本發(fā)明屬于化學(xué)化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種己酸發(fā)酵菌種及己酸提取方法。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)60年代，研究發(fā)現(xiàn)濃香型窖池中的窖泥生長著大量的梭狀芽孢桿菌，經(jīng)篩選、培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量的己酸。自1942年巴克(Barker)等首次報(bào)道并定名克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)以來的50多年中，國內(nèi)外許多專家和學(xué)者對該細(xì)菌進(jìn)行了一系列的研究。生物法生產(chǎn)的己酸產(chǎn)品廣泛適用于食品添加劑、醫(yī)藥中間體、化妝品、香料、香精、脂肪醇行業(yè)的特點(diǎn)，產(chǎn)品極具市場競爭優(yōu)勢。外，隨著化石性資源的枯竭以及對產(chǎn)品質(zhì)量要求提高，化學(xué)合成產(chǎn)品面臨新挑戰(zhàn)，生物法生產(chǎn)己酸有很好開發(fā)前景。現(xiàn)在已酸的生產(chǎn)是以化學(xué)合成的方法，通過化學(xué)法合成的己酸價(jià)格昂貴，而且環(huán)境污染嚴(yán)重。隨著環(huán)境保護(hù)壓力的日益增大，綠色化學(xué)和可持續(xù)化學(xué)概念的提出，人們把精力越來越多地投向環(huán)境友好的合成方法的研究。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)己酸由于環(huán)境污染小，能耗低的特點(diǎn)，將成為行業(yè)發(fā)展的趨勢。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種己酸發(fā)酵菌種及己酸提取方法，旨在解決現(xiàn)在已酸的生產(chǎn)是以化學(xué)合成的方法，通過化學(xué)法合成的己酸價(jià)格昂貴，而且環(huán)境污染嚴(yán)重的問題。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種己酸發(fā)酵菌種，所述己酸發(fā)酵菌種為js-22-03，js-22-07，js-22-12。本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述己酸發(fā)酵菌種的獲取方法，所述獲取方法包括：復(fù)壯培養(yǎng)：保藏的己酸菌菌種活化，即熱處理，將保藏菌種接入無菌水，85-90℃水浴中處理10min后，接入試管培養(yǎng)液中，在33-35℃培養(yǎng)6d，菌種在繁殖旺盛期，擴(kuò)大培養(yǎng)到100ml三角瓶，搖勻后置于35℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)7天；擴(kuò)大培養(yǎng)：取己酸菌種子100ml直接加入到三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基900mL中，包扎搖勻后置于35℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)10天；菌種的誘變:從分離純化所得的菌株中，選擇產(chǎn)酸量較高者作為出發(fā)菌，在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌，用緩沖液制成細(xì)胞懸液，稀釋至細(xì)胞數(shù)為2×107個(gè)，取孢子懸液5mL，置于直徑為90mm的平板中，垂直置于15W紫外燈下，照射距離30cm，照射時(shí)間為1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培養(yǎng)皿中，倒入融化的固體培養(yǎng)基，待凝固后抽真空至0.08MPa，于33℃培養(yǎng)3d；篩選:從經(jīng)誘變處理的平板中，隨機(jī)挑取生長良好的單菌落多份，分別接種到試管斜面上，33℃培養(yǎng)7-10d，用血球計(jì)數(shù)板測定己酸菌細(xì)胞數(shù)，從中挑選細(xì)胞數(shù)超過1億個(gè)/mL的菌株為復(fù)篩菌株。進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基組成：乙酸鈉5g/L，酵母膏2g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L，硫酸銨0.5g/L，碳酸鈣15g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，乙醇2.5g/L。本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述己酸發(fā)酵菌種的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法的條件為：接種量13％，培養(yǎng)溫度35±0.5℃，初始pH7.0，滿裝液量深層培養(yǎng)，培養(yǎng)周期9-10d，可獲得最大產(chǎn)酸量為20.3g/L。本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述己酸發(fā)酵菌種的己酸提取方法，所述己酸提取方法包括以下步驟：發(fā)酵液→過濾→減壓濃縮→精餾→檢驗(yàn)→己酸。進(jìn)一步，所述提取參數(shù)控制：濃縮真空度0.09Mpa，精餾真空度0.09Mpa，頂溫溫度85℃、95℃。本發(fā)明提供的己酸發(fā)酵菌種及己酸提取方法，選育菌株傳代穩(wěn)定性較好，選育出的菌株比原菌株產(chǎn)率由1.20g/100mL提高1.90g/100mL；通過培養(yǎng)篩選獲得高產(chǎn)菌株js-22-03，js-22-07，js-22-12三株菌種，具有發(fā)酵時(shí)間短、遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)率高等特點(diǎn)，其發(fā)酵時(shí)間縮短到10天以內(nèi)，己酸產(chǎn)率由原來的1.20g/100mL提高到1.90g/100mL以上。己酸發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)，選育出高產(chǎn)己酸菌種1株；優(yōu)化菌株從5L到500L發(fā)酵罐己酸發(fā)酵工藝條件，確定最佳工藝參數(shù)，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵法生產(chǎn)己酸提供最適發(fā)酵工藝參數(shù)；菌株產(chǎn)酸在500L規(guī)模上平均達(dá)到1.80g/100ml，創(chuàng)新提制工藝；己酸提取收率達(dá)80％以上。接種量13％，培養(yǎng)溫度35±0.5℃，初始pH7.0，滿裝液量深層培養(yǎng)，培養(yǎng)周期9-10d，可獲得最大產(chǎn)酸量為20.3g/L。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的己酸發(fā)酵菌種的獲取方法流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的己酸含量變化的規(guī)律曲線示意圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的己酸發(fā)酵菌種的獲取方法包括以下步驟：S101：復(fù)壯培養(yǎng)：保藏的己酸菌菌種活化，即熱處理，將保藏菌種接入無菌水，85-90℃水浴中處理10min后，接入試管培養(yǎng)液中，在33-35℃培養(yǎng)6d，菌種在繁殖旺盛期，擴(kuò)大培養(yǎng)到100ml三角瓶，搖勻后置于35℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)7天；S102：擴(kuò)大培養(yǎng)：取己酸菌種子100ml直接加入到三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基900mL中，包扎搖勻后置于35℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)10天；S103：菌種的誘變:從分離純化所得的菌株中，選擇產(chǎn)酸量較高者作為出發(fā)菌，在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌，用緩沖液制成細(xì)胞懸液，稀釋至細(xì)胞數(shù)為2×107個(gè)，取孢子懸液5mL，置于直徑為90mm的平板中，垂直置于15W紫外燈下，照射距離30cm，照射時(shí)間為1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培養(yǎng)皿中，倒入融化的固體培養(yǎng)基，待凝固后抽真空至0.08MPa，于33℃培養(yǎng)3d；S104：篩選:從經(jīng)誘變處理的平板中，隨機(jī)挑取生長良好的單菌落多份，分別接種到試管斜面上，33℃培養(yǎng)7-10d，用血球計(jì)數(shù)板測定己酸菌細(xì)胞數(shù)，從中挑選細(xì)胞數(shù)超過1億個(gè)/mL的菌株為復(fù)篩菌株。本發(fā)明實(shí)施例的己酸的提取方法包括以下步驟：發(fā)酵液→過濾→減壓濃縮→精餾→檢驗(yàn)→己酸。提取參數(shù)控制：濃縮真空度0.09Mpa，精餾真空度0.09Mpa，頂溫溫度85℃、95℃，提制收得率≥80％，生產(chǎn)出己酸產(chǎn)品達(dá)到食品級標(biāo)準(zhǔn)，己酸含量≥98％。下面結(jié)合試驗(yàn)對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的描述。第一部分菌種選育的研究己酸是一種天然香料，又名單油酸，無色或澄黃色，油狀液體，有不愉快氣味，比重0.9265g/cm3，沸點(diǎn)205度，易溶于醇和醚，微溶于水。是合成己酸乙酯、烯丙酯、異戊酯等重要香料的主要原料，廣泛用于化妝品、食品工業(yè)、飲料、卷煙、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)。從窖泥中自行篩選的一株梭狀芽孢桿菌js-03為出發(fā)菌株，進(jìn)行復(fù)合誘變處理，先后進(jìn)行了紫外線照射和CO60照射以及亞硝基胍等物理化學(xué)方法誘變處理，通過培養(yǎng)篩選獲得高產(chǎn)菌株js-22-03，js-22-07，js-22-12三株菌種，具有發(fā)酵時(shí)間短、遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)率高等特點(diǎn)，其發(fā)酵時(shí)間縮短到10天以內(nèi)，己酸產(chǎn)率由原來的1.20g/100mL提高到1.90g/100mL以上。在選育出優(yōu)良菌種基礎(chǔ)上，開展5L罐發(fā)酵試驗(yàn)研究，優(yōu)化發(fā)酵控制條件，5L發(fā)酵罐平均產(chǎn)酸達(dá)1.91g/100mL，最高達(dá)2.01g/100mL。對500L罐發(fā)酵生產(chǎn)己酸進(jìn)行相應(yīng)的發(fā)酵研究和提取研究。針對己酸這一產(chǎn)品的物理和化學(xué)特性，在對發(fā)酵液中產(chǎn)品提取方面，摸索出了一條工藝合理的己酸提制工藝路線。1.材料與方法：1.1菌種以js-03為出發(fā)菌種。1.1.1儀器與設(shè)備DSP-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SXK-103單人凈化工作臺：新蚌凈化設(shè)備有限公司；SL-N電子天平：上海民橋精密分析儀器廠；FA/TA電子天平：上海民橋精密分析儀器廠；UB100I顯微鏡：重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；HG72-1恒溫干燥箱：上海市躍進(jìn)醫(yī)療器件廠；HHB11厭氧培養(yǎng)箱：上海市躍進(jìn)醫(yī)療器件廠；冰箱：容聲；SC3610離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司；不銹鋼電熱蒸餾水器：北京市中興偉業(yè)儀器有限公司；50L全自動(dòng)發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司；液相色譜；PHS-25酸度計(jì)：上海偉業(yè)儀器有限公司；上海三申醫(yī)療器有限公司；常規(guī)玻璃儀器。1.2材料乙酸鈉、乙醇、硫酸銨、酵母膏、硫酸鎂、硫酸鈣、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、瓊脂等。均為分析純，購自西隴化工股份有限公司。1.3培養(yǎng)基1.3.1斜面培養(yǎng)基配方(g/L)：乙酸鈉5，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O0.2，(NH4)2SO40.5，酵母膏2，瓊脂20，調(diào)節(jié)PH6.9-7.1。1.3.2種子培養(yǎng)基配方(g/L)：乙酸鈉5，酵母膏2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO48，pH7.0，121℃滅菌20min。碳酸鈣15(單獨(dú)干熱滅菌，接種前加入)。1.3.3三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：乙酸鈉5，酵母膏2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O0.2，MgSO4·7H2O8，pH6.9，121℃滅菌20min。碳酸鈣15(單獨(dú)干熱滅菌，接種前加入)，接種前加入2.5％乙醇。1.3.4發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：乙酸鈉5，酵母膏2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O0.2，MgSO4·7H2O8，pH6.9，121℃滅菌20min。碳酸鈣15(單獨(dú)干熱滅菌，接種前加入)，接種前加入2.5％乙醇。1.4、己酸菌種子培養(yǎng)方式復(fù)壯培養(yǎng)：保藏的己酸菌菌種活化，即熱處理，將保藏菌種接入無菌水，85-90℃水浴中處理10min后，接入試管培養(yǎng)液中，在33-35℃培養(yǎng)6d，菌種在繁殖旺盛期，擴(kuò)大培養(yǎng)到100ml三角瓶，搖勻后置于35℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)7天。擴(kuò)大培養(yǎng)：取己酸菌種子100ml直接加入到三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基900mL中，包扎搖勻后置于35℃恒溫箱中靜止培養(yǎng)10天。1.5、菌種的誘變菌種的誘變:從分離純化所得的菌株中，選擇產(chǎn)酸量較高者作為出發(fā)菌，在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌，用緩沖液制成細(xì)胞懸液，稀釋至細(xì)胞數(shù)為2×107個(gè)，取孢子懸液5mL，置于直徑為90mm的平板中，垂直置于15W紫外燈下，照射距離30cm左右，照射時(shí)間為1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培養(yǎng)皿中，倒入融化的固體培養(yǎng)基，待凝固后抽真空至0.08MPa，于33℃培養(yǎng)3d。篩選:從經(jīng)誘變處理的平板中，隨機(jī)挑取生長良好的單菌落多份，分別接種到試管斜面上，33℃培養(yǎng)7-10d，用血球計(jì)數(shù)板測定己酸菌細(xì)胞數(shù)，從中挑選細(xì)胞數(shù)超過1億個(gè)/mL的菌株為復(fù)篩菌株。檢測復(fù)篩所得菌株發(fā)酵液的己酸含量，選擇出產(chǎn)酸能力，明顯高于出發(fā)菌的菌株，再經(jīng)分離培養(yǎng)，繼續(xù)馴化，直至選出性能優(yōu)良、遺傳性狀穩(wěn)定的理想菌株。1.5、分析方法1.5.1己酸定性分析—硫酸銅顯色法取己酸菌種液2mL，加2％硫酸銅溶液2mL、乙醚1mL，振蕩搖勻后靜置，使之反應(yīng)分層。觀察乙醚層顏色，呈現(xiàn)的藍(lán)色，顏色越深，己酸含量越高。1.5.2己酸定量分析—比色法1mol/L三乙醇胺：取15g含75％的三乙醇胺用蒸餾水定容至100mL。銅試劑：取1M三乙醇胺9份，1mol/L醋酸溶液1份，6.45％硝酸銅溶液10份，在臨測定前一并混合。顯色劑：取二乙基二硫代氨基甲酸鈉(簡稱DDC)0.1g，溶于重蒸的正丁醇100mL中。操作先將己酸發(fā)酵液用1mol/L硫酸調(diào)pH至2～3，取稀釋10倍后的該酸化液2～3mL置于分液漏斗，再加入銅試劑3mL，然后加氯仿5mL，抽提2min，靜止分層。接著用水洗氯仿層，待分層后傾去水，用4000r/min離心機(jī)離心5min。取離心后的氯仿層4mL，加DDC溶液0.4mL，混勻后于450mu波長下比色，由工作曲線計(jì)算己酸含量。工作曲線繪制法：取0.1000g己酸，用氯仿溶解定容至100mL。吸取該標(biāo)準(zhǔn)己酸氯仿液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，分別同上述操作加銅試劑及氯仿(所取氯仿量應(yīng)減去標(biāo)準(zhǔn)己酸氯仿液中的氯仿量)，抽提、水洗、加DDC溶液混勻后比色，將所得數(shù)據(jù)繪制成工作曲線。1.5.3總酸測定發(fā)酵結(jié)束或發(fā)酵期間，取發(fā)酵液過濾，取濾清液2ml，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定，計(jì)算出總酸的生成量。1.5.4pH值測定將發(fā)酵液4000r/min離心8min取上清液采用PHS-25型pH計(jì)測定。2、菌種選育2.1、分離純化培養(yǎng)菌種選育的目的在于原料品種的改變，篩選出以適應(yīng)菌種的生長繁殖，縮短發(fā)酵周期，以適應(yīng)規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)要求的菌種?；诖四康模詊s-03為出發(fā)菌株，先后進(jìn)行了紫外線照射和CO60照射及亞硝基胍處理，初篩到六株游動(dòng)活潑、帶有鼓棰狀芽孢的菌株，分別編號為js-22-03、js-22-07、js-22-12、js-22-17、js-22-23、js-22-28。進(jìn)一步用比色法和繪制的己酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(回歸方程:y＝0.3366x+0.656R2＝0.9933)，來測定各菌株發(fā)酵液己酸的含量，從而確定其產(chǎn)酸能力，研究發(fā)現(xiàn)(表1)js-22-07的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)(1.79g/100mL)，其發(fā)酵周期縮短到10天以內(nèi)，將其作為親株進(jìn)行紫外照射處理。表1分離純化所得己酸菌株的產(chǎn)酸量2.2、紫外線處理紫外線處理時(shí)間對致死率和正突變率的影響紫外誘變后，將被處理液稀釋圖平板，計(jì)算菌落數(shù)。以親株為對照，計(jì)算致死率。殺菌率在70％-80％或更低，誘變效果更好。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)(表2)紫外處理時(shí)間為3min時(shí)，致死率為68.3％，比較接近這個(gè)范圍，因此將該處理組作為下一步的篩選對象。從紫外線處理3min的這一組的平板上隨機(jī)挑選生長較大的菌落做進(jìn)一步的初篩，以親株為對照，根據(jù)己酸產(chǎn)量，確定正負(fù)突變株，結(jié)果初步篩選到5株正突變株，正突變率為8.33％。表2誘變時(shí)間與致死率項(xiàng)目菌落數(shù)/cfu/L致死率/％對照120-紫外處理1min10012.0紫外處理2min7835.0紫外處理3min3868.3紫外處理4min1091.72.3突變株性能的研究2.3.1、產(chǎn)酸能力將突變株在液體乙酸鈉培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d后，檢測發(fā)酵液己酸含量。研究發(fā)現(xiàn)(表3)突變株jsuv-2和jsuv-4的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，分別為1.98g/100mL和2.01g/100mL，較之親株js-22-07分別增加了37％和34％，說明誘變效果明顯。接下來，將對jsuv-2和jsuv-4的遺傳穩(wěn)定性展開研究。表3突變株發(fā)酵液的己酸含量菌株編號己酸產(chǎn)量g/100mL產(chǎn)量增加率％js-22-071.79-jsuv-11.906.14jsuv-21.9810.61jsuv-31.853.35jsuv-42.0112.29jsuv-51.895.592.3.2、遺傳穩(wěn)定性的研究變異株經(jīng)過多次傳代后，容易發(fā)生回復(fù)突變，導(dǎo)致性能降低。為此，本發(fā)明分別將jsuv-2和jsuv-4經(jīng)過斜面培養(yǎng)傳代8次，并取第6代和第8代的菌株做己酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測發(fā)酵液己酸含量。研究發(fā)現(xiàn)(表4):較之突變1代，jsuv-4第6代和第8代的己酸產(chǎn)量都僅有1.49％和0.49％的變化，說明jsuv-4的遺傳性能穩(wěn)定。而jsuv-2第6代和第8代的己酸產(chǎn)量分別比第1代降低了7.58％和11.61％，說明jsuv-2經(jīng)過多次傳代后，發(fā)生了回復(fù)突變。表4突變株己酸產(chǎn)量隨傳代的變化菌株編號己酸產(chǎn)量g/100mL產(chǎn)量變化率％jsuv-2第1代1.98-jsuv-2第6代1.83-7.58jsuv-2第8代1.75-11.61jsuv-4第1代2.01-jsuv-4第6代2.041.49jsuv-4第8代2.020.492.3.3、己酸菌的產(chǎn)酸規(guī)律菌株于發(fā)酵培養(yǎng)液中，33℃培養(yǎng)10天，每天取樣檢測發(fā)酵液己酸含量，據(jù)檢測結(jié)果繪制己酸含量變化的規(guī)律曲線(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)己酸菌突變前后，其產(chǎn)酸規(guī)律基本一致，第1-3天時(shí)，菌株繁殖生長，己酸含量增長較慢，第4-8天時(shí)，己酸含量增長較快，然后進(jìn)入緩慢增長階段，到第9天時(shí)，己酸含量最高之后略有下降。突變株jsuv-4第1代和第8代的產(chǎn)酸規(guī)律也基本一致，進(jìn)一步說明突變株的遺傳性穩(wěn)定。3、發(fā)酵條件的優(yōu)化研究3.1、方法3.1、實(shí)驗(yàn)方法3.1.1、培養(yǎng)條件影響因素分別從培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、溫度、接種量及裝液量等培養(yǎng)條件考察各因素對該菌系生長的影響；己酸水平為考察依據(jù)。3.1.2、培養(yǎng)基影響因素分別從碳源、氮源、乙醇添加量、NaAc添加量及CaCO3添加量考察各因素對該菌系生長的影響，以產(chǎn)己酸水平為考察依據(jù)。3.1.3、正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)條件通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，選取影響該菌系生長的關(guān)鍵因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過正交實(shí)驗(yàn)獲得其最佳培養(yǎng)條件，并以最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)研究。3.2、結(jié)果與分析以js-22-07為發(fā)酵菌株進(jìn)行三角瓶發(fā)酵條件的研究，以期優(yōu)化出菌株產(chǎn)酸的最佳發(fā)酵條件。由于梭狀芽孢桿菌屬厭氧發(fā)酵，除通風(fēng)試驗(yàn)研究外，三角瓶均按100％裝料。3.2.1、正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取影響該己酸菌系生長的關(guān)鍵因素：乙酸鈉、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸銨等進(jìn)行正交試驗(yàn)，以產(chǎn)酸為指標(biāo)。表5優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基因素水平表表6正交試驗(yàn)結(jié)果分析表編號ABCD己酸產(chǎn)量(g/L)1111117.12122216.5313338.54212320.15223112.76231218.17313217.0832138.09332110.5表7正交試驗(yàn)結(jié)果分析誤差源ABCD均值114.03318.06714.40013.433均值216.96712.40015.70017.200均值311.83312.36712.73312.200極差5.1335.7002.9675.000由表6、表7結(jié)果可以看出，該己酸菌的培養(yǎng)過程中，乙酸鈉、酵母膏、磷酸氫二鉀、硫酸銨的含量對產(chǎn)酸具有一定的影響。由表5結(jié)果分析可看出，影響主次為酵母膏＞乙酸鈉＞硫酸銨＞磷酸二氫鉀。主要影響因素取最好水平，次要影響因素選取適當(dāng)?shù)乃剑梢源_定其最優(yōu)培養(yǎng)水平組合為A2B1C2D2，即乙酸鈉5g/L、酵母膏2g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸銨0.5g/L。3.2.2、培養(yǎng)基碳源對己酸菌株發(fā)酵的影響在確定了發(fā)酵最優(yōu)配方后，在培養(yǎng)基其它條件不變的情況下，本發(fā)明對淀粉水解糖、葡萄糖、蔗糖、乙酸、乳酸、木糖等碳源對菌株產(chǎn)己酸的影響進(jìn)行了研究，以考察碳源2.8％含量替代EAM培養(yǎng)基中乙醇，其它成分不變，用相同條件培養(yǎng)10d，對發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析，測定結(jié)果見表八。從表八可以看出，己酸菌對碳源的要求具有專一性，且只有當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有乙醇和乙酸鈉時(shí)，及產(chǎn)酸水平最高。表8碳源種類對己酸產(chǎn)量的影響3.2.3氮源對己酸菌發(fā)酵的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，按0.05％(NH4)2SO4的含氮量折算，NH4Cl0.04％、脲0.028％及NaNO30.77％替代(NH4)2SO4，其它組分不變，發(fā)酵10天后，對發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析，結(jié)果見表9。表9氮源對己酸菌系生長影響氮源NH4ClNaNO3脲(NH4)2SO4己酸產(chǎn)量(g/L)14.52.68.916.9不同無機(jī)氮源對其生長及產(chǎn)酸能力均有不同程度的影響，最適無機(jī)氮源為(NH4)2SO4；NaNO3對其產(chǎn)酸能力有抑制作用。3.2.4、PH對菌株己酸發(fā)酵的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基其它條件不變的情況下，將培養(yǎng)基調(diào)成不同的PH，觀察PH對產(chǎn)酸影響，用0.1％NaOH調(diào)節(jié)初始pH，為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0及7.5，接種量13％，發(fā)酵9天后，對發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析。表10初始PH對己酸發(fā)酵的影響初始pH4.05.06.06.57.07.5己酸量(g/100mL)1.211.451.701.921.981.76研究結(jié)果表明，己酸的生產(chǎn)對PH敏感，己酸菌最適PH在6.5～7.0之間，見表10。3.2.5、溫度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基其它條件不變的情況下，研究發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸影響，溫度控制為25℃、27℃、30℃、33℃、35℃、40℃、45℃，接種量13％，發(fā)酵9天后，對發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析。表11發(fā)酵溫度對己酸發(fā)酵的影響溫度(℃)25273033354045己酸量(g/100mL)1.411.531.751.831.941.751.32己酸菌的營養(yǎng)細(xì)胞最適宜的發(fā)酵溫度為34～36℃，在這一溫度范圍下，己酸菌的繁殖速度最快，產(chǎn)生己酸最多，發(fā)酵溫度大于36℃死亡速度最快。在不同溫度下用同樣培養(yǎng)基對己酸菌進(jìn)行分別培養(yǎng)9天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸的影響結(jié)果表明，菌株發(fā)酵的最適溫度為35℃。3.2.6、接種量對己酸生長的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液接入量分別為5％、7％、9％、11％、12％、13％和15％，其他組分不變，培養(yǎng)9d后，對發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析。表12接種量對己酸發(fā)酵的影響接種量(％)57911121315己酸量(g/100mL)1.721.761.801.831.941.951.89從表12可見，不同的接種量對己酸菌系發(fā)酵產(chǎn)酸的影響不明顯，接種量為13％范圍內(nèi)，培養(yǎng)9天后，己酸產(chǎn)率較好。3.2.7、發(fā)酵時(shí)間對己酸菌株產(chǎn)酸的影響在其它條件不變的情況下，培養(yǎng)不同時(shí)間，取出測定己酸產(chǎn)量。表13發(fā)酵時(shí)間對己酸發(fā)酵的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，菌株發(fā)酵第2天開始產(chǎn)酸，產(chǎn)量很慢，第6～8天后產(chǎn)酸速度達(dá)到高峰，第10天開始下降，第11天以后基本不產(chǎn)酸，因此，發(fā)酵周期在9左右天比較合適。3.2.8、裝液量系數(shù)(空氣系數(shù))對己酸菌株產(chǎn)酸生長的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量分別40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和100％，按13％的接種量，培養(yǎng)10天后，對發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析，結(jié)果見表14。表14裝液量對己酸發(fā)酵的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)從表十四結(jié)果可看出，裝液量系數(shù)(空氣系數(shù))對己酸菌系生長的影響并不明顯，滿裝液量的培養(yǎng)效果最好。3.2.9、CaCO3含量對己酸菌株產(chǎn)酸生長的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，其中CaCO3添加量分別為0、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％，其他組分不變，接種量12％，發(fā)酵10天后，發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析測定，結(jié)果見表15。表15CaCO3含量對己酸發(fā)酵的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)培養(yǎng)基中CaCO3含量對己酸菌生長具有一定的作用，含量達(dá)1.5％CaCO3己酸產(chǎn)量最高。3.2.10、乙醇濃度對己酸菌株產(chǎn)酸的影響采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，其中乙醇添加量分別為0、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％，其他組分不變，接種量13％，試驗(yàn)結(jié)果如表16。表16乙醇濃度對己酸發(fā)酵的影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)乙醇濃度對己酸菌的代謝有很大的影響，乙醇是其生長必需物，該己酸菌有較好的耐乙醇性，乙醇含量在2.0％～3.0％范圍內(nèi)，產(chǎn)酸水平較高。從表16中可看出，己酸菌適宜生長的環(huán)境乙醇濃度為2.0％～2.5％，其中乙醇濃度在2.5％時(shí)己酸產(chǎn)率最好。試驗(yàn)結(jié)果表明，選育菌株傳代穩(wěn)定性較好，選育出的菌株比原菌株產(chǎn)率由1.20g/100mL提高1.90g/100mL。綜合單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果，確定菌株js-22-07最優(yōu)培養(yǎng)基(g/L)組成：乙酸鈉5，酵母膏2，磷酸氫二鉀0.4，硫酸銨0.5，碳酸鈣15，MgSO4·7H2O0.2，乙醇2.5％。最優(yōu)發(fā)酵條件：接種量13％，培養(yǎng)溫度35±0.5℃，初始pH7.0，滿裝液量深層培養(yǎng)，培養(yǎng)周期9-10d，可獲得最大產(chǎn)酸量為20.3g/L。通過菌種選育和發(fā)酵條件實(shí)驗(yàn)研究，最后進(jìn)行了5L罐發(fā)酵工藝研究，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件和技術(shù)參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。第二部分5L罐發(fā)酵試驗(yàn)研究在選育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)梭狀芽孢桿菌js-22-07菌株及相關(guān)的培養(yǎng)試驗(yàn)后，在取得充分?jǐn)?shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)行了5L罐發(fā)酵試驗(yàn)，確定了最佳發(fā)酵配方及工藝控制條件，其發(fā)酵產(chǎn)酸平均達(dá)到1.91％。試制產(chǎn)品純度達(dá)98％以上，完全達(dá)到了合同要求的技術(shù)指標(biāo)。材料與方法：一、菌種：梭狀芽孢桿菌js-22-07。二、原輔材料乙醇、乙酸鈉、硫酸銨、酵母膏、硫酸鎂、硫酸鈣、磷酸二氫鉀儀器設(shè)備5L發(fā)酵罐、分析儀器等。三、配方乙酸鈉5，酵母膏2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO48，pH6.9。碳酸鈣15(單獨(dú)干熱滅菌，接種前加入)，接種前加入2.5％乙醇。上述培養(yǎng)基滅菌條件：1kgf/cm2，蒸汽滅菌30分鐘。四、發(fā)酵工藝控制條件1、投料體積：90％以上；2、起始PH：7.0；3、接種量：13％；4、發(fā)酵溫度：35±0.5℃；5、攪拌速度：間歇攪拌；6、發(fā)酵PH控制：6.8～7.1；7、發(fā)酵時(shí)間：10天。五、分析方法1、總酸：用0.1N標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定；2、PH值：用酸度計(jì)測定；3、己酸含量：分光光度計(jì)下比色。六、試驗(yàn)結(jié)果與討論5L罐發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果：5L罐本發(fā)明進(jìn)行了多批次發(fā)酵試驗(yàn)，其結(jié)果如表所示：表15L罐發(fā)酵試驗(yàn)試驗(yàn)編號PH值己酸含量(g/100ml)發(fā)酵周期(天)057.01.789077.01.869.5106.91.809.5136.91.879.5146.91.8910157.01.849.5平均值1.84從表中可以看出梭狀芽孢桿菌js-22-07菌株當(dāng)己酸產(chǎn)量可達(dá)1.80％以上，平均為1.91％，說明該菌株的培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝合理，菌株活性穩(wěn)定，產(chǎn)酸水平較高。在5L罐發(fā)酵試驗(yàn)過程中，定期觀察了梭狀芽孢桿菌js-22-07菌株代謝變化情況，定期取樣測定其PH值、己酸濃度等，結(jié)果如下：表1第13批次發(fā)酵罐發(fā)酵表2第14批次發(fā)酵罐發(fā)酵表3第15批次發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)論：5L罐發(fā)酵的各項(xiàng)指標(biāo)為：1、通過發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)，選育出了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的己酸菌株js-22-07，發(fā)酵平均產(chǎn)酸1.91/100mL，發(fā)酵周期在9.5天左右，提取的己酸產(chǎn)品純度達(dá)98％以上。2、通過發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)，確定了發(fā)酵工藝條件及最佳工藝參數(shù)。3、菌株產(chǎn)酸水平在5L規(guī)模一直穩(wěn)定在1.85g/100mL以上，為下一步500L發(fā)酵罐的試驗(yàn)研究打下了良好的基第三部分500L罐發(fā)酵試驗(yàn)研究在選育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)己酸js-22-07菌株及相關(guān)的培養(yǎng)試驗(yàn)后，進(jìn)行了5L罐發(fā)酵研究，在取得充分?jǐn)?shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了500L罐發(fā)酵條件試驗(yàn)研究，確定了較佳發(fā)酵配方及工藝控制條件。其發(fā)酵產(chǎn)酸平均達(dá)到1.87g/100ml，試制產(chǎn)品純度達(dá)98％以上，完全達(dá)到了合同要求的技術(shù)指標(biāo)。材料與方法：一、菌種：梭狀芽孢桿菌js-22-07。二、原輔材料乙醇、乙酸鈉、硫酸銨、酵母膏、硫酸鎂、硫酸鈣、磷酸二氫鉀。三、儀器設(shè)備500L發(fā)酵罐、、分析儀器等。四、配方乙酸鈉5，酵母膏2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO48，pH6.9。碳酸鈣15(單獨(dú)干熱滅菌，接種前加入)，接種前加入2.5％乙醇。上述培養(yǎng)基滅菌條件：1kgf/cm2，蒸汽滅菌30分鐘。五、發(fā)酵工藝控制條件1、投料體積：90％以上2、起始PH：7.03、接種量：13％4、發(fā)酵溫度：35±0.5℃5、攪拌速度：間歇攪拌6、發(fā)酵pH控制：6.8～7.17、發(fā)酵時(shí)間：10天。六、分析方法4、總酸：用0.1N標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定5、PH值：用酸度計(jì)測定6、己酸含量：分光光度計(jì)下比色七、試驗(yàn)結(jié)果與討論500L罐發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果500L罐本發(fā)明進(jìn)行了多批次發(fā)酵試驗(yàn)，其結(jié)果如表所示：通過多批次發(fā)酵研究，連續(xù)三批次己酸發(fā)酵達(dá)到項(xiàng)目研究目標(biāo)，梭狀芽孢桿菌js-03-07菌株在500L發(fā)酵罐己酸產(chǎn)酸可達(dá)1.80g/100ml以上，平均為1.87g/100ml，發(fā)酵時(shí)間在10天(235小時(shí))以內(nèi)，說明該菌株的培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝合理，菌株活性穩(wěn)定，產(chǎn)酸水平較高。發(fā)酵情況在500L罐發(fā)酵試驗(yàn)過程中，觀察了梭狀芽孢桿菌js-22-07代謝變化情況，定期取樣測定其PH值、己酸濃度、總糖等，結(jié)果如下：其它因素對發(fā)酵情況的影響1、種子旺盛：種子嫩和老均直接影響發(fā)酵，最好的種子應(yīng)該是生命力旺盛，活動(dòng)性能強(qiáng)，外觀無怪味，混而不黑，鏡檢形狀粗壯，菌形整齊，具有一定數(shù)量為佳。2、接種量：一般說來接種量在11～13％，接種量大可以縮短發(fā)酵周期，產(chǎn)酸快而高。3、防止雜菌：培養(yǎng)基要徹底滅菌，種子罐和發(fā)酵罐必須嚴(yán)格滅菌，消除雜菌死角。4、溫度：影響正常大罐培養(yǎng)溫度為35℃左右，溫度過低，發(fā)酵緩慢，溫度過高，雜菌易感染，對己酸起到抑制作用，因而適宜的溫度是個(gè)關(guān)鍵，在操作中溫度不要波動(dòng)過大，最好采用自動(dòng)控制。5、厭氣條件：己酸發(fā)酵時(shí)，應(yīng)盡可能造成一種厭氣條件，密閉發(fā)酵，發(fā)酵液盡量滿罐，間歇攪拌，減少空氣流通。結(jié)論500L罐發(fā)酵的各項(xiàng)指標(biāo)為：在5L發(fā)酵罐取得充分?jǐn)?shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了500L罐發(fā)酵中試研究，確定了最佳發(fā)酵配方及工藝控制條件，間歇攪拌，控制發(fā)酵pH值為7.0，溫度為35℃，己酸產(chǎn)率在1.80g/100mL以上，平均產(chǎn)酸1.87g/100mL，發(fā)酵時(shí)間10天以內(nèi)，達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平，為己酸產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下了良好基礎(chǔ)。第四部分己酸提制工藝的研究己酸是發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，發(fā)酵液是復(fù)雜，其中除了所培養(yǎng)的微生物菌體及自溶成分外，還有未被微生物完全利用的糖類、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽以及微生物的各種代謝產(chǎn)物等。己酸發(fā)酵液中，含有較多的蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽等雜質(zhì)，結(jié)合本產(chǎn)品的實(shí)際要求，擬采用濃縮、精餾提制手段除去這些雜質(zhì)，由于發(fā)酵液中要提取的己酸起始濃度較低，而最后成品要求達(dá)到的純度又較高，因此常需多步操作，而操作步驟越多目的物損失也越大，由此可見，盡量減少提取步驟是相當(dāng)重要的。經(jīng)研究開發(fā)，獲得一條可行的提取工藝路線，產(chǎn)品總回收率達(dá)到80％以上。1、工藝根據(jù)己酸的性質(zhì)采用蒸餾技術(shù)分離純化己酸，提取工藝流程：發(fā)酵液→過濾→減壓濃縮→精餾→檢驗(yàn)→己酸產(chǎn)品。試驗(yàn)放大至中間試驗(yàn)規(guī)模，提取總收率≥80％，得到產(chǎn)品己酸含量達(dá)到98％以上無色或淡黃色油狀液體。2、主要設(shè)備恒溫水浴鍋、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、離心機(jī)、板框過濾機(jī)、真空濃縮系統(tǒng)、離心泵、不同大小精餾塔、冷凝器，真空泵等。3、提取試驗(yàn)研究3.1、5L發(fā)酵罐小試研究3.1.1、5L發(fā)酵罐發(fā)酵液過濾發(fā)酵液在罐中用冷水冷卻，然后以8000rpm離心機(jī)離心棄掉沉淀，清除菌體等水不溶雜質(zhì)，收集液體。表15L發(fā)酵罐過濾試驗(yàn)研究3.1.2、5L發(fā)酵罐濾清液濃縮5L發(fā)酵罐發(fā)酵液經(jīng)過濾后真空濃縮，將三批濾清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器燒瓶中，裝量30-35％，65℃水浴恒溫，濃縮真空度0.09Mpa。濃縮至己酸含量達(dá)到30-35％左右，時(shí)間6小時(shí)左右。表25L發(fā)酵罐濃縮試驗(yàn)研究3.1.2、5L發(fā)酵罐濃縮液精餾濃縮到總酸含量約30-35％，進(jìn)入精餾塔精餾分離己酸，精餾真空度0.09Mpa，初始頂溫控制85℃，調(diào)整控制回流，再提高到95℃，收集己酸，檢測己酸含量。表35L發(fā)酵罐精餾試驗(yàn)研究采用蒸餾技術(shù)分離純化己酸，提取工藝流程短，各工序損耗較小，對5L發(fā)酵罐的研究表明，各工序的收率在90％以上，總收率達(dá)到76.34％。提取參數(shù)控制：濃縮真空度0.09Mpa，精餾真空度0.09Mpa，頂溫溫度85℃、95℃。3.2、500L發(fā)酵罐擴(kuò)大試驗(yàn)研究3.2.1、500L發(fā)酵罐發(fā)酵液過濾發(fā)酵液放罐后，由于大量營養(yǎng)物質(zhì)的存在易于感染雜菌，這些都會引起產(chǎn)品的破壞，故發(fā)酵液不宜存放過久，應(yīng)盡快進(jìn)行提取。過濾前首先檢查過濾設(shè)備、濾布等是否正常，在正常的情況下才啟動(dòng)設(shè)備，緩緩進(jìn)料。待形成濾層后，保持正常壓力，進(jìn)行過濾。過濾的濾液必須清亮透徹，過濾結(jié)束時(shí)，濾餅必須洗至含酸＜0.1％，壓濾液非不溶性物質(zhì)小于0.1％。表4500L發(fā)酵罐過濾試驗(yàn)研究3.2.2.、濾清液的濃縮500L發(fā)酵罐發(fā)酵液(3批)經(jīng)過濾后真空濃縮，將濾清液置于真空濃縮罐中進(jìn)行濃縮，裝量30-35％，溫度控制在64-68℃，濃縮真空度0.09Mpa。濃縮至己酸含量達(dá)到33-38％左右，時(shí)間6-8小時(shí)左右。表5500L發(fā)酵罐濃縮試驗(yàn)研究3.2.3、精餾將濃縮液(分三批)進(jìn)入精餾塔精餾分離己酸，精餾真空度0.09Mpa，初始頂溫控制85℃，調(diào)整控制回流，再提高到95℃，收集己酸，檢測己酸含量。表6500L發(fā)酵罐精餾試驗(yàn)研究3.4、小結(jié)根據(jù)己酸的性質(zhì)采用蒸餾技術(shù)分離純化己酸，提取工藝流程：發(fā)酵液→過濾→減壓濃縮→精餾→檢驗(yàn)→己酸。提取參數(shù)控制：濃縮真空度0.09Mpa，精餾真空度0.09Mpa，頂溫溫度85℃、95℃，提制收得率≥80％，生產(chǎn)出己酸產(chǎn)品達(dá)到食品級標(biāo)準(zhǔn)，己酸含量≥98％。4、己酸產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)4.1、己酸產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品的主要理化指標(biāo)見下表。4.2、相對密度按照GB/11540香料相對密度測定方法。4.2、折光指數(shù)按照GB/T14454.1香料折光指數(shù)測定方法。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3