細(xì)胞的細(xì)胞量。然后除去包含細(xì)胞的蓋玻片并且用溫暖的PBS洗滌3次。然后在整個攝取測定的時期，放置蓋玻片在石蠟襯里的培養(yǎng)皿中細(xì)胞側(cè)朝上。添加若丹明標(biāo)記的HPG聚合物(250μl HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA)至蓋玻片上濃度為1mg/ml的細(xì)胞。孵育細(xì)胞1,4,8以及24小時。在每一時間點后，PBS中強力地洗滌蓋玻片4次。在輕輕地吸去過量的PBS后，室溫下將250μl 3.7％多聚甲醛用于固定細(xì)胞10分鐘。然后在PBS中洗滌蓋玻片3次以上，沉入水中，吸去過量的液體，并且最終用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及Prolong gold在載玻片上固定細(xì)胞側(cè)朝下。將清澈的指甲油少量地用于蓋玻片邊緣周圍以停止樣品干燥。過夜孵育確保樣品的適當(dāng)硬化，然后其為成像作好準(zhǔn)備。在Olympus FV-1000反相共聚焦顯微鏡上進行顯微研究。所用的激光波長為568nm與405nm，分別用于若丹明與DAPI的成像。也進行直接對比(DIC)以顯現(xiàn)細(xì)胞膜并且同樣地用405nm激光激活。保持每一聚合物組中激光功率與高電壓增益相對地恒定以允許一致的比較。為了清楚地顯示標(biāo)記的聚合物在細(xì)胞內(nèi)部，通過熒光與DIC分析圖像。

細(xì)胞增殖/結(jié)合及攝取研究

低濃度時，廣泛地結(jié)合HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒并且內(nèi)化至KU7-熒光素酶，然而在HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA納米顆粒濃度低于12.5μg/ml時沒有觀察到細(xì)胞結(jié)合或攝取的跡象(圖21A)。該聚合物的強結(jié)合屬性很可能由于帶正電荷的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎聚合物與帶負(fù)電荷的KU7-熒光素酶的細(xì)胞膜間的靜電吸引。然而，隨著HPG濃度的增加，HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒的細(xì)胞結(jié)合與攝取達到了飽和點(處于25μg/ml)而發(fā)現(xiàn)HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA納米顆粒至KU7-熒光素酶的細(xì)胞結(jié)合與攝取在濃度12.5μg/ml-50μg/ml時觀察到濃度依賴性的線性關(guān)系，隨后在較高的聚合物濃度時沒有那么明顯 的結(jié)合與攝取(圖21A)。為評估HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒的飽和行為是否由于它們的細(xì)胞毒性效應(yīng)，我們評估HPG對KU7-熒光素酶細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞暴露于空白的(無負(fù)載藥物)HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂納米顆粒(0-150μg/ml)2小時并且通過MTS測定確定細(xì)胞活力。HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂納米顆粒顯示了相似的增值效應(yīng)并且在測試濃度下與KU7-熒光素酶細(xì)胞系為生物相容性的(圖21B)。因此，所觀察到的HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒在細(xì)胞結(jié)合及攝取中的差異很可能不是由于它們對KU7-熒光素酶細(xì)胞系的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

若丹明標(biāo)記的HPG的內(nèi)化的共聚焦熒光分析

共聚焦顯微鏡用于監(jiān)控納米顆粒是否被細(xì)胞內(nèi)化或簡單地結(jié)合KU7-熒光素酶的細(xì)胞膜。HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒迅速地被KU7-熒光素酶細(xì)胞內(nèi)化并且通過1小時的孵育獲得完全的攝取(數(shù)據(jù)未顯示)。通過熒光分析在細(xì)胞質(zhì)中觀察到若丹明標(biāo)記的HPG的存在。與僅僅粘附或存在于細(xì)胞膜相反，觀察到HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒遍及細(xì)胞質(zhì)的存在。沒有在KU7-熒光素酶細(xì)胞的細(xì)胞核間中檢測到來自聚合物的熒光。HPG納米顆粒在細(xì)胞核間中的缺乏可能由于它們的相對高的分子量(<80kDa)。當(dāng)與對照的細(xì)胞在所有的時間點比較時，HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎-TMRCA納米顆粒對KU7-熒光素酶細(xì)胞的活力及普及沒有影響?？傊琄U7-熒光素酶細(xì)胞至1小時的孵育期攝取若丹明標(biāo)記的HPG納米顆粒并且在1,4,8或24小時時間點所獲得的圖像中沒有差異。

實施例18：HPG中DTX的負(fù)載與定量以及HPG釋放的DTX

HPG中DTX的負(fù)載與定量

通過溶劑蒸發(fā)方法，其中藥物與聚合物溶解于普通的有機溶劑中并且除去溶劑，HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEGNH₂₍₁₂₁₎負(fù)載DTX。由此得到的聚合物/藥物基質(zhì)與10mM PBS(pH7.4)重組。由此得到的溶液通常為澄清的但是如果觀察到白色的顆粒，將溶液離心(18,000g,10min)并且將上清液轉(zhuǎn)移至新的小瓶。

通過反相HPLC確定DTX摻入HPG的量。利用對稱的C18柱(Waters Nova-Pak,Milford,MA)與含乙腈、水及甲醇(58:37:5,v/v/v)混合物的1ml/min流速的流動相進行藥物含量分析。樣品注射體積為20μl并且利用波長232nm的UV檢測進行檢測?？傔\行時間設(shè)定為5分鐘并且DTX保留時間為2.9分鐘。通過該方法獲得多達5％w/w藥物負(fù)載，其中對應(yīng)約5-6個DTX分子/HPG分子。DTX的水溶解性在7μg/ml的范圍內(nèi)(Du,W.；Hong,L.；Yao,T.；Yang,X.；He,Q.；Yang,B.；Hu,Y.Bioorg.Med.Chem.2007,15,6323-6330；Liggins,R.T.；Hunter,W.L.；Burt,H.M.J.Pharm.Sci.1997,86,1458-1463)并且HPG中摻入DTX導(dǎo)致該藥物的水溶解性增加大約1000倍。

HPG釋放的DTX

通過透析方法確定HPG納米顆粒(HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎)釋放的DTX。簡而言之，稱量100mg HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎并且將其與DTX混合在1ml乙腈溶液中，加入標(biāo)準(zhǔn)的15μl Ci ³H-DTX，然后在氮氣流下干燥以除去溶劑。HPG/DTX基質(zhì)與2ml PBS形成水合物并且將其轉(zhuǎn)移至透析袋，以500ml人造尿液(pH6.5)作參比，透析及以100轉(zhuǎn)速搖動。利用0.1M HCl將溶液的pH調(diào)至6.5。選擇pH6.5，因為它是人尿液生理學(xué)范圍的中間值，盡管它可能在廣泛的范圍內(nèi)(pH4.5-8)變化(Brooks,T.；Keevil,C.W.Lett.Appl.Microbiol.1997,24,203-206)。在不同的時間點，測量透析袋的體積并且取出10μl樣品用于透析袋中殘余的放射性的測量。將整個的外部釋放介質(zhì)與新鮮的介質(zhì)交換以維持下沉狀態(tài)。通過β-閃爍計數(shù)(Beckman Coulter Canada,Mississagua,ON)確定透析袋中殘余的³H-DTX在每一時間點上的濃度。通過從實驗開始時最初的藥物量減去每一時間點上殘余的藥物量計算所釋放的藥物累積百分比。數(shù)據(jù)表示為根據(jù)時間所釋放的藥物累積百分比。通過具有很少或沒有釋放的突發(fā)相的連續(xù)控制的釋放表征來自HPG的DTX 的釋放屬性(圖22)。在孵育的第一個24小時內(nèi)釋放大約55％最初密封的藥物。HPG表面上胺基的存在對藥物釋放沒有影響(圖22)。

實施例19：評估原位膀胱癌模型中的膀胱內(nèi)DTX制劑

評估膀胱內(nèi)負(fù)載DTX的HPG制劑在具有原位膀胱異種移植的小鼠中的耐受性和功效。已報道了所用的原位小鼠模型(Mugabe,C.；Hadaschik,B.A.；Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.；So,A.I.；Gleave,M.E.；Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978-986；Hadaschik,B.A.；Black,P.C.；Sea,J.C.；Metwalli,A.R.；Fazli,L.；Dinney,C.P.；Gleave,M.E.；So,A.I.BJU Int 2007,100,1377-1384；Hadaschik,B.A.；ter Borg,M.G.；Jackson,J.；Sowery,R.D.；So,A.I.；Burt,H.M.；Gleave,M.E.BJU Int.2008,101,1347-1355)。根據(jù)加拿大動物管理委員會的要求進行所有的動物研究并且來自我們機構(gòu)的動物管理協(xié)議已得到了動物管理委員會的批準(zhǔn)(英屬哥倫比亞大學(xué))(The University of British Columbia)。在該模型中，使用表達KU7-熒光素酶癌細(xì)胞的熒光素酶。為進行腫瘤接種，用異氟烷麻醉8周大小的雌性裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)。在潤滑的24GJelco血管探針(Medex Medical Ltd.,Lancashire,UK)穿過尿道至膀胱之前將表淺的6-0聚丙烯荷包縫合置于尿道口周圍。膀胱的PBS單一沖洗后，灌注200,0000個KU7-熒光素酶細(xì)胞作為50μl單一細(xì)胞懸浮液并且用荷包縫合結(jié)扎2.5小時，在此期間保持小鼠處于麻醉狀態(tài)。縫合除去后，將小鼠置于籠中并且監(jiān)控至它們恢復(fù)知覺并且以正常的方式排泄。腫瘤接種后5天，經(jīng)由膀胱內(nèi)灌注(50μl,2h停延時間)，根據(jù)下列的處理組：PBS(對照)；(0.5與1.0mg/ml,含DTX的Tween 80)；含DTX的HPG-C_8/10-MePEG(0.5與1.0mg/ml)；含DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎(1.0mg/ml)處理26只隨機選擇的小鼠。在處理的第一天并且其后每天監(jiān)控小鼠幾個小時。報道毒性的任何跡象，尤其是重量減輕，攝食飲水的改變，昏睡，弓背姿勢，和/或壓力的總體表現(xiàn)。犧牲24小時內(nèi)沒有恢復(fù)過來的顯示疼痛或疾病跡象的任一小鼠。通過用IVIS 200成像系統(tǒng)(Xenogen Corp.,Alameda,CA)在2,8,12以及19天小鼠的非侵潤性成像監(jiān)控腫瘤負(fù)擔(dān)。簡而言之，腹膜內(nèi)注射 小鼠150mg/kg熒光素，用異氟烷麻醉并且在熒光素注射后恰好15分鐘時仰臥位成像。利用Living Image軟件版本2.50(Xenogen)獲得數(shù)據(jù)。

腫瘤接種后2天，所有的小鼠發(fā)展為膀胱腫瘤，然而也有2只小鼠發(fā)展為如生物熒光成像所示的腎臟腫瘤(圖23A)?？傊?，小鼠很好地耐受了膀胱內(nèi)DTX，無論是商品化還是HPG制劑。沒有觀察到主要的毒性并且所有小鼠存活至研究期末。然而，腫瘤接種后第8天，一些小鼠體重減輕了約5％，盡管它們在下一周恢復(fù)了。體重減輕可能為膀胱內(nèi)處理和/或處理后每天食物與水?dāng)z取較少的結(jié)果。然而，不同組間的體重減輕沒有顯著的差異(p>0.05)。

選擇0.5mg/ml與1.0mg/ml的劑量以建立膀胱內(nèi)DTX在具有膀胱癌異種移植的小鼠中適當(dāng)?shù)慕o藥方案。單一劑量處理的小鼠，無論是1.0mg/ml的0.5mg/ml含DTX的HPG-C_8/10-MePEG,還是1mg/ml的HPG-C_8/10-MePEG和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎都強有力地抑制了腫瘤生長。在腫瘤接種后第19天，所有處理組，除了 (0.5mg/ml)之外，都顯示了與PBS對照比較有統(tǒng)計學(xué)意義的腫瘤抑制(p<0.001,post-hoc Bonferoni analysis雙因素方差分析后)。

據(jù)信這些納米顆粒的粘膜粘附特性增加了與尿路上皮接觸的親密性，導(dǎo)致了增強的藥物滲透性并且攝取至膀胱壁，這可能由于尿路上皮的緊密連接或脫皮的調(diào)整。由于它們極小的尺寸(Rh<10nm)，HPG可擴散穿過粘蛋白糖蛋白并且與尿路上皮的雨傘細(xì)胞直接相互作用，導(dǎo)致了膀胱壁或腫瘤組織對這些納米顆粒增強的胞吞作用。

進行第二次研究以評估較低灌注劑量的HPG中DTX的有效性。為進行該研究，使用沒有明顯的膀胱腫瘤或具有低水平的生物熒光的小鼠，如通過IVIS 200成像系統(tǒng)在第19天所確定的。總計發(fā)現(xiàn)12只小鼠適合于如上文所述的第二次腫瘤再接種。與早先研究中的100％比較，腫瘤占據(jù)約75％并且可歸因于免疫反應(yīng)，因為早先用相同的細(xì)胞系接種小鼠；盡管使用無胸腺的免疫功能不全的小鼠，這些小鼠仍然具有固有的巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞所表征的局部免疫系統(tǒng)。來自于再接種后發(fā)展為膀胱腫瘤的9只小鼠，2只小鼠甚至發(fā)展為更大的(10-100倍)膀胱腫瘤。腫瘤再接種后第5天，隨機分配發(fā)展為膀胱腫 瘤的小鼠成2組以接受單一的50μl膀胱內(nèi)負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG(n＝5)或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎(n＝4)。腫瘤再接種后5天、11天及19天將小鼠成像。膀胱內(nèi)負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎抑制小鼠中的腫瘤生長而負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG在相同濃度下不能實現(xiàn)如此情形。腫瘤再接種后第11天和第19天，4只小鼠中的3只沒有表現(xiàn)出腫瘤生長的跡象，隨后用負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂₍₁₂₁₎納米顆粒單一的膀胱內(nèi)處理而用負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒處理的5只小鼠中的4只顯示出膀胱腫瘤生長的跡象并且1只小鼠還發(fā)展成為腎臟腫瘤(圖24)。再次，小鼠很好地耐受了這些制劑，在這些研究期間沒有發(fā)生主要的毒性或體重減輕。

實施例20：體外細(xì)胞毒性研究

評估商品化制劑與負(fù)載DTX的HPG制劑抗KU7-熒光素酶細(xì)胞系、低級的(RT4,MGHU3)與高級的(UMUC3)人尿路上皮癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

(含DTX的Tween 80)購于Sanofi-Aventis Canada Inc.(Laval,Quebec)。人膀胱癌細(xì)胞系RT4與UMUC3購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)。保持細(xì)胞在含10％熱滅活的胎牛血清的McCoy’s介質(zhì)(Invitrogen,Burlington,ON)中并且保持在37℃下，濕潤的5％CO₂大氣中。作為慷慨的禮物，MGHU3細(xì)胞獲取自Dr.Y.Fradet(L’Hotel-DieudeQuebec,Quebec,Canada)并且保持在補充了10％胎牛血清與2mM左旋谷氨酰胺的MEM(Invitrogen)中。Dr.C.Dinney(MD Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)友好地提供了KU7并且保持在含5％胎牛血清的DMEM中。出于顯示的目的，通過Dr.Graig Logsdon(M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)用含螢火蟲熒光素酶基因的慢病毒感染KU7細(xì)胞，并且這些亞克隆被命名為如早先報道的KU7-熒光素酶(Hadaschik BA,Black PC,Sea JC等.BJUInt2007；100:1377-84)。

細(xì)胞以5,000個細(xì)胞/孔沉積于100μl體積的補充了10％FBS的McCoy’s介質(zhì)的96孔平板中并且在添加新鮮制備的或含PTX的HPG-C_8/10-MePEG和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(溶解于PBS中，pH7.4)溶液前允許平衡24小時。細(xì)胞暴露于藥物制劑2小時以模擬目前的用于灌注治療的臨床標(biāo)準(zhǔn)并且如早先報道的(Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK等，BJU Int 2009；103:978-86)，利用CellTiter96水的非放射性細(xì)胞增殖測定(MTS)(Promega,Madison,WI)在72小時后確定細(xì)胞活力。每一實驗重復(fù)三次并且MTS值適合于所有細(xì)胞系的線性吸光率。

所有制劑都導(dǎo)致所有測試的細(xì)胞系增殖的濃度依賴性抑制。更有侵略性并且快速生長的KU7-熒光素酶細(xì)胞系對DTX制劑最敏感。發(fā)現(xiàn)負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂和商品化制劑的細(xì)胞毒性是一樣的(圖25)。對所有測試的細(xì)胞系而言，DTX制劑的IC₅₀處于低的納摩爾范圍(4-12nM)。對照的HPG納米顆粒(無藥物)在測試的濃度范圍內(nèi)(15-1,500nM,數(shù)據(jù)未顯示)沒有顯示出細(xì)胞毒性。HPG中DTX的負(fù)載對它的細(xì)胞毒性沒有影響。

實施例21：體內(nèi)研究

膀胱內(nèi)DTX在膀胱癌的原位小鼠模型中的功效

在總數(shù)為42只裸鼠中完成體內(nèi)研究以評估用(0.2mg/ml)及負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂單一膀胱內(nèi)處理的功效。已報道了所用的原位小鼠模型(Hadaschik BA,Black PC,Sea JC等.BJU Int 2007；100:1377-84；Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK,等.BJU Int 2009；103:978-86；Hadaschik BA,ter Borg MG,Jackson J等.BJU Int 2008；101:1347-55；Hadaschik BA,Adomat H,Fazli L等.Clin Cancer Res 2008；14:1510-8；Hadaschik BA,Zhang K,So AI等.Cancer Res 2008；68:4506-10)。根據(jù)加拿大動物管理委員會的要求進行動物研究。用異氟烷麻醉11周大小雌性裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)。在潤滑的24G Jelco血管探針(Medex Medical Ltd.,Lancashire,UK)穿過尿道至膀胱之前將表淺的6-0聚丙烯荷包縫合置于尿道口周圍。膀胱的PBS單一沖 洗后，灌注200,0000個KU7-熒光素酶細(xì)胞作為50μl單一細(xì)胞懸浮液并且將荷包縫合結(jié)扎2.5小時。為定量體內(nèi)腫瘤負(fù)載，在4,11,18以及25天腹膜內(nèi)注射150mg/kg熒光素后，用IVIS200成像系統(tǒng)(Xenogen/Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)在仰臥位對動物成像15分鐘。利用Living Image軟件(Xenogen)獲取及分析數(shù)據(jù)。在腫瘤接種后第5天，小鼠隨機接受單一的50μl PBS(對照)；(0.2mg/ml)；負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG；以及負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂的膀胱內(nèi)處理。生物熒光水平在組間是相等的，然而，因為腫瘤因個體小鼠的不同而異，為統(tǒng)計分析，每只小鼠中在第4天，以最初的通量做參比，將處理后的腫瘤生物熒光標(biāo)準(zhǔn)化。腫瘤接種后第25天進行尸檢。移除整個膀胱，固定于10％緩沖的福爾馬林并且埋入石蠟中。制備5μm切片并且利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)用H&E染色。在BLISS顯微鏡成像工作站(Bacus Laboratories Inc.,Lombard,IL)上評估及掃描所有的載玻片。

在KU7-熒光素酶癌細(xì)胞的膀胱內(nèi)接種后，所有的小鼠發(fā)展為膀胱腫瘤。然而，負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂組中的1只小鼠在處理后第4天意外地死亡?？傊?，小鼠很好地耐受了作為商品化 或HPG制劑給藥的膀胱內(nèi)DTX并且沒有觀察到主要的毒性。

與對照小鼠相比，負(fù)載DTX的HPG抑制腫瘤生長。然而，負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂為最有效的制劑：抑制腫瘤在KU7-熒光素酶原位膀胱癌異種移植中生長并且與PBS對照或組相比達到統(tǒng)計學(xué)意義(圖26,P<0.01,雙因素方差分析后post-hoc Bonferoni分析)。在研究的最后，與PBS對照組相比，負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂納米顆粒的單一膀胱內(nèi)灌注抑制了88％腫瘤生長。負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG納米顆粒在該處理組中顯示了54％腫瘤抑制。功效的增加很可能源于負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂納米顆粒處理的小鼠的膀胱及腫瘤組織中增強的藥物攝取。

商品化制劑在該原位異種移植模型中不能抑制腫瘤生長。每一處理組中小鼠隨時間變化的代表性生物熒光圖像顯示于圖26中。膀胱組織的組織學(xué)檢查顯示KU7-熒光素酶腫瘤表現(xiàn)出侵略性生長 方式及頻發(fā)的多灶性，但是腫瘤接種后25天，它們通常限于固有層以及與高級的T1階段疾病關(guān)聯(lián)(圖27)。盡管DTX(0.2mg/ml)不引起KU7-熒光素酶異種移植中任何異常的組織學(xué)改變，與PBS處理相比，負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂抑制腫瘤生長。通過HPG-C_8/10-MePEG-NH₂中負(fù)載的DTX處理的腫瘤大小顯著地減小，伴有異質(zhì)細(xì)胞大小，細(xì)胞核形狀以及侵潤的炎性細(xì)胞。

也確定的是用于負(fù)載生物活性部分至dHPG的技術(shù)能夠產(chǎn)生制劑，測定該制劑為遞送系統(tǒng)中藥物的靶標(biāo)量的±20％，如通過HPLC所測定的(見表11)。

表11處理后通過HPLC所分析的樣品中DTX制劑的濃度

在摻入紫杉醇(PTX)的制劑與摻入DTX的制劑間進行比較，如圖28所示。對這兩種藥物而言，將它們摻入至諸如HPG-C_8/10-MePEG的dHPG，導(dǎo)致減少的腫瘤發(fā)光，并且摻入DTX的dHPG比摻入紫杉醇的dHPG更有效。

利用兩個時間點以及利用健康的動物重復(fù)相似的實驗。圖29中所示的這些數(shù)據(jù)顯示健康小鼠中，使用HPG-C_8/10-MePEG-NH₂比HPG-C_8/10-MePEG或Taxotere^TM用于遞送相同量的藥物時，隨著時間的變化，更多的多西紫杉醇保留在膀胱中。對HPG-MePEG-NH₂而言，由于超過定量的測定最高極限，結(jié)果為半定量的。對Taxotere^TM與HPG-C_8/10-MePEG組而言，結(jié)果為定量的。每次給予小鼠50μL體積中的50μg藥物并且使用50mg dHPG(n＝3/組)。

實施例22：藥物攝取研究

為評估膀胱內(nèi)DTX制劑后膀胱組織與血清攝取，用(0.2mg/ml,n＝3)或負(fù)載DTX(0.2mg/ml)的HPG-C_8/10-MePEG(n＝4)和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(n＝4)灌注具有原位膀胱腫瘤的小鼠。灌注后兩小時測量尿液、膀胱組織以及血清中DTX的量。在具有確定的KU7-熒光素酶腫瘤(腫瘤接種后33天)的15周大小雌性裸鼠中進行藥物攝取研究。在膀胱內(nèi)灌注后0,30以及60分鐘時取尾部血液樣品。在這期間仍然用異氟烷麻醉小鼠。2小時后，利用CO₂窒息將所有小鼠安樂死并且通過心臟穿刺除去額外的血液。在微血細(xì)胞比容管(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)或血清分離管(Becton Dicknson)中離心血液樣品并且在液氮中快速冷凍血清。也收獲每只小鼠的尿液和膀胱并且在冷凍前，將膀胱切開以暴露內(nèi)腔，并且在五次連續(xù)的10ml PBS洗滌液中強力地洗滌。所有樣品儲存于-80℃。由集成的超高壓液相色譜(Waters Acquity UPLC)分離系統(tǒng)組成的UPLC-MS/MS系統(tǒng)用于分析，結(jié)合利用Waters TQD質(zhì)譜儀的質(zhì)譜分析。在以下情況下操作系統(tǒng)：電噴射離子源阻斷溫度150℃，脫溶劑溫度350℃，采樣錐電壓45kV，毛細(xì)管電壓0.70kV，提取器電壓3kV，RF電壓0.1kV，進樣錐氣體流速25l/h，脫溶劑氣體流速600l/h以及碰撞氣體流速0.2ml/min。分子經(jīng)受陽離子模式的電噴霧離子阱。在具有m/z 808.5→527.2的轉(zhuǎn)變的多反應(yīng)監(jiān)測中定量DTX，如早先確立的(Mugabe C,Liggins RT,Guan D,et al.Int J Pharm 2011；404:238-49)。通過溶劑/溶劑提取方法從小鼠血清提取DTX。將50μl等分的小鼠血漿和標(biāo)準(zhǔn)液與150μl含0.1％甲酸的乙腈混合于96孔平板并且在室溫下渦旋1分鐘。在4℃下以5,500轉(zhuǎn)速(Allegra^TM 25R離心機,Beckman-Coulter)離心樣品10分鐘。然后將100μl上清液與50μl蒸餾水混合，混合并且渦旋30秒。稱重膀胱組織并且在0.1％甲酸/甲醇中利用氧化鋯珠(Biospec Products)及裝備有微量試管架的微型珠攪拌器(Biospec Products)均質(zhì)化60秒。在4℃下以14,000轉(zhuǎn)速(Allegra^TM 25R離心機,Beckman-Coulter)離心樣品2分鐘。添加150μl含0.1％三氟乙酸的甲醇至樣品，混合并且在4℃下以14,000轉(zhuǎn)速(Allegra^TM25R centrifuge,Beckman-Coulter)渦旋15分鐘。利用UPLC-MS/MS進行所有的樣品分析。DTX的定量限為10ng/ml， 具有來自加入標(biāo)準(zhǔn)的對照樣品97％的恢復(fù)。批內(nèi)精密度(％RSD)在所有的情況下都不超過15％。

所有時間點上，灌注的小鼠在血清中都沒有可檢測的DTX。負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂在2h時間點上顯示了最高的血清水平(150.87±34.98對23.97±16.71ng/ml,P<0.01,雙因素方差分析,Bonferronipost-test)。然而，DTX的血清濃度比尿液和膀胱組織中濃度低幾個數(shù)量級(表12)。與或負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG比較，負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂導(dǎo)致了膀胱組織積聚中明顯更高的量(P<0.001,單因素方差分析,Bonferroni’s多重比較檢定)。與負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG處理組在膀胱組織積聚中沒有顯著的差異(P>0.05,單因素方差分析)。最終的尿液濃度比最初的計量溶液低約5-7倍。這是由于膀胱內(nèi)灌注2小時期間尿液的稀釋。然而，不同處理組間DTX的最終尿液濃度沒有顯著的差異(P>0.05,單因素方差分析)。任一組中沒有觀察到局部或全身的毒性。

表12膀胱內(nèi)DTX制劑在原位異種移植中的藥物攝取

¹通過HPLC所測量的膀胱內(nèi)灌注2小時后小鼠尿液中DTX的最終濃度

²通過LC/MS/MS所測量的膀胱內(nèi)灌注2小時后小鼠膀胱組織中DTX的濃度

³通過LC/MS/MS所測量的膀胱內(nèi)灌注后在0.5、1以及2小時取的小鼠血清中DTX的濃度

BLOQ，低于定量極限(最低的定量極限為10ng/ml)

數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD

實施例23：評估腫瘤微環(huán)境與若丹明標(biāo)記的HPG的攝取

評估膀胱腫瘤微環(huán)境與若丹明標(biāo)記的HPG分布至腫瘤組織。

HPG的若丹明標(biāo)記

如早先報道的(Savic R,Luo L,Eisenberg A,Maysinger D.Science2003；300:615-8；Mugabe C,Liggins RT,Guan D,et al.Int J Pharm 2011；404:238-49)用四甲基若丹明-5-羧基疊氮化物(TMRCA)共價地標(biāo)記HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂。用異氟烷麻醉具有原位膀胱腫瘤的15周大小雌性裸鼠(腫瘤接種后33天)。將表淺的6/0聚丙烯荷包縫合置于尿道口周圍并且通過人工壓迫排空膀胱。將潤滑的24號Jelco血管導(dǎo)管穿過尿道至膀胱然后灌注50μl任一PBS、游離的若丹明(TMRCA)、HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA和/或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂-TMRCA，并且將荷包縫合結(jié)扎2小時，在此期間保持小鼠處于麻醉狀態(tài)。2小時后移除荷包縫合，通過人工壓迫排空膀胱并且用150μl PBS(pH6.0)洗滌兩次。使小鼠安樂死，切離膀胱，并且將其在鋁塊上冷凍，然后包埋于OCT用于冰凍切割。從膀胱邊緣以1、2以及3mm的距離切取10μm冰凍切片。室溫下干燥切片并且利用10倍的目標(biāo)(0.75μm/像素間距)以若丹明熒光對切片成像。載玻片固定于1:1的丙酮:甲醇溶液10分鐘并且利用定制的毛細(xì)管作用染色器針對CD31(1:50具有抗倉鼠Alexa 647二抗的倉鼠抗-CD31)與Hoechst 33342(細(xì)胞核染料)。CD31與Hoechst 33342熒光成像后，輕輕地用蘇木精復(fù)染色，亮視野中固定&成像。

圖像分析：圖像簡化為1.5μm/像素間距以改善圖像J軟件中的可使用性。然后用用戶提供的算法建立圖像棧，比對及裁剪至腫瘤組織邊界，移除處理工具；基于蘇木精圖像進一步地裁剪壞死。在Hoechst33342圖像上沿著腫瘤組織邊界人工地示蹤膀胱內(nèi)腔。運行用戶提供的分析宏命令以產(chǎn)生下列的數(shù)據(jù)類型：a)閾值：人工地確定以包括陽性染色但是其并沒有在壞死區(qū)域以外獲得背景；宏命令確定滿足或超過該閾值的正性像素的數(shù)量并且報道稱之為全部腫瘤切片的平均值。b)強度：報道稱之為對全部腫瘤切片染色的平均強度，或基于它們與 第二次染色(即CD31)的距離或人工示蹤邊界(膀胱內(nèi)腔)將像素的平均強度分類。進行計算以確定平均值±標(biāo)準(zhǔn)差并且利用微軟電子表格(Microsoft Excel)建立圖形顯示；利用用于Macs軟件的棱鏡v5進行方差(Kruskal-wallis檢驗)統(tǒng)計分析的非參數(shù)分析。

評估膀胱腫瘤微環(huán)境及若丹明標(biāo)記的HPG至腫瘤組織的分布。膀胱腫瘤組織為高度血管吻合的，至最近的血管平均距離40-60μm(圖30A)。在不同的組間沒有見到顯著的差異(P＝0.8)。測量整個膀胱腫瘤內(nèi)的熒光量。與其他的組相比(P＝0.037)，若丹明標(biāo)記的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(HPG-C_8/10-MePEG-NH₂-TMRCA)顯示了最高的腫瘤攝取。在游離的若丹明(TMRCA)與若丹明標(biāo)記的HPG-C_8/10-MePEG所灌注的膀胱的腫瘤攝取中沒有顯著的差異(P>0.05)(圖30B)。根據(jù)膀胱內(nèi)腔距離評估若丹明攝取至腫瘤組織的深度分布。HPG-C_8/10-MePEG-NH₂-TMRCA納米顆粒證明了在所有內(nèi)腔距離上增強的腫瘤攝取，顯示了超過HPG-C_8/10-MePEG-TMRCA納米顆粒的5-6倍增加(圖30C)。

實施例24：HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-COOH的合成及特征

根據(jù)我們早先報道中所述的方案(Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.Bioconjugate Chem.2008,19,2231–2238)進行O/DGE內(nèi)核修飾的HPG的聚合作用。根據(jù)以前報道的方案(Haxton,K.J.；Burt,H.M.Dalton Trans.2008,5872–5875)進行具有羧酸基的C_8/10內(nèi)核-修飾的HPG的功能化。對典型的反應(yīng)而言，將5.0g HPG-C_8/10-OH或HPG-C_8/10-MePEG_6.5溶解于100ml吡啶中，并且將溶液保持在氮氣下，隨后添加二甲氨基吡啶與琥珀酰酐，根據(jù)HPG上羧酸基的靶標(biāo)量調(diào)節(jié)。為合成HPG與最高量的COOH基，將所有可利用的游離羥基靶向用于羧化物的修飾；因此，添加過量的二甲氨基吡啶(0.075g,0.61mmol)與琥珀酰酐(4.5g,45mmol)至反應(yīng)混合物。通過計算游離羥基的理論模型，確定了存在348mols游離羥基/HPG摩爾，因此，理論上，相同數(shù)量的羧基/HPG摩爾。因此，由此得到的HPG表示為HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈。 少量使用二甲氨基吡啶(0.015g,0.12mmol)與琥珀酰酐(0.9g,9mmol)產(chǎn)生了HPG，其中并不是所有的游離羥基都靶向用于修飾。通過計算添加至反應(yīng)混合物的琥珀酰酐的摩爾數(shù)量確定羧酸基添加至HPG的理論數(shù)量。因此，這種含HPG的低羧化物表示為HPGC_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃。添加二甲氨基吡啶與琥珀酰酐后，室溫下使用磁性攪拌棒攪拌溶液過夜。添加去離子水(100mL)至燒瓶并且將混合物保持?jǐn)嚢?0分鐘。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，伴有周期的水添加以使吡啶通過共沸蒸餾能夠更好的蒸發(fā)。將最終的產(chǎn)物溶解于甲醇中并且以80:20甲醇/去離子水的混合物作參比，利用醋酸纖維素透析袋(MWCO 10000g/mol,Spectrum Laboratories Inc.,Rancho Domunguez,CA)透析3天，每隔8小時改變透析介質(zhì)，每次用較低的甲醇濃度直至在最后的三個階段期間，透析介質(zhì)為100％水。通過冷凍干燥獲得聚合物。

HPG-C_8/10-MePEG-COOH的¹³C NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ_C:0(四甲基硅烷,內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)),14.73(O/DGE上的CH₃,烷基),23.92-33.24(C(O)CH₂CH₂COOH),48.51-49.86(溶劑,甲醇-d₄),59.29(CH₃O-MePEG),64.19-65.36(-CH₂OH,聚合物中未反應(yīng)的伯醇基團),69.98-73.74(聚合物中的-CH₂-O-,-CH-O),78.93-80.14(聚合物中的CH),173.84-174.16(C(O)CH₂CH₂COOH),175.92(C(O)CH₂CH₂COOH)。

在所有官能化HPG的制備中，將MePEG與COOH基團添加至反應(yīng)混合物。各種官能化HPG的MePEG與COOH的靶標(biāo)量總結(jié)于表13中。高的與低的羧化物官能化HPG的反應(yīng)產(chǎn)率分別為84％與74％。通過下列的命名法描述HPG聚合物：HPG-C_8/10-MePEGA-COOHB，其中HPG-C_8/10烷基取代的HPG，A為與聚合物結(jié)合的MePEG的靶標(biāo)含量，基于試劑的化學(xué)計量學(xué)(MePEG摩爾/TMP抑制劑摩爾)并且B為COOH的預(yù)期摩爾含量/HPG聚合物摩爾，基于來自于GPC數(shù)據(jù)所計算的聚合物的分子量。

表13一系列表面修飾的用C_8/10烷基衍生的超支化聚丙三醇的特性

^a命名法指定如下：HPG-C_8/10-OH為“基礎(chǔ)的聚合物”并且所有其他的都是用MePEG與COOH表面修飾，表示為反應(yīng)中所添加的表面基團的理論摩爾數(shù)/HPG摩爾。^b通過pH滴定所確定的COOH基團摩爾/HPG摩爾。^c通過GPC確定的平均分子量與多分散性指數(shù)。通過Mw/PDI計算重均分子量數(shù)。^d顆粒大小(直徑)，通過動態(tài)光散射技術(shù)所確定。

NMR分析

純化后，通過NMR分析表征所有的HPG：利用400MHz Bruker Avance II+光譜儀(Bruker Corporation,Milton,ON)獲得HPG聚合物的NMR光譜。將聚合物溶解于DMSO-d₆或甲醇-d₄(Cambridge Isotope Laboratories,Andover,MA)。獲得一維的質(zhì)子與碳光譜及二維的多重編輯的異核單量子相關(guān)譜(HSQC)，異核多鍵相關(guān)(HMBC)以及HSQC-TOCSY(全相關(guān)譜)NMR實驗。化學(xué)位移參考?xì)堄嗟娜軇┓?。利用Sparky(T.D.Goddard and D.G.Kneller,Sparky 3,University of California,San Francisco)分析二維光譜。從HSQC數(shù)據(jù)估算HPG上的COOH的摩爾分?jǐn)?shù)如下：對每一修飾而言，整合對應(yīng)四個亞甲基質(zhì)子的峰并且它的積分校正質(zhì)子數(shù)。該值除以TMP甲基的積分(校正質(zhì)子多樣子)以產(chǎn)生COOH的摩爾分?jǐn)?shù)。

自圖31可以見到所有官能化HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH聚合物的峰歸屬于HPG的結(jié)構(gòu)組分并且與早先的報道一致(Kainthan,R.K.；Mugabe,C.；Burt,H.M.；Brooks,D.E.Biomacromolecules 2008,9,886–895；Kainthan,R.K.；Janzen,J.；Kizhakkedathu,J.N.；Devine,D.V.；Brooks,D.E.Biomaterials 2008,29,1693–1704；Haxton,K.J.；Burt,H.M.Dalton Trans.2008,5872–5875)。HSQC、HMBC以及HSQC-TOCSY利用整合的峰體積，用于估算HPG上取代基、C_8/10烷基鏈、MePEG以及COOH的分?jǐn)?shù)。

支化度與聚合作用的程度

利用下列的方程式(Ho¨lter,D.；Burgath,A.；Frey,H.Acta Polym.1997,48,30–35)，通過支化度(DB)與聚合作用的程度(DPn)典型地表征超支化聚合物：

其中，DB為支化度，D、L₁₃及L₁₄分別代表樹狀的、直鏈的1-3及直鏈的1-4單元?？s水甘油的樹狀的與直鏈重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)總結(jié)于圖32中，所述重復(fù)單元存在于超支化結(jié)構(gòu)中。而且，計算這些聚合物的聚合作用的程度(DPn)如下(Sunder,A.；Hanselmann,R.；Frey,H.；Mu¨lhaupt,R.Macromolecules 1999,32,4240–4246)：

其中D、L₁₃以及L₁₄如上文所定義的，T代表末端單元的分?jǐn)?shù)，并且fc為內(nèi)核分子的官能化(對TMP而言，其為3)。D由一級與二級單元的總數(shù)所給出的。Dp與Ds(見圖32)，以及L₁₃、L₁₄和T以相似的方式定義。

當(dāng)2D HMBC與HSQC-TOCSY實驗聯(lián)合使用時，屬于對應(yīng)一級和二級L₁₃、L₁₄、T以及D單元的許多峰為未修飾的HPG聚合物(其作為參照物合成，不含C_8/10烷基組分并且沒有添加MePEG或羧基修飾，數(shù)據(jù)未顯示)，來自于多重編輯的HSQC的峰體積用于計算DB與DPn。 針對我們修飾的HPG而獲得的結(jié)果為DB)0.51與DPn)14.83，并且結(jié)構(gòu)單元的相對豐度，對線性單元而言為39％，對樹狀單元而言為20％，以及對末端單元而言為41％。這些數(shù)值與文獻數(shù)值有很好地一致性(Sunder,A.；Hanselmann,R.；Frey,H.；Mu¨lhaupt,R.Macromolecules 1999,32,4240–4246；Ho¨lter,D.；Burgath,A.；Frey,H.Acta Polym.1997,48,30–35)。當(dāng)比較C_8/10烷基鏈修飾的HPG(HPG-C_8/10-OH)的HSQC光譜與未修飾的HPG的HSQC光譜時，在前者的聚合物內(nèi)核的光譜區(qū)域中可見兩個新的峰(圖33)。一個峰屬于脂肪族鏈的R-亞甲基，而第二個峰不能明白地分配?；诨瘜W(xué)位移，該峰可對應(yīng)具有烷基鏈的T單元，所述烷基鏈與仲醇羥基結(jié)合；然而，不能證實這一推測。對HPG-MePEG_6.5而言，觀察到相似的情況?？煞峙鋪碜訫ePEG的R-亞甲基的峰，但是額外的未知的峰不能明確地分配。與HPG-C_8/10-OH相似，新的峰的化學(xué)位移與類L₁₄單元相似。總之，不能從NMR數(shù)據(jù)計算DB與DPn，由于缺乏明確地信號分配。通過線性或末端單元的觀察并且證實所有預(yù)期的支化模式和修飾(烷基、MePEG以及羧基)存在，NMR數(shù)據(jù)顧及到了游離羥基的直接表征。圖33示例了NMR光譜中的各種分配峰，其顯示了預(yù)期支化模式的存在和MePEG、烷基鏈以及COOH基團的存在。

COOH的摩爾分?jǐn)?shù)

對所有COOH修飾的HPG聚合物而言，從HSQC NMR光譜估算COOH的摩爾分?jǐn)?shù)。通過這種方法，HPG聚合物中COOH的數(shù)量不是絕對數(shù)，因為它表示為相對于TMP甲基存在于樣品中。假設(shè)每個HPG分子只含有一個TMP；然而，不能獨立地定量各種批次聚合物中TMP量/HPG摩爾。因此，這些數(shù)字用作有多少羥基被COOH帽化的定性指標(biāo)。而且，因為從同一批次的HPGC_8/10-MePEG_6.5合成HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH聚合物，所以預(yù)期TMP含量是相同的并且可以比較NMR光譜以確定COOH在這二者HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH聚合物中的相對量。摩爾比率表明，與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃相比，HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈中的COOH含量高2.8倍。對HPG-C_8/10-COOH與高羧基密度的HPGC_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈聚合物而言，未觀察到對應(yīng)于線性或末端基團的峰，這表明沒有羥基存在于該聚合物中(見代表性NMR光譜的圖34)。對低密度COOH聚合物，HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃而言，除了新的峰之外還觀察到線性與末端基團的峰，這表明只有部分飽和的具有羧酸的羥基(數(shù)據(jù)未顯示)。

FT-IR

利用具有通用的ATR采樣配件的Perkin-Elmer FTIR光譜儀(Perkin-Elmer,Woodbridge,ON)獲得HPG的FT-IR光譜。掃描范圍為4000-650cm^-1，具有4cm^-1的分辨率。

HPG-C_8/10-MePEG_6.5、HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈以及HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃的FT-IR光譜顯示于圖35中。2800-3000cm^-1處的峰與C-H振動一致并且發(fā)生在所有HPG中。1680-1780cm^-1處的峰由CdO波段產(chǎn)生，這表明了HPG-C_8/10-MePEG-COOH聚合物中COOH基團的存在。1200-1400與1000-1180cm^-1處的峰分別由C-H波段與C-O振動產(chǎn)生，因此，可以在所有這些聚合物中發(fā)現(xiàn)它們。通過比較HPG-C_8/10-MePEG_6.5、HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃以及HPG-C_8/10-Me-PEG_6.5-COOH₃₄₈的FT-IR光譜，可以見到OH峰(3300-3500cm^-1)減少并且CdO峰(1680-1780cm^-1)在HPG-C_8/10-MePEG-COOH中出現(xiàn)，這表明OH基團已消耗并且轉(zhuǎn)換為COOH。HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈的光譜顯示了OH峰接近消失，這表明OH基大部分已消耗并且轉(zhuǎn)換成COOH，而HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃的OH峰減少但是仍然明顯，與NMR結(jié)果一致。而且，后者HPG也顯示了較小的CdO峰，這表明與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈相比COOH較低的摩爾比率。FT-IR數(shù)據(jù)顯示了支持HPG的官能化改變的好證據(jù)并且也確證了通過純化方法除去了未反應(yīng)的試劑。

分子量

通過配備了DAWN-EOS多角度激光散射(MALLS)檢測器與Optilab RI檢測器(Wyatt Technology Inc.,Santa Barbara,CA)的凝膠滲透色譜法(GPC)(GPC-MALLS)確定HPG的重均分子量(Mw)與多分散 性。將0.1N硝酸鈉水溶液用作0.8mL/min流速的流動相。早先報道中已描述了細(xì)節(jié)(Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.Bioconjugate Chem.2008,19,2231-2238；Kumar,K.R.；Kizhakkedathu,J.N.；Brooks,D.E.Macromol.Chem.Phys.2004,205,567-573)。對各種HPG而言，確定dn/dc值在0.1N NaNO₃水溶液中對HPGC_8/10-MePEG_6.5、HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈以及HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃而言分別為0.146、0.165以及0.138并且用于聚合物分子量的計算。利用由Wyatt Technology Corp所提供的Astra軟件處理數(shù)據(jù)。通過Mw除以PDI計算聚合物的平均分子量數(shù)。

這些HPG的分子量與多分散性顯示于表13中。官能化的HPG(HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH)顯示了與HPG-C_8/10-MePEG_6.5相比分子量增加。而且，發(fā)現(xiàn)在表面官能化后，聚合物的多分散性沒有很大地改變，這表明了相對一致的表面修飾。分子量值與早先報道的HPG-C_8/10-MePEG(Kainthan,R.K.；Mugabe,C.；Burt,H.M.；Brooks,D.E.Biomacromolecules 2008,9,886-895；Kainthan,R.K.；Janzen,J.；Kizhakkedathu,J.N.；Devine,D.V.；Brooks,D.E.Biomaterials 2008,29,1693-1704；Mugabe,C.；Hadaschik,B.A.；Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.；So,A.I.；Gleave,M.E.；Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978-986；Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.Bioconjugate Chem.2008,19,2231-2238)的分子量值相似。

COOH基團的滴定

在T-50M滴定儀(Mettler Toledo,Mississauga,ON)上進行電勢/pH滴定，以定量COOH表面移植的HPG的總濃度。將HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃樣品溶解于0.2mg/mL10mM NaOH 10mL中。通過添加0.1M NaOH，人工升高每一溶液的pH達到大約11。然后用0.01M HCl滴定樣品。注射劑設(shè)定為10-50μL的動態(tài)范圍并且注射劑間30-60s的時間間隔確保平衡建立。一旦pH達到3.0就終止滴定。利用標(biāo)準(zhǔn)的外推/交叉方法確定滴定終點。報道的COOH滴定值代表三個測量的平均值。

通過電勢/pH滴定(表13)測量結(jié)合HPG的COOH基團的摩爾比率 并且顯示了與靶標(biāo)摩爾比率及測量的分子量有很好的一致性。例如，也可通過添加具有歸于COOH基團分子量的HPG-C_8/10-MePEG_6.5(6.3×10⁴)的平均分子量的數(shù)量計算HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃的分子量，該分子量等于羧化物/HPG分子的數(shù)量(87來自于滴定數(shù)據(jù))乘以羧化物分子量(101g/mol)?；谶@種計算，HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃的平均分子量數(shù)為7.2×10⁴g/mol，與測量的值有很好的一致性(7.0×10⁴g/mol)。

溶解度

通過將聚合物已知的質(zhì)量溶解于各種水緩沖液或蒸餾水評估HPG聚合物的溶解度特征。輕微地渦旋樣品以加速溶解。對渾濁度的信號而言，定期地測量幾天聚合物溶液在550nm處的吸光度以評估聚合物是否仍然存在溶液中。對一些羧酸衍生的HPG聚合物而言，調(diào)節(jié)溶液的pH以促進溶解。

作為潛在的藥物納米載體，這些聚合物的水介質(zhì)中溶解度特征是關(guān)鍵的。發(fā)現(xiàn)HPG-C_8/10-MePEG聚合物在蒸餾水、PBS緩沖液(pH7.4)以及合成的尿液中具有很好的水溶解度(大于100mg/mL)。發(fā)現(xiàn)HPG-C_8/10-COOH在水介質(zhì)或PBS(pH 7.4)中為幾乎不可溶解的并且只可溶解于堿性溶液，諸如0.1M NaOH，由于在中性pH時離子化減少。HPG內(nèi)核的疏水性(烷基鏈)組分很可能占溶解度特征的主導(dǎo)地位。也用MePEG基團結(jié)合的羧化物衍生的HPG顯示了增加的水溶解度。因此，發(fā)現(xiàn)HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃可完全地溶解于10mM PBS，濃度為100mg/mL，沒有加熱，盡管溶液的pH從7.4下降至4.5。具有較高量羧化物的HPG(HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈)在水或PBS緩沖液中可溶解性差并且超過了緩沖作用的能力，導(dǎo)致了PBS緩沖液的酸化并且使pH從7.4下降至大約3.8。溶液表現(xiàn)出顯著的渾濁度，如通過550nm處吸光度所測量的，證明了聚合物不可溶解的殘余分?jǐn)?shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。要求添加氫氧化鈉以獲得濃度100mg/mL并且澄清的溶液pH4.25。

顆粒大小與Z電勢

利用Malvern NanoZS顆粒大小分析儀(Malvern Instruments Ltd., Malvern,U.K.)，使用一次性定徑比色皿，進行顆粒大小與Z電勢分析，。在1mM NaCl pH6.0中制備濃度15mg/ml的聚合物溶液并且在測量之前用0.22μm注射器式濾器(Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI)過濾。

羧基終止的HPG聚合物具有5-10nm范圍的顆粒大小(表13)。納米顆粒的Z電勢為強烈地負(fù)性，對HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈而言，分別為-41.2±3.2與-60.3±2.1mV。Z電勢中的降低是與HPG表面結(jié)合的羧基的數(shù)量的結(jié)果。

實施例25：結(jié)合HPG的順鉑

通過在0.01M NaOH中制備10mg/mL的聚合物溶液評估順鉑與羧化物修飾的HPG的結(jié)合。添加順鉑至這些溶液，從而使得藥物的最終濃度范圍0.5-4mg/mL。用少量的5M NaOH將每一溶液的pH調(diào)至6.0。在37℃下溶液孵育過夜，并且以50轉(zhuǎn)速搖動。將溶液轉(zhuǎn)移至Nanosep 3K Omega離心過濾裝置(Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI)并且以5000轉(zhuǎn)速離心10分鐘。用0.01M NaOH將少量過濾液(10-40μL)稀釋至400μL，通過早先描述的鄰苯二胺(OPDA)比色分析測定(Haxton,K.J.；Burt,H.M.Dalton Trans.2008,5872-5875)測定過濾液中未結(jié)合的順鉑的濃度。通過從添加至HPG的藥物最初濃度減去過濾液中發(fā)現(xiàn)的未結(jié)合的順鉑的濃度確定與HPG結(jié)合的順鉑的濃度。

通過協(xié)調(diào)藥物至聚合物上末端的羧化物基團獲得順鉑與HPG的結(jié)合(圖36)。對HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃而言，順鉑與聚合物的結(jié)合接近100％，效率達到最大的1mg/mL(10％w/w；圖37)。在該濃度以上，在過濾液中檢測到游離的藥物，這表明了羧化物結(jié)合位點的飽和及介質(zhì)中未結(jié)合藥物的存在。在過濾液中檢測到游離的藥物之前，HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈結(jié)合達到2mg/mL，有100％效率。結(jié)合藥物中的這種增加是羧化物基團數(shù)量增加的結(jié)果，因此，HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈上順鉑結(jié)合位點的數(shù)量與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃上順鉑結(jié)合位點的數(shù)量比較。

實施例26：體外順鉑釋放

順鉑與如上文所述的羧化物修飾的HPG結(jié)合，最終的聚合物濃度與順鉑濃度分別為10mg/mL與1mg/mL。添加20μL順鉑結(jié)合的聚合物溶液或1mg/mL游離的順鉑的溶液至7000MWCO Slide-A-Lyzer微型透析單元(Thermo Scientific,Rockford,IL)并且樣品在37℃下透析攪拌，以4L的1mM PBS作參比，pH調(diào)至4.5、6.0以及7.4或pH7.0合成的尿液。合成的尿液(Surine)購于Dyna-Tek Industries(Lenexa,KS)。在預(yù)設(shè)的時間點上，從釋放介質(zhì)移除三個透析單元并且用透析單元的三次洗滌以及隨后用新鮮的釋放介質(zhì)稀釋至1mM除去全部的內(nèi)容物。通過OPDA比色分析測定確定透析內(nèi)容物的順鉑濃度。通過從實驗開始時透析袋中最初的藥物量減去殘余的藥物量計算釋放藥物的積聚百分比。數(shù)據(jù)表示為根據(jù)時間變化釋放藥物的積聚百分比。

游離的順鉑在PBS中的釋放迅速并且在7小時內(nèi)100％完全釋放，這證明了膜沒有在較大程度上阻礙游離藥物的釋放(圖38)。對所有結(jié)合順鉑的HPG樣品而言，發(fā)現(xiàn)藥物以控制的方式釋放，比游離藥物慢相當(dāng)大。PBS中，不管pH多少，與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃結(jié)合的順鉑以接近相同的速率在PBS中釋放，首先的2小時內(nèi)，釋放了大約5％，1天后釋放了40％，并且7天后釋放高達90％。與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈結(jié)合的順鉑在pH6.0與pH7.4時以相似的速率在PBS中釋放藥物，接近線性方式，2小時內(nèi)釋放結(jié)合的順鉑大約3％，1天內(nèi)釋放了20％，并且7天后釋放高達70％。對與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈結(jié)合的順鉑而言，在pH4.5時的釋放速率快于在它更高的pH時釋放速率，釋放屬性與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃的那些相似。順鉑的釋放速率在尿液存在時相當(dāng)?shù)乜欤?小時內(nèi)釋放了稍微超過10％的劑量并且對HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃而言2天，對HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈而言3天，藥物完全釋放。與PBS中釋放相似，順鉑在這兩種HPG釋放的差異可能是HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈上存在的羧化物基團數(shù)量增加的結(jié)果。因為尿液為由幾種組分組成的復(fù)合混合物，不確定的是哪種化合物負(fù)責(zé)順鉑從HPG的增加式釋放；然而，這種增加的釋放速率可能是有利 的，提供了尿液一稀釋，藥物釋放就增加的機制。根據(jù)順鉑從HPG的取代，可能的是尿液中含氮化合物，諸如尿素、尿酸以及肌酸酐，可與順鉑結(jié)合并且使其失活。盡管順鉑已顯示了與這些化合物在一定程度上的復(fù)合，確定的是IV(靜脈注射)給藥后尿液中存在的大部分順鉑以最初給藥的形式呈現(xiàn)并且高度活化的三維網(wǎng)狀鎘水解產(chǎn)物(Tang,X.；Hayes Ii,J.W.；Schroder,L.；Cacini,W.；Dorsey,J.；Elder,R.C.；Tepperman,K.Met.Based Drugs 1997,4,97-109)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，很可能的是來自尿液中HPG所釋放的大部分順鉑以藥理活化形式呈現(xiàn)。

實施例27：細(xì)胞毒性評估

利用MTS細(xì)胞增殖測定(Promega,Madison,WI)進行細(xì)胞毒性研究。該測定沒有測量試劑的直接細(xì)胞溶解效應(yīng)，但是測量了聚合物隨長時間周期對細(xì)胞增殖的影響。在該研究中，由M.Tachibana博士(Keio University,Tokyo,Japan)友好地提供KU7-熒光素酶膀胱癌細(xì)胞。細(xì)胞以5000個細(xì)胞/孔沉積于96孔平板上180μL補充了10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen Canada,Inc.,Burlington,ON)、1％青霉素-鏈霉素以及1％左旋谷氨酰胺的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)(Invitrogen Canada,Inc.,Burlington,ON)并且允許在37℃下、5％CO₂中生長24小時以達到大約80％融合用于細(xì)胞毒性測定。然后將細(xì)胞與HPG單獨地孵育2小時或72小時，范圍為0.01-100mg/mL，或?qū)⒓?xì)胞與游離的順鉑或負(fù)載順鉑的HPG單獨地孵育2小時或72小時，藥物濃度范圍0.01-100μg/mL。處理后，用漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)洗滌細(xì)胞兩次并且添加180μL新鮮的培養(yǎng)介質(zhì)至每個孔并且允許細(xì)胞生長72小時。如早先所述的(Mugabe,C.；Hadaschik,B.A.；Kainthan,R.K.；Brooks,D.E.；So,A.I.；Gleave,M.E.；Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978-986)，利用CellTiter96水非放射性細(xì)胞增殖測定(Promega,Madison,WI)測量這些細(xì)胞的增殖。簡而言之，將HBSS中180μL 10％v/v的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基酚)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑溶液添加至每個孔并且孵育細(xì)胞2小時。利用微板閱讀器，以620nm作參照，在490nm處測量吸光度。

研究孵育時間2小時與72小時無藥物負(fù)載的HPG與負(fù)載順鉑的HPG對KU7-熒光素酶膀胱癌細(xì)胞的抑制作用(圖39)。選擇這些孵育時間考慮到模擬典型的膀胱內(nèi)灌注期以及比較抗早先確定的順鉑抑制濃度。確定孵育2小時50％處的抑制濃度(IC₅₀)，對HPG-C_8/10-OH、HPG-C_8/10-MePEG_6.5、HPGC_8/10-MePEG_6.5-COOH₃₄₈以及HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH₁₁₃而言，分別為1.3、45.7、47.0以及63.0mg/mL。當(dāng)使用72小時孵育時，聚合物抑制細(xì)胞增殖的程度大于2小時孵育時所發(fā)現(xiàn)的聚合物抑制細(xì)胞增殖的程度。HPG-C_8/10-OH與HPG-C_8/10-MePEG_6.5分別具有0.1與0.2mg/mL IC₅₀。對羧化物修飾的HPG而言，IC₅₀減少了大約10倍，然而，這些聚合物仍然顯示了高度的細(xì)胞相容性，IC₅₀值大約5mg/mL。HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-COOH的總體極好的生物相容性很可能起因于MePEG表面已知的細(xì)胞相容性，確保與細(xì)胞的漿膜很少的相互作用。羧酸化作用增加的益處起因于這一部分在pH7.4的網(wǎng)狀負(fù)電荷，建立了與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面輕微的排斥力。72小時孵育后，游離的順鉑抑制KU7-熒光素酶細(xì)胞增殖，IC₅₀為1μg/mL(圖40A)，與早先對這一藥物和細(xì)胞組合的報道一致(Hadaschik,B.A.；ter Borg,M.G.；Jackson,J.；Sowery,R.D.；So,A.I.；Burt,H.M.；Gleave,M.E.BJU Int.2008,101,1347-1355)。伴隨2小時孵育，該IC₅₀值增加至大約10μg/mL(圖40B)。當(dāng)與HPG-C_8/10-MePEG_6.5-COOH聚合物結(jié)合時，順鉑的復(fù)合形式也抑制了KU7-熒光素酶增殖，2小時孵育時觀察到更高的IC₅₀(大約50μg/mL)，與72小時孵育值相比(大約5μg/mL)。無疑地，對2小時孵育與72小時孵育而言，順鉑的復(fù)合形式抑制細(xì)胞增殖少于游離的藥物幾乎5倍。與HPG復(fù)合的藥物的IC₅₀的這一增加很可能由于藥物從聚合物的緩慢釋放速率。

實施例28：預(yù)處理或沒有預(yù)處理時，來自不同制劑的DTX與絲裂霉素F滲透至豬膀胱組織

評估來自DTX制劑的DTX與來自絲裂霉素F制劑的絲裂霉素F滲透至豬膀胱組織。將新鮮切離的豬膀胱組織切片置于Franz擴散細(xì) 胞并且用Tween 80、HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂中制備的抗癌藥物DTX處理2小時。在一些實驗中，用殼聚糖溶液(沒有藥物)或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶液(沒有藥物)預(yù)處理豬膀胱組織1小時，在用Tween 80、HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂中制備的DTX處理前。對絲裂霉素F滲透研究而言，將新鮮切離的豬膀胱組織切片置于Franz擴散細(xì)胞并且用抗癌藥物絲裂霉素F制劑處理2小時。在用絲裂霉素F制劑處理前，用HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶液(沒有藥物)預(yù)處理豬膀胱組織1小時。獲得組織濃度與組織深度剖面圖并且從曲線下面積(AUC)計算獲得藥物暴露量。

HPLC等級的乙腈與二氯甲烷獲取自Fisher Scientific(Fairlawn,NJ)。液體閃爍流體CytoScint^TMES，購于MP Biomedicals(Irvine,CA)。臺氏(Tyrode)鹽購于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)(臺氏液包含下列以g/L為單位的成分：NaCl8.0,KCl0.3,NaH₂PO4.5，H₂O0.093,KH₂PO₄0.025,NaHCO₃1.0,葡萄糖2.0)。多西紫杉醇獲取自Natural Pharma(Langley BC.Canada)。商品化20mg/0.5mL(Sanofi Aventis,Laval,QC)購于溫哥華市公立醫(yī)院的BC癌癥代理處。乙醇中氚標(biāo)記的DTX購于Moravek Biochemicals(Brea,CA)，具有23.2Ci/mmol的特異活性。通過修改實施例10中所述的方案制備HPG-C_8/10-MePEG并且通過修改實施例18中所述的方案制備HPG-C_8/10-MePEG-NH₂。殼聚糖由Novamatrix FMC供應(yīng)。豬膀胱購于Britco Inc.(Langley,BC)。就地從6-10月齡90-113kg重量的公豬上移除新鮮切離的含尿膀胱。

利用不同的方法，包括正向滴定方法、反向滴定方法以及熒光胺測定(表14)，測量HPG-MePEG-NH₂聚合物中每摩爾HPG-MePEG-NH₂中胺的摩爾。

表14胺的摩爾/摩爾HPG-MePEG-NH₂測量

^a正向滴定方法-HCl作參比滴定

^b反向滴定方法-添加已知量的HCl后NaOH作參比滴定

^c用熒光胺衍生作用后熒光定量(實施例15中所述的熒光胺測定)

負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG、HPG-C_8/10-MePEG-NH₂以及Tween 80制劑的制備

利用溶劑蒸發(fā)技術(shù)，制備負(fù)載DTX的HPG-C_8/10-MePEG與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂。將DTX與HPG-C_8/10-MePEG或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶解于乙腈并且在60℃下烘箱中干燥1小時，用氮氣閃耀以除去有機溶劑的痕跡。干燥前，將聚合物/藥物溶液與小等份的³H DTX形成峰值。由此得到的聚合物/藥物基質(zhì)與60℃臺氏緩沖液(pH7.4)重組并且渦旋2分鐘。藥物的最終濃度為0.5mg/mL并且在37℃下使用。通過用臺氏緩沖液稀釋濃縮溶液(含40mgDTX與1040mgTween 80/mL)以產(chǎn)生最終濃度為0.5mg/mL DTX，在Tween 80中制備DTX。稀釋前將少量的³H DTX摻入溶液。

絲裂霉素F制劑的制備

在臺氏緩沖液中制備絲裂霉素F(MW＝363.4)。它來自于American Radiolabeled Chemicals Inc(St Louis,MO)Cat#ART-1689?；钚詾?-10Ci/mmol，乙醇中1mCi/mL。通過將50μL乙醇儲備液溶解于3mL緩沖液，300x稀釋液。

用于用作預(yù)處理的殼聚糖溶液與HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶液的制備

用于制備殼聚糖溶液的殼聚糖為PROTASAN^TM UP CL 213(Product#:4210106)并且基于其中75-90％的鯨蠟基移除的殼聚糖。陽離子的聚合物為高度純化的并且以可溶于水的氯化鹽為良好特征。通常，PROTASAN^TM UP CL 213的分子量在150000-400000g/mol范圍(作為殼聚糖醋酸鹽所測量的)。通過將它溶解于水中以使溶液濃度為0.5％w/v制備殼聚糖溶液。

通過將HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶解于乙腈制備用于用作預(yù)處理的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶液。60℃下將由此得到的溶液在烘箱中干燥1小時并且用氮氣閃耀以清除有機溶劑的痕跡。由此得到的聚合物與60℃臺氏緩沖液(pH 7.4)重組并且渦旋2分鐘。

組織制備

除去新鮮切離的豬膀胱外壁上過量的脂肪組織并且縱向地切開左外側(cè)與右外側(cè)，在37℃下充溢著氧和5％二氧化碳的混合氣(95％O₂/5％CO₂)的臺氏緩沖液淺浴中將其切成大約2cm x 2cm的碎片。在處死后5小時內(nèi)進行所有研究。將膀胱碎片置于Franz擴散細(xì)胞裝置上，從而使得膀胱壁的腔側(cè)面暴露于藥物溶液。這些組織切片沒有拉伸并且測量大約2-3mm厚。受體腔內(nèi)充滿了10mL 37℃的臺氏緩沖液(pH7.4)。修剪擴散細(xì)胞的視野計周圍過量的組織。擴散細(xì)胞的供體腔充滿了1mL0.5mg/ml的藥物溶液并且組織暴露面積為0.64cm²。將每一擴散細(xì)胞設(shè)置在淺水浴中并且在37℃下孵育2小時。對一些實驗而言，在用負(fù)載DTX或絲裂霉素F的制劑處理前，用殼聚糖溶液(沒有藥物)或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂溶液(沒有藥物)對組織樣品預(yù)處理1小時。用臺氏緩沖液洗滌組織樣品三次以除去所有未結(jié)合的藥物。修剪組織樣品并且用干冰床上的液態(tài)氮在金屬板上快速冰凍。

組織的低溫切片機切片

用Shandon Cryomatrix^TM(Themo Scientific,Pittsburgh,PA)將冰凍的膀胱組織置于低溫切片機的載物架上。在-20℃下，在具有R404A冷凍系統(tǒng)的Shandon電子的低溫切片機(Cryotome Electronic)(Thermo Electron Corporation,Cheshire,England)上，用Shandon MB35Premier Low Grade Microtome Blades(Themo Scientific,Pittsburgh,PA)將膀胱組織切片。將組織切片。將組織切片置于預(yù)先稱重的1.5mL微量離心管中并且冰凍儲存在-20℃。

組織中藥物的定量

將200μL乙腈添加至稱重的組織薄片用于藥物提取。渦旋樣品直至所有的組織薄片浸入乙腈中并且在室溫下保持24小時以確保藥物 的完全提取。將包括所有組織薄片的提取的樣品轉(zhuǎn)移至閃爍小瓶并且添加5mL閃爍液。通過液體閃爍計數(shù)測量³H DTX或³H絲裂霉素F的計數(shù)并且利用來自于最初的儲備液的校準(zhǔn)圖定量。

組織的水平-深度剖面圖的分析

分析組織的水平-深度剖面圖用于平均的DTX或絲裂霉素F濃度，所述濃度為膀胱壁向下至肌肉的所有層，例如尿路上皮、固有層以及肌層。組織層中發(fā)現(xiàn)的藥物的總量除以那一層的總組織重量確定平均組織水平。利用線性梯形規(guī)則計算組織-水平深度剖面圖下的面積(AUC)，如下：

其中，t為組織深度以μm為單位，并且C為濃度以μg/g為單位。

通過在0μm處藥物濃度(μg/g)的外推獲得估算以便計算AUC。

沒有預(yù)處理時，DTX從DTX制劑滲透至豬膀胱組織的數(shù)據(jù)顯示于圖41中。dHPG評估含胺導(dǎo)致至約1500μm的深度更高的藥物濃度，與沒有胺的制劑相比，包括Tween 80制劑和不包含官能性胺的dHPG。觀察到胺添加的效應(yīng)為濃度依賴性的。圖41顯示，利用含最高的胺含量的dHPG制劑(37mol/mol)，尤其是在約1500μm的深度獲得組織中最高的藥物濃度。已計算了在標(biāo)明的組織深度范圍處AUCs(表15a與15b)，顯示dHPG制劑在Taxotere處改善范圍1.3-2.4倍。已計算了在標(biāo)明的組織深度范圍處Cavg與Cmax值(表15c)。

表15a沒有預(yù)處理各種媒介中遞送多西紫杉烷的滲透所計算的AUC(180-2640μm)

表15b沒有預(yù)處理各種媒介中遞送多西紫杉烷的滲透所計算的AUC(180-1560μm)

表15c對沒有預(yù)處理各種媒介中遞送多西紫杉烷的滲透而言，180-2640與180-1560組織深度(μm)的范圍所計算的Cavg與Cmax值

來自用殼聚糖或HPG-C_8/10-MePEG-NH₂預(yù)處理的DTX制劑的DTX滲透至豬膀胱組織的數(shù)據(jù)顯示于圖42與43。實驗的目的是從殼聚糖辨別dHPG聚合物的功能，所述殼聚糖也是包含胺功能的聚合物。已關(guān)注殼聚糖作為聚合物用于膀胱內(nèi)遞送；然而，在預(yù)處理以促進藥物攝取至組織的上下文中，證明了某些組合物的dHPG為優(yōu)越的。數(shù)據(jù)顯示，用殼聚糖預(yù)處理，Tween 80制劑提供了相對少的組織滲透，提供多西紫杉醇在膀胱中所有組織深度最低的組織濃度。相似地，殼聚糖預(yù)處理導(dǎo)致了多西紫杉醇在組織滲透中適度的改善，當(dāng)藥物以HPG-C_8/10-MePEG(沒有胺)媒介給藥時，然而這只是優(yōu)于Taxotere處理的(殼聚糖預(yù)處理)組。當(dāng)dHPG包含胺(37mol胺/聚合物mol)(圖42與43中稱為HPG-C_8/10-MePEG-NH₂)時，觀察到多西紫杉醇組織滲透中的優(yōu)越效應(yīng)。同樣地，殼聚糖對遞送沒有提供益處，當(dāng)它用作負(fù)載多西紫杉醇的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂制劑的預(yù)處理時。通過測量隨組織深度變化的(圖42)組織濃度的曲線下面積(AUC，圖43)比較每個的性能，其為總藥物暴露量的測量。結(jié)果顯示當(dāng)預(yù)處理或處理利用含胺的dHPG時，獲得最大的暴露量。針對180-3360組織深度(μm)范圍所計算的AUC值，針對180-1560與180-3360組織深度(μm)范圍所計算的Cavg與Cmax值，以及各種預(yù)處理方案后來自于各種制劑的多西紫杉醇的滲透顯示于表15d和15e中。

表15d各種預(yù)處理方案后用各種媒介遞送多西紫杉醇的滲透所計算的AUC(180-3360μm)

表15e各種預(yù)處理方案后用各種媒介遞送多西紫杉醇的滲透180-1560與180-3360組織深度(μm)范圍所計算的Cavg與Cmax(180-3360μm)

用HPG-C_8/10-MePEG-NH₂預(yù)處理，絲裂霉素F滲透至豬膀胱組織的數(shù)據(jù)顯示于圖44中。

豬膀胱離體滲透研究的掃描式電子顯微鏡(SEM)圖像

上文實施例28中所觀察的藥物滲透效應(yīng)與暴露于各種治療后膀胱組織的出現(xiàn)有關(guān)。對這些實驗而言，沒有使用藥物并且使用單一的暴露于單一的媒介/膀胱。2小時暴露時間后，收獲膀胱組織，用緩沖液漂洗并且用4％多聚甲醛及2％戊二醛固定過夜，用1％OsO₄后固定，乙醇中脫水，臨界點干燥。將整個膀胱分成兩個并且用金噴射涂。通過SEM(Hitachi S4700,3-5kV)檢查全部的表面并且記錄代表性圖像(最小值3個視野/樣品)。顯示代表性圖像(大約130μm寬x100μm高)。

SEM圖像展現(xiàn)只用緩沖液處理的膀胱的尿路上皮以及用HPG-C_8/10-MePEG(沒有胺)處理的膀胱顯示了完整的或大部分完整的尿路上皮，例如沒有雨傘細(xì)胞的缺失。相比之下，暴露于殼聚糖預(yù)處理媒介后，膀胱的表面在外觀上非常不同，尿路上皮缺失了雨傘細(xì)胞的頂層(圖45)。暴露于具有10mol胺/HPG mol的溶液濃度1與10％w/v的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂后，觀察到雨傘細(xì)胞從尿路上皮部分的缺失(圖46)。相比之下，當(dāng)使用具有較高胺含量的HPG-C_8/10-MePEG-NH₂(37mol/mol)時，觀察到效應(yīng)為濃度依賴性的。0.1％w/v的溶液濃度導(dǎo)致了膀胱表面外觀很少或沒有改變，而在用具有濃度分別為1％w/v與10％w/v的溶液處理后觀察到雨傘細(xì)胞部分及完全的缺失(圖46)。不受理論約束，據(jù)信胺效應(yīng)可以改變膀胱的表面，影響其至藥物滲透性的改變。效應(yīng)顯示為胺含量與聚合物濃度依賴性的。

實施例29：小鼠膀胱的體內(nèi)滲透研究

評估不同的制劑(沒有藥物)暴露對小鼠膀胱的影響。利用4％異氟烷與2L/min O₂麻醉8-11周大小雌性無胸腺裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)至深層面。膀胱完全地表達并且經(jīng)由外科植入的導(dǎo)管灌注制劑。在將潤滑的24號Jelco血管導(dǎo)管(BDickenson)穿過尿道至膀胱之前將聚丙烯荷包縫合置于尿道口周圍。注射50μL體積，將動物輕微地反轉(zhuǎn)(顱側(cè)地)并且當(dāng)迅速地移除導(dǎo)管時結(jié)扎荷包縫合。將小鼠保持麻醉狀態(tài)(1.5-2％異氟烷2L/min O₂)直至完成2小時灌注。去除荷包縫合并且允許動物恢復(fù)過來。

制備的計量溶液為無色澄清的至輕微琥珀色的溶液。聚合物溶液濃度為1％w/v或10％w/v。使用沒有胺內(nèi)容物的HPG-MePEG聚合物以及兩種具有8-10mol(低的)與37mol(高的)胺/HPG摩爾(基于所謂的HPG分子量65kg/mol)的HPG-MePEG-NH₂聚合物。計量濃度結(jié)果總結(jié)于表16中。

表16制劑濃度總結(jié)

意指沒有檢測

從每只小鼠切除膀胱用于SEM與組織學(xué)研究。給藥后觀察所有的 動物2小時并且在之前采集每一組織用于死亡率和發(fā)病率研究。沒有記錄到死亡率或發(fā)病率的跡象，除了在灌注部位一些少量的血液之外。

SEM分析

用PBS洗滌組織3次，用2％多聚甲醛固定過夜然后轉(zhuǎn)移至0.1M卡可酸鹽緩沖液。室溫下用1％四氧化鋨后固定組織1小時，然后在乙醇中脫水，與水混合，增加乙醇在混合物中的百分比，開始為30，增加至100％。通過臨界點脫水干燥樣品，然后用鈀金噴涂兩次(一次在90°，第二次時間在45°)。用Bioimaging Facility Hitachi S4700掃描式電子顯微鏡檢測樣品。將每一膀胱顯示于低放大率然后在高放大率下再次檢測全部的表面。在各種放大率下進行多次檢測(9-10圖像)。

表17制劑濃度總結(jié)

意指不可應(yīng)用的。意指沒有檢測。

完整的:沒有雨傘細(xì)胞缺失的跡象

+:非常少的或部分的雨傘細(xì)胞的缺失

++:實質(zhì)的或完全的雨傘細(xì)胞的缺失

用PBS 2小時灌注處理的小鼠膀胱表面具有完整的雨傘細(xì)胞層并且具有如圖47中小鼠膀胱表面的SEM圖像所見的折疊的外觀。用10％w/v HPG-MePEG溶液2小時灌注處理的小鼠膀胱表面在2小時灌注期后就具有完整的雨傘細(xì)胞層。在HPG-MePEG溶液灌注后6小時與24小時也觀察到完整的雨傘細(xì)胞層(圖48)。如圖48所示，表面的細(xì)胞具有扁平的外觀。用10％w/v HPG-MePEG-NH₂(10mol/mol)溶液2小時灌注處理的小鼠膀胱表面在2小時灌注期后就具有完整的雨傘細(xì) 胞層(圖49)。10％w/v HPG-MePEG-NH₂(10mol/mol)溶液灌注后6小時時，小鼠膀胱表面表現(xiàn)出單一的雨傘細(xì)胞的缺失，暴露了上皮的底層。相同的灌注后24小時時，小鼠膀胱表面具有完整的雨傘細(xì)胞表面層(圖49)。用1％w/v HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)溶液2小時灌注處理的小鼠膀胱表面表現(xiàn)出雨傘細(xì)胞的完全缺失，如圖50所示2小時灌注期后就暴露了上皮的底層。1％w/v HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)溶液灌注后6小時時，小鼠膀胱表面仍然表現(xiàn)出雨傘細(xì)胞實質(zhì)的缺失。1％w/v HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)溶液灌注后24小時時，小鼠膀胱表面具有部分地完整的表面(圖50C的上部分)，伴有雨傘細(xì)胞顯著的缺失(圖50C的左下角)。10％HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)溶液2小時灌注處理的小鼠膀胱表面表現(xiàn)出雨傘細(xì)胞的完全缺失，如圖51所示2小時灌注期后就暴露了上皮的底層。10％HPG-MePEG-NH₂(37mol/mol)溶液灌注后6小時時，小鼠膀胱表面也表現(xiàn)出雨傘細(xì)胞的完全缺失。灌注后24小時時，小鼠膀胱表面具有完整的雨傘細(xì)胞層，然而，表面的細(xì)胞顯得比其他觀察到的完整層更小并且在外觀上更扁平(圖51)。觀察到制劑對雨傘細(xì)胞缺失的影響取決于dHPG的胺含量與dHPG濃度。

組織學(xué)

在緊密連接的改變、細(xì)胞的剝落以及炎性細(xì)胞的侵潤方面評估組織。組織學(xué)分析結(jié)果總結(jié)于表18中。如自組織學(xué)結(jié)果中所可以見到的，在暴露于dHPG制劑后，沒有在小鼠膀胱表面觀察到炎癥與壞死的跡象。

表18小鼠膀胱表面的組織學(xué)

尿液分析

在處死時收集尿液。在將動物安樂死后，暴露膀胱并且通過膀胱穿刺與穿過25G針的撤回除去它的內(nèi)容物。尿液儲存于冰上(但是沒有冰凍)并且運輸用于評估。用細(xì)胞的存在分析尿液。將幾滴尿液置于顯微鏡載玻片上并且通過顯微鏡觀察細(xì)胞的存在。用血球計載玻片計數(shù)任何的細(xì)胞存在。在2小時灌注后以及在膀胱收獲的時候(2,6,24小時)就自小鼠收獲的尿液中細(xì)胞計數(shù)顯示于圖52中。

血液分析

通過CO₂吸入終止，通過心臟穿刺在最后一次呼吸后就收集血液，將大約500μL-700μL置于乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中。將每只管反轉(zhuǎn)幾次以確保血液與EDTA均勻地混合以防止凝固。將血液樣品儲存在冰上直至對特定的時間點而言收集全部的樣品然后處理以產(chǎn)生血漿。通過在4℃下以2500轉(zhuǎn)速將樣品離心15分鐘(轉(zhuǎn)速基于BeckmanGH 3.8A轉(zhuǎn)子，RCF_avg 200xg)。用移液器移取血漿上清液，將其置于標(biāo)記小瓶中并且儲存在-80℃。利用MesoScale平臺與標(biāo)準(zhǔn)的檢測試劑盒，用TNFα水平分析血液。在用各種制劑灌注后2、6以及24小時時小鼠血液中循環(huán)的TNFα水平顯示于圖53中。在任何樣品中都沒有檢測到TNFα。

盡管本文公開了發(fā)明的各種實施方案，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的 一般常識在本發(fā)明的范圍內(nèi)做出許多改變與修飾。此類修飾包括對發(fā)明的任何方面而言，已知的等同物的取代，為獲得相同的結(jié)果以基本上相同的方式。數(shù)值范圍包括界定該范圍的數(shù)字。本文所用的詞語“包括(comprising)”如任一開放式的術(shù)語，基本上等同于短語“包括,但不限于”，并且詞語“包括(comprises)”具有相應(yīng)的意義。如本文所用的，單數(shù)形式“a”,“an”以及“the”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文明確另有規(guī)定。因此，例如提及“a thing”包括不止一個此類東西。

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