本發(fā)明涉及一株瑞士乳酸菌及其應(yīng)用，具體為一株適用于食醋釀造并可以提高食醋中乳酸含量的瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus HS1-8)，屬于微生物應(yīng)用和食醋釀造領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳酸菌廣泛分布于自然界中，與人類生活密切相關(guān)，具有多種生理功能。隨著現(xiàn)代微生物學(xué)的發(fā)展，食品級(jí)乳酸菌的優(yōu)良特性引起微生物界的關(guān)注，乳酸菌已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、果蔬制品、軟飲料等食品。乳酸菌在釀造工業(yè)中的應(yīng)用也受到越來越多的關(guān)注。

乳酸具有酸味柔和、刺激性小，可以緩和醋酸刺激的酸味，同時(shí)具有在消化道內(nèi)降解代謝，產(chǎn)生能量，能起利利尿和緩瀉作用，對(duì)肝糖原的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和體液均起到良好作用。鎮(zhèn)江香醋是我國傳統(tǒng)四大名醋之一，具有醇香濃厚，回味悠長的特點(diǎn)。不揮發(fā)酸是鎮(zhèn)江香醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)，而且《GB/T 18623-2011地理標(biāo)志產(chǎn)品鎮(zhèn)江香醋》中要求特級(jí)鎮(zhèn)江香醋的不揮發(fā)酸(以乳酸計(jì))含量≥1.60g/100ml。鎮(zhèn)江香醋中的不揮發(fā)酸以乳酸為主，乳酸含量可以占總不揮發(fā)酸的80％以上。

在實(shí)際的食醋發(fā)酵生產(chǎn)過程中，除了主導(dǎo)醋酸發(fā)酵的醋酸菌以外，乳酸菌也是釀造過程中常見的、重要的微生物，并對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)起著重要的作用。傳統(tǒng)發(fā)酵過程中乳酸菌的主要來源為天然原料帶入和帶種時(shí)帶入，在不同的季節(jié)、不同批次之間具有較大的差異，尤其在冬季乳酸的含量明顯偏低。此外，帶入的部分乳酸菌在發(fā)酵過程中因不適應(yīng)高乙醇、高醋酸等特殊釀造環(huán)境而無法增值。因此，篩選出適合食醋特殊釀造環(huán)境的乳酸菌，應(yīng)用于食醋的釀造具有重要的意義。

本發(fā)明針對(duì)上述課題，本發(fā)明提供一株適合應(yīng)用于食醋釀造的瑞士乳桿菌，該菌株可直接應(yīng)用于食醋的釀造，可明顯提高食醋中乳酸的含量，改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品品質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)工藝過程的酒醪中分離篩選得到一株較適合于食醋釀造使用的瑞士乳桿菌。該乳酸菌的應(yīng)用可明顯提高食醋中乳酸的含量，改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品品質(zhì)。

具體地，該瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus HS1-8，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.12225，保藏日期為2016年3月18。

其分離、純化及鑒定方法如下：

(1)分離

取10ml經(jīng)過接種鎮(zhèn)江香醋特制大曲后經(jīng)過酒精發(fā)酵的酒醪樣品，取1ml樣品加入到9ml無菌生理鹽水中，在漩渦混合器上混和均勻后，再取1ml稀釋過的溶液加入到9ml的生理鹽水中，以此類推。選取3個(gè)合適的濃度依次涂布到添加有碳酸鈣的MRS固體平板上，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

分離培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)：酪蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，酵母粉4.0g，牛肉粉8.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，吐溫80 1.0g，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH6.2±0.2。固體培養(yǎng)基添加15～20g/L瓊脂粉。篩選培養(yǎng)基添加15～20g/L碳酸鈣。

(2)菌株純化

根據(jù)微生物菌落的大小、顏色、光澤、透明度等，挑取鈣溶解圈較大的疑似乳酸菌菌落，并利用劃線的方法在MRS平板上劃線純化2次。挑取劃線后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌種在斜面上進(jìn)行劃線后，37℃厭氧培養(yǎng)48h后置于4℃冰箱保存。

(3)菌株初篩

將保存的菌株分別接種到含有9％vol乙醇的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值，選取pH值低于4.0的菌株。

同時(shí)將該菌株接種到pH值4.0的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

得到一株耐乙醇、耐酸、產(chǎn)酸特性較好的菌株HS1-8，其菌落形態(tài)如圖1所示。

(4)生理生化特性

表1生理生化特性

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性，“W”生長弱。

(5)菌株分子生物學(xué)鑒定

檢測(cè)菌株HS1-8的16S rRNA的序列。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取本發(fā)明篩選到的菌株HS1-8的基因組DNA，PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，測(cè)序引物如下：

27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT

PCR反應(yīng)循環(huán)條件：

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：取5ul反應(yīng)產(chǎn)物，利用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如果PCR成功，在約1500bp處有條帶出現(xiàn)。

測(cè)序分析：將PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列如下文16S rRNA序列。測(cè)得的序列用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析。結(jié)果本發(fā)明菌株HS1-8與瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)DSM20075的16S rRNA同源性為99％。

菌株HS1-8的16S rRNA序列

CGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGCAATGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATCCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGAAGGAGCCGTCTAAGGCAGGGCAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGTTGGA

綜合以上結(jié)果，將本發(fā)明菌株命名為Lactobacillus helveticus HS1-8，于2016年3月18日將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.12225。

本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述瑞士乳桿菌在食醋生產(chǎn)中的應(yīng)用。

經(jīng)過試驗(yàn)表明，本發(fā)明的瑞士乳桿菌可以有效地提高鎮(zhèn)江香醋醋醅中乳酸的含量，有效地改善鎮(zhèn)江香醋的風(fēng)味與品質(zhì)。

有益效果：本發(fā)明提供一株適合食醋釀造的瑞士乳桿菌，可直接添加于食醋的釀造過程中，通過該乳酸菌的使用，可以改善因季節(jié)溫度變化、老菌種退化等問題引起的乳酸含量降低的問題。通過該乳酸菌的使用，可明顯提高醋醅中乳酸菌的相對(duì)豐度和鎮(zhèn)江香醋中乳酸的含量，改善鎮(zhèn)江香醋的風(fēng)味與品質(zhì)。

附圖說明

圖1為瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus HS1-8的菌落形態(tài)圖；

圖2為發(fā)酵過程中接種后、露底和封醅時(shí)總酸的含量變化示意圖；

圖3為發(fā)酵過程中接種后、露底和封醅時(shí)乳酸的含量變化示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明從鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)工藝過程的酒醪中分離篩選得到一株較適合于食醋釀造使用的瑞士乳桿菌，該瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus HS1-8，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.12225，保藏日期為2016年3月18日。

下面通過具體的實(shí)施例詳細(xì)說明該瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus HS1-8在鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1.菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)

一級(jí)種子液的制備：按照5％的接種量，將純化的瑞士乳桿菌HS1-8接種到液體MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20h。

二級(jí)種子液的制備：選用50L液態(tài)發(fā)酵罐，加入35L處理過的米漿，米漿中米粉含量15％～25％，所述米漿的處理過程如下：100℃高溫糊化30min，添加6～8u/ml的淀粉酶保持85～90℃液化30min，然后添加100～300u/ml的糖化酶保持55～60℃糖化30min。添加2‰的脫脂奶粉后，115℃滅菌20min。按照5％的接種量接入一級(jí)種子液?？刂茰囟?7℃，罐內(nèi)壓強(qiáng)為0.05MPa，攪拌速度為60r/min，以NaOH溶液控制培養(yǎng)液pH值恒定為6.0，發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，乳酸菌的活菌數(shù)達(dá)到10⁹cfu/ml。

2.醋醅接種發(fā)酵

選取6個(gè)400kg大缸，每個(gè)缸中加入酒醪250kg，麩皮90kg，大糠50kg。選3個(gè)缸為試驗(yàn)組，每個(gè)缸中接入11L二級(jí)發(fā)酵種子液，剩余3個(gè)缸為對(duì)照組。按照鎮(zhèn)江香醋釀造工藝進(jìn)行帶種，翻醅發(fā)酵。

3.總酸和乳酸含量的檢測(cè)

發(fā)酵過程中，取接種后、露底和封醅時(shí)的鹵子進(jìn)行檢測(cè)。

總酸(以乙酸計(jì))采用酸堿滴定法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

乳酸采用高效液相色譜法，參照《GB/T 18623-2011地理標(biāo)志產(chǎn)品鎮(zhèn)江香醋》附錄B中方法，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

在醋酸發(fā)酵過程中，試驗(yàn)組和對(duì)照組的總酸含量沒有顯著性差異。在發(fā)酵過程中，試驗(yàn)組的乳酸含量明顯高于對(duì)照組，封醅時(shí)試驗(yàn)組乳酸含量比對(duì)照組提高11.4％。

本發(fā)明的菌株HS1-8可較好的作為乳酸菌強(qiáng)化菌種應(yīng)用于鎮(zhèn)江香醋的生產(chǎn)中，通過該菌株的強(qiáng)化可明顯提高鎮(zhèn)江香醋中的乳酸含量，提高產(chǎn)品品質(zhì)。