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一種親水結(jié)構(gòu)域蛋白基因的制作方法

文檔序號:11827716閱讀:578來源:國知局
本發(fā)明涉及一種親水結(jié)構(gòu)域蛋白基因,以及該基因編碼的蛋白,本發(fā)明還涉及所述基因和蛋白在保護酶活性及減少酶發(fā)生聚集中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
:干旱、鹽堿、冷凍和氧化等逆境是制約生物生長和發(fā)育的非生物脅迫因素。高度親水性蛋白作為極端響應(yīng)逆境脅迫的一個重要組成部分已經(jīng)成為研究的熱點,該蛋白可能作為分子伴侶保護逆境脅迫下的細(xì)胞。然而,有關(guān)親水蛋白的抗逆保護機制仍不清楚。耐輻射異常球菌(DeinococcusradioduransR1)基因組中含有一類親水蛋白,其中有一個編碼干燥脅迫相關(guān)的基因,但目前未見該基因在保護酶活和減少酶發(fā)生聚合方面的功能的研究報道。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的是從DeinococcusradioduransR1基因組中發(fā)現(xiàn)具有酶保護作用的親水結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明發(fā)現(xiàn),耐輻射異常球菌DeinococcusradioduransR1中的Dhp蛋白(DR1172,登錄號:Q9RV58)的親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下可保護酶的活性,并能減少酶發(fā)生聚集和阻止酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本發(fā)明表達(dá)了含有完整親水結(jié)構(gòu)域的核心蛋白((本發(fā)明命名為HD,8個保守基序),并研究了HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件(液氮反復(fù)凍融和H2O2沖擊)下對酶的保護作用。本發(fā)明通過以下研究得到上述結(jié)果:1、Dhp蛋白HD親水結(jié)構(gòu)域分析:圍繞Dhp蛋白的抗逆保護功能,本研究對該蛋白的一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn):Dhp蛋白由298個氨基酸組成,分子量為30.9kDa,富含親水性氨基酸,親水氨基酸含量為61%,是一類親水蛋白。與其它典型的親水蛋白質(zhì)比較,Dhp蛋白顯著的特點是含有一個親水結(jié)構(gòu)域(HD),該結(jié)構(gòu)域親水氨基酸含量為63.9%,HD親水結(jié)構(gòu)域含有8個由11個氨基酸殘基組成的保守基序(motif),兩個基序之間含有7aa或11aa的連接肽,預(yù)測該結(jié)構(gòu)域可能是Dhp蛋白發(fā)揮功能的核心區(qū)域。2、HD親水結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:1)以本實驗室保存的重組質(zhì)粒pET28a-dhp為模板,通過PCR擴增出目的基因(hd);2)將hd基因連接于pET28a表達(dá)載體上,構(gòu)建完整x基因重組質(zhì)粒pET28a-hd;3)將導(dǎo)入hd基因的重組質(zhì)粒pET28a-hd轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌BL21中,獲得工程菌株BL-hd(見實施例2)。3、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化:實驗證實,在IPTG濃度為0.5mM、誘導(dǎo)溫度為16℃的條件下,可溶性目的蛋白條帶最清晰,蛋白表達(dá)量最大。用不同濃度咪唑洗脫液對樹脂上的融合蛋白進(jìn)行洗脫并收集洗脫液,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,確定最合適的咪唑濃度洗脫液。實驗結(jié)果顯示,HD蛋白在50mM咪唑處獲得較純的蛋白(見實施例3)。4、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下對蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的保護作用:1)未加入待測樣品的MDH和LDH酶溶液為對照組,分別進(jìn)行脅迫處理(液氮反復(fù)凍融和H2O2沖擊),測定MDH和LDH酶的活性;2)分別取10μL脅迫處理后的樣品,分別加入到600μL的反應(yīng)液中反應(yīng)1min,測定A340的吸收,根據(jù)A340吸收值的變化計算酶活變化率;此實驗表明:HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下能夠保護MDH和LDH酶活,減少酶活損失(見實施例4)。5、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融脅迫條件下可減少乳酸脫氫酶(LDH)發(fā)生聚集。1)未加入待測樣品的LDH酶溶液為對照組,分別經(jīng)反復(fù)凍融處理1、2、3次,測定LDH的聚合度;2)取200μL脅迫處理后的樣品,測定A340的吸收,根據(jù)A340吸收值的變化計算LDH的聚合度;此實驗表明:HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下能減少LDH發(fā)生聚集(見實施例4)。6、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融脅迫條件下可防止乳酸脫氫酶(LDH)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。1)未加入待測樣品為對照組,樣品依次反復(fù)凍融1次、2次和3次。2)樣品處理完后,立即加入終濃度為5μM的熒光探針ANS。使用熒光分光光度計測定樣品在410nm到590nm之間的熒光發(fā)射光譜(見實施例4)。本發(fā)明的效果體外酶活實驗結(jié)果表明,HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在脅迫條件下均能夠保護蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性。此外,通過測定蛋白聚合度及ANS熒光分析實驗表明,在反復(fù)凍融處理條件下,HD蛋白可阻止LDH發(fā)生聚集,防止LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。表明:由11個氨基酸殘基組成的基序與其對酶保護能力有關(guān)。附圖說明:圖1是HD親水結(jié)構(gòu)域和8個基序在Dhp蛋白中的位置;圖2是HD結(jié)構(gòu)域及序列比對示意圖,其中:a為Dhp蛋白HD結(jié)構(gòu)域簡圖,其中第104-263位氨基酸殘基為HD結(jié)構(gòu)域;b為HD親水結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對,左邊方框內(nèi)為HD結(jié)構(gòu)域的8個由11個氨基酸組成的基序,右邊方框內(nèi)為7個連接肽。對于基序序列分析發(fā)現(xiàn),位于第3、4、6、7、8、10以及第11位置上的氨基酸為親水性氨基酸(黑色加粗表示),親水氨基酸含量為61.36%,其他位置上的氨基酸為疏水性氨基酸。對于11個氨基酸組成的連接肽分析發(fā)現(xiàn),位于第3、4、6、10以及11位置上的氨基酸為親水性氨基酸(黑色加粗表示)。圖3是HD親水結(jié)構(gòu)域示意圖:全長HD蛋白(第104-263位氨基酸殘基序列);圖4是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護液氮反復(fù)凍融條件下蘋果酸脫氫酶(MDH)的活性;圖5是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護不同濃度H2O2條件下蘋果酸脫氫酶(MDH)的活性;圖6是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護液氮反復(fù)凍融條件下乳酸脫氫酶(LDH)的活性;圖7是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白保護不同濃度H2O2條件下乳酸脫氫酶(LDH)的活性;圖8是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可防止液氮反復(fù)凍融條件下LDH發(fā)生聚集;圖9是HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可阻止液氮反復(fù)凍融下LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。序列表說明序列號在dr1172基因中的位置SEQIDNO.1hd基因第310-789位堿基SEQIDNO.2HD蛋白第104-263位氨基酸具體實施方式實施例1Dhp蛋白HD親水結(jié)構(gòu)域分析Dhp蛋白顯著的特點是含有一個親水結(jié)構(gòu)域(HD),該結(jié)構(gòu)域親水氨基酸含量為63.9%,HD結(jié)構(gòu)域含有8個由11個氨基酸殘基組成的基序,在兩個基序之間含有連接肽,共7個連接肽,分別含有4個由11個氨基酸殘基組成和3個由7個氨基酸殘基組成。如圖1所示,對11個氨基酸殘基組成的基序分析發(fā)現(xiàn),位于第3、4、6、7、8、10以及第11位置上的氨基酸為親水性氨基酸(親水氨基酸含量為61.36%),其他位置上的氨基酸為疏水性氨基酸?;蛐蛄刑攸c為[ΦΦE/QXΦKE/QKΦXE/D/Q],其中Φ為疏水氨基酸。對于11個氨基酸組成的連接肽分析發(fā)現(xiàn)(親水氨基酸含量為55.38%),如圖2所示,位于第3、4、6、10以及11位置上的氨基酸為親水性氨基酸,對于7個氨基酸組成的連接肽分析發(fā)現(xiàn),第2、4、6和第7位氨基酸為親水氨基酸。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn),7個連接肽中保守氨基酸為纈氨酸(V),推測該位點在連接肽中可能起著重要作用。實施例2HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建為了研究HD親水結(jié)構(gòu)域的保護功能,本研究對HD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,對結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組并分別構(gòu)建表達(dá)載體,根據(jù)8個由11個氨基酸組成的基序在Dhp蛋白中的位置,我們將Dhp蛋白分為如圖3所示的結(jié)構(gòu):核心蛋白HD(第104-263位氨基酸殘基序列)、以及重組蛋白2HD(含有兩倍的核心蛋白HD氨基酸序列)。以本實驗室保存的重組質(zhì)粒pET28a-dhp為模板,加入PCR特異性引物,擴增完整的核苷酸序列:PCR反應(yīng)條件:98℃5min,[98℃30sec,64℃30sec,72℃1min]33個循環(huán),72℃10min,PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。使用EcoRI/NdeI雙酶切DNA產(chǎn)物和pET28a載體,于4℃或16℃連接過夜。取10μL連接產(chǎn)物加到已經(jīng)化凍的50μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕混勻,置于冰上放置30min;42℃水浴熱擊60s后立即冰浴2min;加入600μL新鮮LB培養(yǎng)基,混勻后,37℃,200rpm培養(yǎng)1h。取200μL菌液涂于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證,提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切,測序驗證正確,將該重組質(zhì)粒分別命名為BL-hd。實施例3HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化(一)實驗方法1、IPTG誘導(dǎo)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)1)將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒BL-hd和BL-2hd菌株劃線活化。挑取單菌落于新鮮的(含卡那霉素50mg/mL)3mL的LB培養(yǎng)基中,37℃220rmp振蕩培養(yǎng)過夜。2)次日將種子液按1:100轉(zhuǎn)接于含Km(50mg/mL)20mL的LB培養(yǎng)基中,于37℃220rmp振蕩培養(yǎng),OD600約0.6~0.8。3)加入終濃度分別為0.5、1.0、1.5mM的IPTG于16℃過夜(同時未加IPTG的作為空白對照),誘導(dǎo)大腸桿菌進(jìn)行外源表達(dá)。4)分別取誘導(dǎo)后的菌液2mL,5,000rmp離心5min,收集菌體。將收集的細(xì)胞用NTA-0緩沖液進(jìn)行震蕩懸浮(1/20培養(yǎng)體積),混勻,冰浴30min。5)加入終濃度為0.05%的TritonX-100,混勻,置于冰上15min。6)利用超聲波對細(xì)胞進(jìn)行破碎。超聲波破碎時間為15min,破碎細(xì)胞頻率為每間隔2s,破碎3s。破碎后,置于冷凍離心機,12000rpm離心10min。7)吸取上清液進(jìn)行純化。2、His-HD親水結(jié)構(gòu)域融合蛋白的純化8)提前制備層析柱,加入2-3mLNTA樹脂于層析柱中,用10倍NTA體積的NTA-0Buffer進(jìn)行洗脫。9)將破碎后的細(xì)胞總蛋白加入到層析柱中,流速為每小時15mL,收集穿透部分。為增加純化效率,反復(fù)上樣3次。流出部分進(jìn)行SDS-PAGE分析。10)加入NTA-0緩沖液進(jìn)行洗脫,用量為5倍樹脂體積。收集液體用于檢測蛋白與樹脂的結(jié)合情況。11)分別加入5倍體積的NTA-20,NTA-50,NTA-100,NTA-200,NTA-500緩沖液進(jìn)行洗脫,流速為每小時15mL。分別收集洗脫緩沖液,用于SDS-PAGE分析確定目標(biāo)蛋白在不同洗脫緩沖液中的分布情況。12)取少量分別加入5×蛋白上樣緩沖液混勻后于沸水浴中煮沸10min,12000rpm,10min。取10μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,確定最終洗脫濃度。(二)實驗結(jié)果通過對HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化,最終確定最優(yōu)條件為IPTG終濃度0.5mM,16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。HD蛋白在50mM咪唑處獲得較純的蛋白。實施例4HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白的功能研究實驗(一)在逆境脅迫條件下對酶的保護作用1.實驗?zāi)康尿炞CHD親水結(jié)構(gòu)域蛋白是否在逆境脅迫條件下對蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的保護作用。實驗中,所述逆境具體是液氮反復(fù)凍融、并用不同濃度H2O2處理。2.實驗材料和方法樣品準(zhǔn)備:MDH(來自于豬心臟)、NADH和LDH(來自于兔肌肉)均購自SIGMA公司;BSA為限制性內(nèi)切酶中BSA(購自NEB公司)。酶活測定所用溶液:(1)蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活測定所用溶液配制:MDH酶溶解液的配制(50mM磷酸鉀緩沖液):取7.17mL1mol/LK2HPO4和2.83mL1mol/LKH2PO4混合后,加滅菌水定容至200mL,調(diào)pH至7.2。MDH酶反應(yīng)液的配制:稱取0.00264g草酰乙酸和0.0142gNADH,加入150mM磷酸鉀緩沖液定容至100mL,配制成終濃度為0.2mM的草酰乙酸和0.2mM的NADH的磷酸鉀緩沖液。(2)乳酸脫氫酶(LDH)酶活測定所用溶液配制:LDH酶溶解液的配制:25mMTris-HCl,加滅菌水定容至500mL,調(diào)pH至7.5。LDH酶反應(yīng)液的配制:分別稱取1.489g的氯化鉀,0.044g的丙酮酸鈉,0.02127g的NADH,加入25mMTris-HCl定容至200ml,配制成終濃度為100mM氯化鉀,2mM丙酮酸鈉和0.15mM的NADH,調(diào)pH至7.5。(3)酶活性的測定方法取10μl待測溶液加入到600μL底物中。紫外分光光度計測定反應(yīng)體系在1min內(nèi)340nm處吸光值的減少。每個反應(yīng)獨立重復(fù)3次。3.實驗結(jié)果如圖4—7和表1-表4所示。在未處理時,MDH和LDH沒有受到影響,在經(jīng)過反復(fù)凍融和H2O2處理后,MDH和LDH活性均有不同程度的降低,而加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白后保護MDH和LDH酶的活性。BSA是一種蛋白穩(wěn)定劑,對MDH和LDH也有一定的保護作用,但其保護作用遠(yuǎn)低于HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白對MDH和LDH酶的保護作用。從表1-4中MDH和LDH酶的活性,可看出HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融和H2O2條件下對MDH和LDH的保護作用。表1HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護液氮反復(fù)凍融條件下MDH的活性表2HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護不同濃度H2O2條件下MDH的活性表3HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護液氮反復(fù)凍融條件下LDH的活性表4HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可保護不同濃度H2O2條件下LDH的活性4.實驗結(jié)論:HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在逆境脅迫條件下能夠保護MDH和LDH的活性。實驗(二)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在反復(fù)凍融條件下減少發(fā)生聚集的觀察1.實驗?zāi)康尿炞CHD親水結(jié)構(gòu)域蛋白能否在液氮反復(fù)凍融條件下減少LDH發(fā)生聚集。2.實驗方法LDH聚合度是使用紫外分光光度計測定樣品在340nm處的吸光值。170μL的LDH酶溶液,終濃度配成200μg/mL的測試溶液。根據(jù)文獻(xiàn)報道,LDH與蛋白的摩爾比為1:5。將酶溶液放入液氮中速凍1min,室溫復(fù)性,依次反復(fù)凍融1次、2次和3次,測定酶溶液在A340處的吸光值。3.實驗結(jié)果如圖8和表5所示,在經(jīng)過反復(fù)凍融處理后,LDH迅速發(fā)生了聚集,隨著凍融次數(shù)增加,LDH發(fā)生聚集的程度越高,而加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可顯著減少LDH發(fā)生聚集。BSA雖然也減少LDH發(fā)生一定程度的聚集,但保護能力比HD結(jié)構(gòu)域蛋白弱。表明HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可減少反復(fù)凍融處理下LDH酶發(fā)生聚集。表5HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下減少LDH發(fā)生聚集4.實驗結(jié)論:Dhp蛋白HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下能夠減少LDH發(fā)生聚集。實驗(三)HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融脅迫條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的觀察1.實驗?zāi)康尿炞CHD親水結(jié)構(gòu)域蛋白能否在液氮反復(fù)凍融條件下防止LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。2.實驗方法熒光的變化是由于結(jié)合了熒光探針1-anilinonaphatalene-8-sulphonate(ANS,Sigma)。LDH孵育在25mMTris-HCl,pH7.5,終濃度為500nM。LDH與蛋白的摩爾比為1:5。未加入待測樣品為對照組。樣品反復(fù)凍融3次,待融化后立即加入終濃度為5μM的熒光探針ANS。使用熒光分光光度計測定樣品在410nm到590nm之間的熒光發(fā)射光譜。3.實驗結(jié)果單獨的ANS在溶液中不發(fā)熒光,當(dāng)ANS與蛋白表面的疏水基團結(jié)合后發(fā)出熒光。在LDH酶液中分別加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白,經(jīng)反復(fù)凍融處理3次后,檢測LDH酶的熒光變化。如圖9和表6所示,未處理的LDH、HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白熒光強度較低,而經(jīng)過反復(fù)凍融處理3次后,LDH熒光顯著增強,而加入HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白后,熒光強度有所不同程度的降低,表明HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可減少反復(fù)凍融處理下LDH酶結(jié)構(gòu)改變。表6HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白可防止液氮反復(fù)凍融條件下LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變4、實驗結(jié)論HD親水結(jié)構(gòu)域蛋白在液氮反復(fù)凍融條件下能夠阻止LDH結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。當(dāng)前第1頁1 2 3 
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