本發(fā)明涉及生物及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種分離與檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的薄膜基底微通孔列陣生物芯片及其制作方法。

背景技術(shù)：

隨著生活水平的不斷提高，人們對生命健康越來越重視，癌癥是影響人們生命健康的一個重大難題。發(fā)現(xiàn)癌癥時，常常為時已晚，如何盡早診斷出癌癥，并在早期及時治療，常能挽回人們的生命。由于超過90％的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移造成的，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移灶的直接來源，因此從血液中檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞越來越引起人們的重視。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在外周血中含量極少，每10ml血液可能僅含幾個到幾百個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，卻有多達(dá)約1億個白細(xì)胞和500億個紅細(xì)胞。因此從外周血中快速、有效的分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞是后續(xù)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析和診斷的前提。

市面上有用核孔膜作為過濾器分離血液細(xì)胞的。它是利用核能重離子對薄膜進(jìn)行照射，然后用化學(xué)試劑腐蝕，形成微孔。但核孔膜的微孔分布隨機，較多孔都有重疊，形狀單一，孔徑不均勻，并且整套過濾器具價格昂貴，達(dá)到幾千元。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種薄膜基底微通孔列陣生物芯片及其制作方法。

本發(fā)明所涉及的一種薄膜基底微通孔列陣生物芯片，為厚度均勻且透明的高分子聚合物薄膜，薄膜上分布著微通孔列陣，微通孔為全通結(jié)構(gòu)，薄膜的厚度為5μm～60μm，微通孔孔徑為4μm～50μm，微通孔孔徑與孔間的間隙比例為1:1～1:10。

進(jìn)一步，所述高分子聚合物為PI、PMMA或PU。

進(jìn)一步，所述微通孔為圓形、矩形或正多邊形。

進(jìn)一步，所述微通孔列陣的排布方式為矩形分布或正六邊形分布。

本發(fā)明所涉及的一種薄膜基底微通孔列陣生物芯片的制作方法，步驟如下：

(1)將高分子聚合物材料涂覆至硅片、石英片或其他硬質(zhì)材料基底上，通過紫外固化或熱固化形成一層致密的高分子薄膜；

(2)在高分子薄膜表面涂覆6μm～60μm厚的光刻膠、烘烤固化，然后在光刻膠上放上掩膜版，掩膜版的圖形為微孔狀圖形的列陣排布，微孔孔徑為4μm～50μm，微孔孔徑與孔間的間隙比例為1:1～1:10；曝光、顯影后制備出光刻圖形；

(3)對有光刻圖形的高分子聚合物薄膜進(jìn)行等離子體刻蝕，刻蝕氣體采用氧基氣體和氟基氣體，流量分別為30sccm和10sccm，刻蝕時間為0.5至6小時，制備出高分子聚合物薄膜微通孔列陣；

(4)清洗表面的殘膠，揭下高分子聚合物薄膜，制得高分子聚合物薄膜基底微通孔列陣生物芯片。

進(jìn)一步，所述高分子聚合物為PI、PMMA或PU。

由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞比血液細(xì)胞大且不易形變，可以設(shè)計微孔結(jié)構(gòu)，過濾血液細(xì)胞，捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明利用尺寸及排布方式適當(dāng)?shù)耐琢嘘?，實現(xiàn)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的分離。本發(fā)明采用透明薄膜通孔結(jié)構(gòu)，分離癌細(xì)胞，在藍(lán)光激光器激發(fā)下無熒光，避免背景光干擾，便于染色后采用倒置熒光顯微鏡激發(fā)觀察，與現(xiàn)有成熟病理分析手段兼容，有利于市場推廣應(yīng)用。后續(xù)可利用現(xiàn)有成熟的癌細(xì)胞染色顯微計數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)或基因測序的方法，進(jìn)一步甄別癌細(xì)胞種類。本發(fā)明采用高分子聚合物為薄膜基底，材料來源豐富，成本低，柔韌性好。本發(fā)明采用光刻制作方法，重復(fù)性好，可以靈活設(shè)計微通孔的形狀及分布，微通孔的密度更大，孔徑周期性及大小均勻性好，快速高通量過濾血液細(xì)胞，工藝成熟，可以實現(xiàn)批量化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為圓形微通孔列陣生物芯片示意圖；

圖2為方形微通孔列陣生物芯片示意圖；

圖3為正多邊形微通孔列陣生物芯片示意圖；

圖4為薄膜基底微通孔列陣生物芯片的制作方法流程圖；

圖5為圓形微通孔列陣生物芯片的掃描電鏡圖；

上述圖中，1為薄膜，2為微通孔列陣。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較佳實施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。在本發(fā)明中，掩膜版的圖形為圓形或多邊形微孔狀圖形的列陣排布，采用不同的掩膜版的圖形可制作出不同孔徑大小、不同排列方式孔、不同孔徑與孔間的間隙比例的微通孔列陣生物芯片。

實施例一：

本實施例所涉及的一種PI薄膜基底微通孔列陣生物芯片如圖1所示，結(jié)構(gòu)如下：

厚度為10μm，為均勻透明的PI薄膜1，薄膜1上分布著微通孔列陣2，微通孔為圓形且為全通結(jié)構(gòu)，孔徑為8μm，孔徑與孔間的間隙比例為1:1，微通孔列陣2的排布方式為矩形分布。其掃描電鏡圖如圖5所示。

本實施例所涉及的一種PI薄膜基底微通孔列陣生物芯片的制作方法流程圖如圖4所示，步驟如下：

(1)在500ml的燒杯中，加入二甲基乙酰胺239.1g，然后加入對苯二胺2.3g，4,4'-二氨基二苯醚24.3g，均苯四甲酸二酐21.8g，聯(lián)苯四甲酸二酐12.6g，反應(yīng)1小時，得到聚酰胺酸溶液。將聚酰胺酸溶液涂覆在硅片上，勻膠轉(zhuǎn)速為1000rpm，然后在烘箱中梯度升溫，從室溫升到100℃，保溫1小時，然后升溫到150℃，保溫1小時，升溫到200℃，保溫1小時，升溫到250，保溫1小時，熱固化，自然冷卻，制得10μm厚的PI薄膜。

(2)在PI薄膜上旋涂10μm厚的AZ9260光刻膠，在熱板上100℃烘烤5min，然后在光刻膠上放上掩膜版，掩膜版的圖形為圓形微孔圖形的列陣排布，微孔孔徑為8μm，孔徑與孔間的間隙比例為1:1，微孔列陣的排布方式為矩形分布，在10mW/cm²的光刻機下曝光10s，在AZ400K顯影液中顯影50s，制備出光刻圖形。

(3)把有光刻圖形的PI薄膜放入等離子刻蝕機中，通入O₂和SF₆氣體。O₂的流量為30sccm，SF₆的流量為10sccm，在100W功率下刻蝕1小時，制備出PI薄膜微通孔陣列。

(4)清洗表面的殘膠，在硅片上揭下PI薄膜，制得PI薄膜基底微通孔列陣生物芯片。

實施例二：

本實施例所涉及的一種PMMA薄膜基底微通孔列陣生物芯片如圖2所示，結(jié)構(gòu)如下：

厚度為5μm，為均勻透明的PMMA薄膜1，薄膜1上分布著微通孔列陣2，微通孔為正方形且為全通結(jié)構(gòu)，微通孔孔徑為4μm，孔徑與孔間的間隙比例為1:5，微通孔列陣2的排布方式為矩形分布。

本實施例所涉及的一種PMMA薄膜基底微通孔陣列生物芯片的制作方法流程圖如圖4所示，步驟如下：

(1)用電子天平稱取3gPMMA顆粒，放入盛有30ml的冰醋酸的玻璃瓶中，攪拌后靜置2小時，得到PMMA溶液。將PMMA溶液涂覆在硅片上，勻膠轉(zhuǎn)速為2000rpm，150℃烘烤20min，熱固化，自然冷卻，制得5μm厚的PMMA薄膜。

(2)在PMMA薄膜上旋涂6μm厚的AZ9260光刻膠，在熱板上100℃烘烤3min，然后在光刻膠上放上掩膜版，掩膜版的圖形為正方形的微孔狀圖形的列陣排布，微孔孔徑為4μm，孔徑與孔間的間隙比例為1:5，微孔列陣的排布方式為矩形分布，在10mW/cm²的光刻機下曝光6s，在AZ400K顯影液中顯影40s，制備出光刻圖形。

(3)把有光刻圖形的PMMA薄膜放入等離子刻蝕機中，通入O₂和CHF₃氣體。O₂的流量為30sccm，CHF₃的流量為10sccm，在100W功率下刻蝕0.5小時，制備出PMMA薄膜微通孔陣列。

(4)清洗表面的殘膠，在硅片上揭下PMMA薄膜，制得PMMA薄膜基底微通孔列陣生物芯片。

實施例三：

本實施例所涉及的一種PU薄膜基底微通孔列陣生物芯片如圖3所示，結(jié)構(gòu)如下：

厚度為60μm，為均勻透明的PU薄膜1，薄膜1上分布著微通孔列陣2，微通孔為正六邊形且為全通結(jié)構(gòu)，孔徑為50μm，孔徑與孔間的間隙比例為1:10，微通孔列陣2的排布方式為正六邊形分布。

本實施例所涉及的一種PU薄膜基底微通孔列陣生物芯片的制作方法流程圖如圖4所示，步驟如下：

(1)將106g丙烯酸酯和110g聚乙二醇裝入燒瓶中，加熱到50℃，在攪拌的同時將196g甲苯二異氰酸酯慢慢加入燒瓶中，保溫2小時，慢慢降至室溫，加入稀釋劑混合均勻，得到聚氨酯預(yù)聚體。將聚氨酯預(yù)聚體、丙烯酸酯和安息香丁醚按重量比300:150:3加入容器中，混合均勻，得到光敏聚氨酯溶液。將光敏聚氨酯溶液涂覆在石英片上，勻膠轉(zhuǎn)速為800rpm，紫外固化，制得60μm厚的PU薄膜。

(2)在PU薄膜上旋涂60μm厚的AZ50XT光刻膠，在熱板上100℃烘烤40min，然后在光刻膠上放上掩膜版，掩膜版的圖形為正六邊形的微孔狀圖形的列陣排布，微孔孔徑為50μm，孔徑與孔間的間隙比例為1:10，微孔列陣的排布方式為正六邊形分布，在10mW/cm²的光刻機下曝光60s，在AZ400K顯影液中顯影60s，制備出光刻圖形。

(3)把有光刻圖形的PU薄膜放入等離子刻蝕機中，通入O₂和SF₆氣體。O₂的流量為30sccm，SF₆的流量為10sccm，在100W功率下刻蝕6小時，制備出PU薄膜微通孔陣列。

(4)清洗表面的殘膠，在石英片上揭下PU薄膜，制得PU薄膜基底微通孔列陣生物芯片。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。