本發(fā)明屬于核苷化學及藥物化學領域，具體涉及2’-O-甲氧乙基核苷及其3’-H-二硫代磷酸酯和3’-H-單硫代磷酸酯衍生物，以及相應的制備方法。

背景技術：

RNAi技術作為后基因組時代的一種下調基因表達的工具被廣泛用作調節(jié)基因功能以及疾病治療的重要手段。小干擾RNA(siRNA)與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結合，導致mRNA失去功能是RNAi的關鍵步驟。但由于天然RNA在生物體內極易降解，因此改善天然RNA的穩(wěn)定性是現(xiàn)在siRNA全面走向應用所面臨的主要問題。

研究表明，siRNA中糖環(huán)的2’-羥基對基因沉默活性沒有顯著作用，因此對2’-羥基的封閉或替換作為一種重要的方法被廣泛用于siRNA的改性研究中，如通過2’-甲氧基或2’-氟取代2’-羥基可顯著改善siRNA的酶解穩(wěn)定性(ChemMedChem,2009,5,328；Mol.Ther.,2006,13,644)。另外用一個硫原子或一個硼基團取代部分磷酸酯上一個非橋氧原子得到單硫代磷酸酯(PS)或硼代磷酸酯也能增加磷酸橋鍵抵抗核酸酶的能力，不同程度地改善siRNA的穩(wěn)定性。但是單硫改性和硼改性后的磷原子都具有了手性，進而產生不易拆分的非對映異構體的混合物，使得siRNA的生物化學、生物物理和生物學性質多樣化而不穩(wěn)定。解決此問題的一種有效方法是合成非手性磷的改性RNA。如果用硫取代磷酸酯的全部兩個非橋氧原子可以得到核苷酸間二硫代磷酸酯(PS2)鍵合的RNA(PS2-RNA，如下所示)。

并且PS2-RNA和天然的磷酸二酯鍵合的RNA相同，PS2-RNA的磷原子也是非手性的。PS2-RNA是天然RNA的生物電子等排體，具有和正常RNA相似的其他生物化學和生物物理性能。另外，對PS2-siRNA的活性研究表明，PS2取代不僅提高穩(wěn)定性，還可提高siRNA的基因沉默活性，并具有較低的細胞毒性(ACS Chem.Biol.2012,7,1214)。因此通過改造磷酸酯骨架，合成二硫代磷酸酯核苷單體具有很大的應用價值。因此用PS2和2’-取代雙重改性的核苷酸單元取代siRNA中的部分核苷酸單元制備PS2-siRNA的研究越來越引起人們的重視。傳統(tǒng)合成PS2-RNA使用硫代磷酰亞胺法，而硫代磷酰亞胺單體(三價磷)極不穩(wěn)定，儲存穩(wěn)定性差，不利于大規(guī)模使用。因此，發(fā)現(xiàn)用于合成PS2-siRNA的高穩(wěn)定性的合成單體及合成方法是當務之急。

眾所周知，五價磷化合物比三價磷化合物的穩(wěn)定性高。因此本發(fā)明設計合成了可用于H-硫代磷酸酯法合成新型PS2-siRNA的兩類磷為五價的硫代磷酸酯核苷單體，即：2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸核苷和2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核苷。該發(fā)明對于開發(fā)有使用價值的RNAi藥物有非常重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供可用于改性PS2-RNA合成的2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸核苷單體和2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核苷單體；另一目的在于提供其制備方法。

為實現(xiàn)此目的，本發(fā)明選取三種核糖核苷為原料，通過化學修飾分別得到2’-甲氧乙基(MOE,methoxylethyl)保護的尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤核糖核苷；再通過適當?shù)倪x擇性保護，對3’-羥基分別進行H-二硫代磷酸化或H-單硫代磷酸化得到相應的2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷(通式一)或2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸核糖核苷(通式二)：

其中：B代表堿基，分別為尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤，N⁴-乙酰基胞嘧啶，N⁴-苯甲?；奏?，N⁶-苯甲?；汆堰?，N⁶-乙?；汆堰剩琋²-異丁?；B嘌呤，N²-乙?；B嘌呤，N²-苯甲?；B嘌呤；所述堿基B優(yōu)選尿嘧啶，4-乙酰基胞嘧啶，6-苯甲?；汆堰?，2-異丁酰基鳥嘌呤。

其中R代表氫，三苯甲基(Tr)，4-甲氧基三苯甲基(MMTr)，4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr，DMT)；所述R優(yōu)選4,4’-二甲氧基三苯甲基。

制備上述通式一所示化合物的方法是：

將1,2,4-三氮唑和有機堿溶于有機溶劑中，置于冰浴中氮氣保護下攪拌，加入PCl₃，攪拌，然后滴加通式三所示化合物溶液，滴加完畢移去冰浴常溫攪拌，然后向反應體系中通入H₂S氣體，反應結束后吹氮氣將多余的H₂S移除，濃縮反應液得黃色固體，再用二氯甲烷和飽和的碳酸氫三乙胺鹽萃取分層，合并油相，干燥過夜，柱分離得通式1所示化合物。

其中，所說的有機堿是二異丙基乙胺，三乙胺，二乙胺，嗎啉，N-甲基嗎啉，吡啶，4-二甲胺基吡啶中的一種或兩種。

其中，所說的有機溶劑是乙腈，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞楓(DMSO)，二氯甲烷，氯仿，四氫呋喃中的一種。

制備上述通式二所示化合物的方法是：

將通式三所示化合物與次磷酸三乙胺鹽混合用無水吡啶減壓帶水兩次，用無水吡啶溶解并氮氣保護下置于冰浴中攪拌，加入偶合試劑反應，然后移除冰浴，加入升華硫攪拌反應,TLC監(jiān)測反應完畢后加飽和的碳酸氫三乙胺鹽溶液淬滅反應。減壓蒸除溶劑得油狀物，然后用二氯甲烷與碳酸氫三乙胺鹽水溶液萃取分層，再用二氯甲烷萃取，合并有機層，干燥過夜，柱分離得通式二所示化合物。

其中，所說的偶合試劑是氯磷酸二苯酯、特戊酰氯、氯磷酸二(2,6-二甲基苯)酯、氯磷酸二乙酯中的一種。

制備上述通式三所示的嘧啶類核苷化合物的方法是：(1)首先用碳酸二苯酯和無機堿在極性有機溶劑中加熱處理尿苷得到2,2’-縮水-1-β-D-阿糖尿苷。所說的無機堿是碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀和碳酸氫鉀中的一種或兩種；所說的極性有機溶劑是N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜中的一種或兩種；所說的加熱指反應溫度在50-150℃。

(2)用有機溶劑稀釋2-甲氧乙氧基金屬鹽，加入2,2’-縮水-1-β-D-阿糖尿苷，加熱回流，柱分離得到2’-O-甲氧乙基尿苷(2’-O-MOE-尿苷)。所說的金屬鹽是鎂鹽或鋁鹽，由鎂粉或金屬鋁粉與無水2-甲氧基乙醇加熱回流制備；所用有機溶劑為2-甲氧基乙醇或乙二醇二甲醚或二者的混合溶液；回流時間為5-60小時。

(3)2’-O-甲氧乙基尿苷通過糖環(huán)羥基的臨時保護、嘧啶4位氧轉化為氨基得到2’-O-甲氧乙基胞苷；選擇性氨基?；玫?’-O-甲氧乙基-N⁴-酰基胞苷。

所說的羥基臨時保護指采用三甲基氯硅烷使羥基硅烷化，待轉化完成后加水去除三甲基硅基；嘧啶4位氧轉化為氨基通過1,2,4-三氮唑/三氯氧磷/氨水或三氟乙酸酐/4-硝基苯酚/氨水等方法實現(xiàn)；選擇性氨基?；瑯硬捎萌谆柰榕R時保護羥基，通過酰氯或酸酐?；被鶃韺崿F(xiàn)。

(4)2’-O-甲氧乙基尿苷或2’-O-甲氧乙基-N⁴-酰基胞苷與三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反應，選擇性保護5’-羥基得到通式三所示的選擇性保護的嘧啶核苷。

制備上述通式3所示的嘌呤類核苷化合物的方法是：

(1)將腺苷或2-氨基腺苷在堿的存在下與2-溴乙基甲基醚作用，柱層析分離得到2’-O-MOE-腺苷或2’-O-MOE-2-氨基腺苷。2’-O-MOE-腺苷選擇性氨基?；?’-O-MOE-N⁶-?；佘铡Ｆ渲?，所述的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、氫化鈉、氫化鉀、叔丁醇鉀和叔丁醇鈉的一種。

(2)2’-O-MOE-2-氨基腺苷經(jīng)選擇性酰基保護得2’-O-MOE-N²-?；?2-氨基腺苷，重氮化反應將6-氨基轉化為羥基得2’-O-MOE-N²-?；B苷。其中，氨基的選擇性?；玫孽；噭┦潜郊柞Ｂ?、苯甲酸酐、乙酰氯、乙酸酐、異丁酰氯或異丁酸酐中一種；酰化反應溫度為-30℃-50℃。6-氨基的重氮化轉化使用亞硝酸鈉/冰醋酸體系。

(3)2’-O-MOE-N⁶-酰基腺苷或2’-O-MOE-N²-?；B苷進一步與三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反應，選擇性保護5’-羥基得到通式三所示的選擇性保護的腺苷或鳥苷。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明為制備二硫代磷酸酯改性的核酸(PS2-RNA)提供了儲存穩(wěn)定性高的H-單硫代和H-二硫代磷酸核苷單體。

2、本發(fā)明根據(jù)siRNA的結構性能特點，針對性地將對siRNA的基因沉默活性無貢獻的核苷2’-羥基改性，在2’-羥基上引入MOE保護基，同時在3’-位引入H-硫代磷酸酯基，首次得到2’,3’-雙改性的儲存穩(wěn)定性高的H-單硫代和H-二硫代磷酸核苷單體。該類型單體用于合成改性RNA(PS2-RNA)可提高目標PS2-RNA的穩(wěn)定性進而改善siRNA的基因沉默活性。

3、本發(fā)明提供的制備雙改性H-單硫代和H-二硫代磷酸核苷的方法收率高、操作簡單，適合規(guī)模化生產。

4、該類化合物也可作為抗腫瘤、抗病毒藥物；或作為制備抗腫瘤、抗病毒藥物的先導物使用。

具體實施方式

為對本發(fā)明進行更好地說明，舉實施例如下：

實施例一：

2’-O-MOE-腺苷的合成

將腺苷(7.0g，1eq)溶于200mL無水DMF中，冰浴并氮氣保護下加入純度為60％的NaH(1.6g,1.5eq),充分攪拌30min后，逐滴滴加2-溴乙基甲基醚溶液(2.9mL,1.2eq)，30min后移出冰浴至室溫攪拌8h。反應結束后加入冰水5mL攪拌10min,濃縮反應液，硅膠柱層析分離得2’-O-MOE-腺苷1.7g,產率20.3％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.39(s,1H),8.15(s,1H),7.38(s,2H),6.00(d,J＝6.3Hz,1H),5.45(d,J＝2.3Hz,1H),5.16(d,J＝4.9Hz,1H),4.56(d,J＝1.1Hz,1H),4.33(d,J＝3.0Hz,1H),3.99(d,J＝3.1Hz,1H),3.76–3.63(m,2H),3.63–3.49(m,2H),3.38(t,J＝4.7Hz,2H),3.13(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆):δ156.6,152.9,149.5,140.3,119.8,86.8,86.6,81.6,71.6,69.5,69.4,62.0,58.4.

2’-O-MOE-N⁶-Bz-腺苷的合成

取化合物2’-O-MOE-腺苷(2.0g，1eq)，用無水吡啶7mL帶水兩次，加10mL無水吡啶使其溶解，氮氣保護下置于冰浴中攪拌20min，加三甲基氯硅烷(4.7mL，8eq)，再攪拌60min后加苯甲酰氯(1.1mL，1.5eq)，繼續(xù)攪拌120min，移出冰浴室溫攪拌30min,然后再移入冰浴10min后，加冰水3mL，攪拌30min后再加濃氨水5mL室溫攪拌30min。濃縮反應液用二氯甲烷和飽和食鹽水分層，二氯甲烷相用無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮、柱層析分離得產物2.3g,產率87.1％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.25(s,1H),8.77(d,J＝8.8Hz,2H),8.06(d,J＝7.3Hz,2H),7.71–7.51(m,3H),6.17(d,J＝5.8Hz,1H),5.24(d,J＝5.1Hz,1H),5.19(s,1H),4.62(t,J＝5.3Hz,1H),4.38(d,J＝3.8Hz,1H),4.02(d,J＝3.7Hz,1H),3.83–3.68(m,2H),3.62(dd,J＝10.6,5.2Hz,2H),3.42(t,J＝4.7Hz,2H),3.15(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆):δ167.9,151.9,150.4,143.0,132.4,131.2,128.5,128.2,127.4,125.8,86.1,85.8,81.3,71.1,68.9,61.1,58.0.

5’-O-DMT-2’-O-MOE-N⁶-Bz-腺苷(B為N⁶-苯甲?；汆堰?，R為DMT時通式三所示化合物)的合成

取化合物2’-O-MOE-N⁶-Bz-腺苷(1.5g，1eq)，用無水吡啶4mL帶水兩次，加適量的無水吡啶7mL使其溶解，氮氣保護常溫攪拌30min后加4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTr-Cl)(1.3g，1.1eq)，繼續(xù)攪拌4h后用無水甲醇淬滅反應，濃縮反應液，用二氯甲烷和5℃0.05M碳酸氫鈉溶液分層，二氯甲烷萃取2次，合并有機相用無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮，柱層析分離得產物2.2g,產率86.1％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.26(s,1H),8.75(s,1H),8.25(s,1H),8.06(d,J＝7.4Hz,2H),7.68–7.19(m,14H),6.83(d,J＝8.8Hz,4H),6.22(d,J＝5.1Hz,1H),4.77(t,J＝4.9Hz,1H),4.51(t,J＝4.4Hz,1H),4.32(d,J＝3.7Hz,1H),4.01–3.90(m,1H),3.80(s,7H),3.66–3.57(m,2H),3.52(d,J＝2.7Hz,2H),3.38(s,3H).

5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯-N⁶-Bz-腺苷(B為N⁶-苯甲?；汆堰?，R為DMT時通式一所示化合物)的合成

將1,2,4-三氮唑(1.74g，8eq)和N-甲基嗎啉用無水二氯甲烷8mL溶解，然后置于冰浴中氮氣保護攪拌10min，加入PCl₃(0.55mL，2eq)攪拌30min，滴加含2.3g 5’-O-DMT-2’-O-MOE-N⁶-Bz-腺苷(1eq)的無水二氯甲烷溶液7mL，滴加完畢置于常溫攪拌40min，然后通H₂S氣體10min，用氮氣將多余的H₂S移除，濃縮反應液得黃色固體，再用二氯甲烷和飽和的碳酸氫三乙胺鹽溶液萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥過夜，柱分離的目標物1.7g,產率65.0％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.27(s,1H),9.29(s,1H),8.60(d,J＝15.3Hz,2H),8.06(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(m,12H),6.84(dd,J＝8.9,3.2Hz,4H),6.16(d,J＝6.8Hz,1H),5.37–5.21(m,1H),5.09–4.95(m,1H),4.51(s,1H),3.88(T,J＝10.8,4.4Hz,1H),3.73(s,6H),3.67–3.55(m,2H),3.45–3.38(m,2H),3.27(dd,J＝10.2,3.5Hz,1H),3.15–3.04(m,9H),1.17(t,J＝7.3Hz,9H).³¹P NMR(162MHz,DMSO-d₆)δ85.22.HRMS:calcd.for C₃₈H₄₃N₅O₉PS₂^-:808.2245,found:m/z 808.2256[M-H]^-.

5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸酯-N⁶-Bz-腺苷(B為N⁶-苯甲?；汆堰剩琑為DMT時通式二所示化合物)的合成

將5’-O-DMT-2’-O-MOE-N⁶-Bz-腺苷(2.6g，1.5eq)與次磷酸三乙胺鹽(0.4g，1eq)混合用無水吡啶帶水兩次后，用無水吡啶溶解，并氮氣保護置于冰浴中攪拌，10min后加入特戊酰氯(0.35mL，1.2eq),約30min后移除冰浴加入升華硫(85mg，1.1eq)攪拌1h,TLC監(jiān)測反應完畢后加飽和的碳酸氫三乙胺鹽淬滅反應。減壓蒸出溶劑呈油狀，然后用二氯甲烷與碳酸氫三乙胺鹽水溶液萃取3次，收集有機層用無水硫酸鈉干燥過夜，柱分離(三乙胺：乙酯：甲醇＝0.5：89。5:10)得淡黃色固體1.8g,產率，88.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.24(s,1H),9.28(s,1H),8.61(dd,J＝18.5,4.2Hz,2H),8.05(d,J＝7.4Hz,2H),7.72–7.15(m,12H),6.83(dd,J＝8.1,4.2Hz,4H),6.16(d,J＝6.2Hz,1H),5.14(m,1H),4.98(d,J＝5.3Hz,1H),4.38(d,J＝12.5Hz,1H),3.78(s,1H),3.75-3.68(m,6H),3.61(s,2H),3.29–3.20(m,3H),3.08(m,9H),1.19(t,J＝7.2Hz,9H).³¹P NMR(162MHz,DMSO-d₆)δ49.99,49.37.HRMS:calcd.for C₃₈H₄₃N₅O₁₀PS^-:792.2474,found:m/z792.2473[M-H]^-.

實施例二：

2’-O-MOE-2-氨基-腺苷的合成

取2-氨基腺苷(7g，1.0eq)溶于無水DMF(200mL)中，冰浴并氮氣保護下攪拌30min，加60％的NaH(1.5g,1.5eq),攪拌30min后逐滴滴加2-溴乙基甲基醚(MOE-Br)(2.8mL，1.2eq)，繼續(xù)攪拌30min后移出冰浴，室溫攪拌8h。再加冰水5mL,攪拌10min,濃縮反應液，進行柱層析分離得目標物2.9g,產率34.4％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.96(s,1H),6.83(s,2H),5.48(dd,J＝6.5,4.9Hz,1H),5.09(d,J＝4.7Hz,1H),4.46(dd,J＝6.5,5.0Hz,1H),4.27(d,J＝2.4Hz,1H),3.94(d,J＝2.7Hz,1H),3.64(ddd,J＝12.0,9.6,5.1Hz,2H),3.54(dd,J＝10.1,5.4Hz,2H),3.44–3.38(m,2H),3.16(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆):δ160.6,156.7,151.9,136.5,113.9,86.5,85.5,81.3,71.5,69.6,69.3,62.1,58.5.

2’-O-MOE-N²-iBu-2-氨基腺苷的合成

取化合物2’-O-MOE-2-氨基腺苷(2g，1eq)，用無水吡啶5mL帶水兩次，然后加無水吡啶10mL使其溶解，氮氣保護并冰浴中攪拌20min，加三甲基氯硅烷(TMS-Cl)(3.7mL，5eq)，攪拌1h后將溫度調至-10℃，攪拌20min后加異丁酸酐(1mL，1.1eq)，繼續(xù)攪拌2h，然后移出冰浴至室溫在攪拌1h，然后再移入冰浴，加冰水3mL，攪拌30min后再加濃氨水5mL室溫攪拌30min。濃縮反應液用二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉分層，油相用無水硫酸鈉干燥6h，濃縮，柱層析分離得產物1.8g,產率74.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.86(s,1H),8.29(s,1H),7.25(s,2H),5.94(d,J＝6.1Hz,1H),5.12(d,J＝4.6Hz,1H),5.07(m,1H),4.54(t,J＝5.1Hz,1H),4.32(s,1H),3.94(s,1H),3.76–3.47(m,4H),3.41(m,2H),3.15(s,3H),2.85(m,1H),1.07(s,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ175.5,156.6,153.3,150.8,139.2,116.7,86.4,85.4,81.5,71.5,69.4,61.9,58.4,34.6,19.83,19.81.

2’-O-MOE-N²-iBu-鳥苷的合成

將2’-O-MOE-N²-iBu-2-氨基腺苷(0.9g，1eq)用8mL冰醋酸溶解，然后加2mL的水和NaNO₂(1.5g，10eq)，室溫攪拌24h，加10mL正丁醇稀釋反應液，減壓濃縮得到黃色固體，柱層析分離得目標物0.68g,產率75.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.09(s,1H),11.70(s,1H),8.28(s,1H),5.91(d,J＝5.9Hz,1H),5.11(d,J＝22.0Hz,2H),4.43(s,1H),4.30(s,1H),3.94(s,1H),3.70(d,J＝10.5Hz,1H),3.63–3.48(m,3H),3.40(s,2H),3.16(s,3H),2.87–2.68(m,1H),1.13(s,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ180.6,155.3,149.4,148.7,138.0,120.5,86.5,84.9,82.0,71.6,69.4,65.4,61.7,58.5,35.2,19.3,15.6.

5’-O-DMT-2’-O-MOE-N²-iBu-鳥苷的合成

取化合物2’-O-MOE-N²-iBu-鳥苷(2.5g，1.0eq)，用無水吡啶(每次10mL)帶水兩次，加15mL無水吡啶使其溶解，加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTr-Cl)(2.3g，1.1eq)，氮氣保護下常溫攪拌4h后用無水甲醇淬滅反應，濃縮反應液，用二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉分層，有機相用無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮，柱層析分離得產物3.6g,產率83％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.95(s,1H),7.82(s,1H),7.71(s,1H),7.54(d,J＝7.4Hz,2H),7.39(dd,J＝8.8,2.2Hz,3H),7.30–7.19(m,4H),6.80(t,J＝8.9Hz,4H),5.87(d,J＝7.2Hz,1H),4.99–4.84(m,1H),4.48(d,J＝3.3Hz,1H),4.21(s,1H),3.87(d,J＝11.5Hz,1H),3.77(d,J＝5.2Hz,6H),3.72–3.64(m,1H),3.56(dd,J＝16.6,8.4Hz,2H),3.46(d,J＝10.7Hz,1H),3.36(s,3H),3.13(dd,J＝10.7,3.1Hz,1H),1.64(dt,J＝13.7,6.8Hz,1H),0.92(d,J＝6.8Hz,3H),0.73(d,J＝6.9Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ178.2,158.8,155.4,148.2,147.1,145.0,139.0,136.1,135.7,130.0,128.1,128.0,127.1,122.5,113.3,86.4,86.3,84.5,81.4,71.8,70.0,69.4,63.8,59.0,55.3,36.1,18.54,18.46.

5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯-N²-iBu-鳥苷(B為N²-異丁?；B嘌呤，R為DMT時通式一所示化合物)的合成

將1,2,4-三氮唑(1.6g，8eq)和N-甲基嗎啉(3.1mL，10eq)用10mL無水二氯甲烷溶解，冰浴及氮氣保護下攪拌10min，加PCl₃(0.5mL，2eq)繼續(xù)攪拌30min，滴加含2.0g 5’-O-DMT-2’-O-MOE-N²-iBu-鳥苷的無水二氯甲烷溶液7mL，常溫攪拌40min，然后通H₂S氣體10min，用氮氣置換出多余的H₂S氣體，濃縮反應液得黃色固體，再用二氯甲烷和飽和的碳酸氫三乙胺鹽分層，再用二氯甲烷萃取一次，合并有機相無水硫酸鈉干燥過夜，柱層析分離得目標物1.3g,產率57.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.04(s,1H),11.85(s,1H),9.27(s,1H),8.05(s,1H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),7.25(dd,J＝8.8,2.1Hz,7H),6.95–6.75(m,4H),6.01(d,J＝7.8Hz,1H),5.22(dd,J＝14.3,4.0Hz,1H),4.74(dd,J＝7.7,4.6Hz,1H),4.40(s,1H),3.80(dd,J＝10.1,5.8Hz,1H),3.74(s,6H),3.61–3.53(m,1H),3.44–3.35(m,4H),3.14(s,3H),3.03(d,J＝6.8Hz,6H),2.81–2.65(m,1H),1.22–1.10(m,15H)；³¹P NMR(162MHz,DMSO-d₆)δ84.97.HRMS:calcd.for C₃₈H₄₃N₅O₉PS₂^-:808.2245,found:m/z 808.2247[M-H]^-.

5’-O-DMT-2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸酯-N²-iBu-鳥苷(B為N2-異丁?；B嘌呤，R為DMT時通式二所示化合物)的合成

將5’-O-DMT-2’-O-MOE-N²-iBu-鳥苷(2.0g，1.5eq)與次磷酸三乙胺鹽(0.31g，1eq)混合，用無水吡啶5mL帶水兩次后，用無水吡啶10mL溶解，并氮氣保護下冰浴中攪拌10min，加入特戊酰氯(0.3mL，1.2eq),約30min后移除冰浴，加入升華硫(66mg，1.1eq)攪拌1h,TLC監(jiān)測反應完畢后加飽和的碳酸氫三乙胺鹽淬滅反應。減壓濃縮得油狀物，然后用二氯甲烷與碳酸氫三乙胺鹽水溶液分層，并用二氯甲烷萃取水相二次，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥過夜，柱層析分離得淡黃色固體產物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.03(s,1H),11.81(s,1H),8.60(d,J＝15.9Hz,1H),8.08(s,1H),7.36(d,J＝7.4Hz,2H),7.24(m,7H),6.84(m,4H),6.03(dd,J＝7.2,3.2Hz,1H),5.07(dd,J＝46.0,9.8Hz,1H),4.72(s,1H),4.32(s,1H),3.78(dd,J＝10.0,5.7Hz,1H),3.74(s,6H),3.58(dd,J＝7.4,5.3Hz,1H),3.28(m,2H),3.14(s,3H),3.04(q,J＝7.2Hz,8H),2.80–2.66(m,1H),1.16(m,15H).³¹P NMR(162MHz,DMSO-d₆)δ49.70,49.56.HRMS:calcd.for C₃₈H₄₃N₅O₁₀PS^-:792.2474,found:m/z 792.2473[M-H]^-.

實施例三：

2,2’-縮水-1-β-D-阿糖尿苷的合成

首先將碳酸二苯酯(9.6g,1.1eq)溶于無水N,N-二甲基乙酰胺(8mL)，攪拌，加熱到60℃，基本溶解完全后，加入尿苷(10.014g,1eq)和碳酸氫鈉(0.172g,0.05eq)，繼續(xù)升溫到100℃，TLC監(jiān)測反應進程，約3-4h體系中有白色固體出現(xiàn)，呈渾濁狀態(tài)，5h反應完畢。體系冷卻至常溫，加乙醚攪拌2h，抽濾得白色固體。該產品無需進一步純化，直接用于下一步合成。

2’-O-MOE-尿苷的合成

鋁粉(3eq)與無水2-甲氧基乙醇(30eq)，先加熱回流3h，生成2-甲氧基乙醇鋁，然后加入2,2’-縮水-1-β-D-阿糖尿苷粗品(1eq)，加熱回流，點板監(jiān)測反應進程，約50h反應完畢。冷卻至室溫，向體系中加入適量乙醇和少量水，加熱回流30min，在布氏漏斗中墊硅藻土，趁熱抽濾，并用乙醇洗濾渣，濃縮濾液，得到褐色粘稠狀物質。柱層析分離，得到白色固體粉末狀產物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.36(s,1H),7.94(d,J＝8.1Hz),5.85(d,J＝5.1Hz,1H),5.66(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(q,J＝4.7Hz,1H),5.05(d,J＝5.6Hz,1H),4.10(dd,J＝9.9,4.9Hz,1H),3.95(t,J＝5.0Hz,1H),3.86(d,J＝3.8Hz,1H),3.74–3.60(m,3H),3.60-3.52(m,1H),3.45(t,J＝4.7Hz,2H),3.23(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ163.6,151.0,141.0,102.2,86.6,85.5,81.9,71.6,69.4,68.8,61.0,58.6.

5’-O-DMT-2’-O-MOE尿苷的合成

2’-O-MOE-尿苷(1eq)，用無水吡啶帶水兩次，然后用無水吡啶將將其溶解，氮氣保護下，加4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTr-Cl)(1.1eq)，室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應，約4小時反應完全后，減壓蒸除溶劑，二氯甲烷溶解，飽和碳酸氫鈉洗3次，然后用飽和食鹽水洗3次，無水硫酸鈉干燥過夜。過濾濃縮濾液，柱層析分離得目標物。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.98(d,J＝8.2Hz,1H),7.41–7.36(m,2H),7.33–7.21(m,7H),6.84(d,J＝8.9Hz,4H),5.96(d,J＝2.4Hz),5.29(d,J＝8.1Hz),4.45(s,1H),4.09(m,2H),4.01(dd,J＝5.0,2.4Hz,1H),3.80(d,J＝0.7Hz,7H),3.61(m,1H),3.57–3.54(m,1H),3.53(dt,J＝4.8,2.4Hz,2H),3.39(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ163.1,158.7,150.2,144.4,140.1,135.4,135.1,130.2,128.1,127.2,113.3,102.1,87.8,87.1,83.5,83.2,71.7,70.3,68.8,61.6,59.0,55.3.

2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯尿苷(B為尿嘧啶，R為DMT時通式一所示化合物)的合成

以5’-O-DMT-2’-O-MOE-尿苷為原料，制備方法同實施例一中通式一所示化合物的制備。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.50(s,1H),8.12(s,1H),7.95(d,J＝8.2Hz,1H),7.44(d,J＝7.4Hz,2H),7.35–7.26(m,6H),7.22(t,J＝7.2Hz,1H),6.84(dd,J＝9.0,2.4Hz,4H),6.04(d,J＝3.9Hz,1H),5.31(dt,J＝14.5,5.2Hz,1H),5.20(d,J＝8.1Hz,1H),4.47–4.40(m,1H),4.32(t,J＝4.4Hz,1H),3.93(dd,J＝8.1,4.3Hz,2H),3.79(d,J＝0.7Hz,6H),3.65–3.55(m,3H),3.45(dd,J＝10.9,2.0Hz,1H),3.35(s,3H,),3.23(q,J＝7.3Hz,6H),1.35(t,J＝7.3Hz,9H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ163.5,158.6,150.5,144.4,140.5,135.4,135.1,130.3,128.3,128.0,127.0,113.3,102.0,87.5,87.2,82.5,81.8,72.2,71.4,70.3,61.7,59.0,55.2,46.2,8.7.³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ85.91.HRMS:calcd.for C₃₃H₃₆N₂O₉PS₂^-:699.1605,found m/z:699.1639.

2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸酯尿苷(B為尿嘧啶，R為DMT時通式二所示化合物)的合成

以5’-O-DMT-2’-O-MOE-尿苷為原料，制備方法同實施例一中通式二所示化合物的制備。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.42(s,1H),8.57(s,1H),7.72(dd,J＝12.9,8.1Hz,1H),7.40(d,J＝7.4Hz,2H),7.28(m,7H),6.90(d,J＝8.7Hz,4H),5.83(t,J＝5.7Hz,1H),5.30–5.19(m,1H),5.09–4.90(m,1H),4.18(d,J＝13.9Hz,2H),3.74(s,6H),3.49–3.42(m,2H),3.34(d,J＝6.3Hz,4H),3.23(s,3H),3.05(q,J＝7.1Hz,6H),1.17(t,J＝7.3Hz,9H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ162.9,158.1,150.4,144.5,139.9,135.3,134.9,129.8,127.8,127.8,126.8,113.2,101.5,86.1,81.9,80.0,71.2,69.1,62.2,58.1,55.0,45.5,8.6.³¹P NMR(162MHz,DMSO-d₆)δ49.44,49.12.HRMS:calcd.for C₃₃H₃₆N₂O₁₀PS^-:683.1834,found m/z:683.1851[M-H]^-.

實施例四：

2’-O-MOE-胞苷的合成

將2’-O-MOE-尿苷(1eq)溶于無水乙腈中，室溫攪拌，加入(CH₃)₃SiCl(3eq)，冰浴條件下加N-甲基吡咯(9.6eq)，然后升至室溫反應1h，冰浴冷至0℃后逐滴加入(CF₃CO)₂O(2.5eq)；攪拌30min后向體系中加入4-硝基苯酚(3eq)，0℃繼續(xù)反應，點板監(jiān)測反應進程。約3h后，將體系傾入飽和NaHCO₃溶液中，用CH₂Cl₂萃取3次，合并有機相，旋轉蒸發(fā)溶劑，然后用二氧六環(huán)溶解，并加濃氨水，60℃加熱攪拌。約24h后，濃縮體系，并用無水乙醇帶體系中殘留的溶劑。柱層析純化得黃色固體產物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.91(d,J＝7.4Hz,1H),7.23(s,2H),5.83(d,J＝3.3Hz,1H),5.72(d,J＝7.4Hz,1H),5.14(t,J＝4.7Hz,1H),5.00(d,J＝5.9Hz,1H),4.04(dd,J＝10.7,5.3Hz,1H),3.81(dd,J＝10.1,5.4Hz,2H),3.71(m,3H),3.59-3.52(m,1H),3.48-3.44(m,2H),3.24(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ165.6,155.1,141.1,93.9,87.2,84.0,81.9,71.1,68.8,68.0,60.1,58.0.

2’-MOE-N4-Ac-胞苷的合成

將2’-O-MOE-胞苷用無水DMF溶解，氮氣保護常溫攪拌10min,然后加乙酸酐(1.2eq)攪拌10h，加甲苯稀釋反應液，減壓濃縮，然后用二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉分層，二氯甲烷再萃取二次，合并有機相用無水硫酸鈉干燥過夜，柱層析分離得目標物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.90(s,1H),8.47(d,J＝7.5Hz,1H),7.20(d,J＝7.5Hz,1H),5.82(d,J＝2.1Hz,1H),5.23(t,J＝4.9Hz,1H),5.03(d,J＝6.5Hz,1H),4.05(dd,J＝11.8,6.7Hz,1H),3.90(d,J＝7.2Hz,1H),3.88–3.82(m,2H),3.75(dd,J＝10.3,5.7Hz,2H),3.64–3.58(m,1H),3.49(t,J＝4.8Hz,2H),3.25(s,3H),2.10(s,3H,).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ171.5,162.9,155.0,145.6,95.7,88.8,84.6,82.8,71.6,69.6,67.9,59.9,58.6,24.8.

5’-O-DMT-2’-MOE-N4-Ac-胞苷的合成

先將2’-MOE-N4-Ac-胞苷用無水吡啶帶水兩次，然后用無水吡啶將其溶解，氮氣保護，加4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMTrCl)(1.1eq)，室溫攪拌，TLC監(jiān)測反應完全后，減壓濃縮，用二氯甲烷溶解，飽和碳酸氫鈉洗3次，然后用飽和食鹽水洗3次，有機層用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾濃縮，柱層析分離得目標物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.96(s,1H),8.33(d,J＝7.4Hz,1H),7.44–7.21(m,9H),7.02(d,J＝7.4Hz,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,4H),5.82(s,1H),5.16(d,J＝7.2Hz,1H),4.26(dd,J＝12.7,7.8Hz,1H),4.03(dd,J＝12.1,5.3Hz,1H),3.97–3.85(m,2H),3.82–3.69(m,7H),3.52(t,J＝4.5Hz,2H),3.32(s,2H),3.26(s,3H),2.10(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ171.0,162.4,158.1,154.3,144.4,135.4,135.1,129.7,127.9,127.7,126.8,124.5,113.2,95.3,88.8,85.9,82.1,81.7,71.1,69.3,67.6,61.5,58.1,55.0,24.3.

5’-O-DMT-2’-MOE-3’-H-二硫代磷酸酯-N⁴-Ac-胞苷(B為N⁴-乙?；奏?，R為DMT時通式一所示化合物)的合成

以5’-O-DMT-2’-MOE-N⁴-Ac-胞苷為原料，制備方法同實施例一中通式一所示化合物的制備。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.38(s,P-H),8.43(d,J＝7.5Hz,1H),8.00(s,1H),7.40(d,J＝7.8Hz,2H),7.33–7.14(m,7H),6.90(d,J＝7.4Hz,1H),6.84–6.73(m,4H),5.93(s,1H),5.13–5.02(m,1H),4.38(d,J＝8.3Hz,1H),4.19(d,J＝4.4Hz,1H),4.04–3.96(m,1H),3.94–3.86(m,1H),3.73(s,6H),3.56–3.46(m,4H),3.29(s,3H),3.13(q,J＝7.2Hz),2.20(s,3H),1.26(t,J＝7.3Hz).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.7,161.8,157.6,154.2,144.0,143.3,134.5,134.2,129.3,127.4,127.0,126.0,112.3,95.7,88.5,86.0,80.8,80.4,70.8 69.2,68.9,59.6,58.0,54.2,45.1,24.0,7.6.³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)85.50.HRMS:calcd.for C₃₅H₃₉N₃O₉PS₂^-:740.1871,found m/z:740.1899[M-H]^-.

5’-O-DMT-2’-MOE-3’-H-單硫代磷酸酯-N⁴-Ac-胞苷(B為N⁴-乙?；奏?，R為DMT時通式二所示化合物)的合成

以5’-O-DMT-2’-MOE-N⁴-Ac-胞苷為原料，制備方法同實施例一中通式二所示化合物的制備。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.97(d,J＝10.6Hz,1H),8.55(s,1H),8.44–8.27(m,1H),7.42(d,J＝7.4Hz,2H),7.38–7.20(m,7H),6.97(dd,J＝7.3,3.8Hz,1H),6.91(d,J＝8.2Hz,4H),5.82(d,J＝9.0Hz,1H),4.90(dd,J＝14.5,10.1Hz,1H),4.21(t,J＝10.4Hz,1H),4.12–3.99(m,1H),3.95–3.84(m,2H),3.75(s,6H),3.50(t,J＝4.8Hz,2H),3.35(m,2H,),3.25(d,J＝3.6Hz,3H),3.05(q,J＝7.2Hz),2.09(s,3H),1.16(t,J＝7.3Hz).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ170.9,162.5,158.1,154.2,144.2,135.3,135.0,129.8,127.9,126.8,113.3,95.3,88.8,86.1,81.1,71.1,69.3,60.8,58.1,55.0,45.5,24.3,8.5.³¹P NMR(162MHz,DMSO-d₆)δ49.46,48.75.HRMS:calcd.for C₃₅H₃₉N₃O₁₀PS^-:724.2099,found m/z:724.2090[M-H]^-.

實施例五：

H-硫代磷酸酯核苷穩(wěn)定性實驗

以2’-O-MOE-3’-H-單硫代磷酸酯尿苷為為模型化合物進行穩(wěn)定性實驗。將樣品溶解在無水乙腈中，核磁管中放置內封有DMSO-d₆的小管進行鎖場，常溫下放置，通過³¹P NMR信號的變化來監(jiān)測其化學穩(wěn)定性。H-單硫代磷酸酯³¹P位于δ53.3(d，J＝101Hz)，分別在設置0，1，2，4，12，24h，2，5，10，20，110d時間點進行監(jiān)測，結果在前20天時磷譜圖上仍沒有任何變化，110天時發(fā)現(xiàn)磷譜上在0ppm附近出現(xiàn)一組雜峰，為硫原子被氧取代所致，約占27％(實驗³¹P NMR譜略)。證明H-硫代磷酸酯核苷在乙腈中較穩(wěn)定。

對本發(fā)明其它化合物進行了同樣上述實驗，經(jīng)驗證，此類化合物儲存穩(wěn)定性好。