本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron.)引起的十字花科蔬菜病害。目前一般認(rèn)為包括兩個世代：休眠孢子、原生質(zhì)團，和三個階段：在土壤中存活階段、根毛侵染階段、皮層侵染階段(Kageyama&Asano，2009)。能夠促使這些休眠孢子萌發(fā)的條件目前不是很清楚，但是他們在環(huán)境溫度6℃到27℃，酸性pH值(小于6.0)條件下容易成功侵染寄主(Karling，1968)。在感病寄主出現(xiàn)和土壤中的水分接近飽和時，休眠孢子萌發(fā)釋放出初生游動孢子，具有一對不同長度前置的鞭毛(Brown，1997)。當(dāng)初生游動孢子到達(dá)根毛或根的表皮細(xì)胞時，他丟掉鞭毛而變成變形蟲模樣(Roberts&Boothroyd，1972)。游動孢子的內(nèi)含物被注入進(jìn)寄主細(xì)胞，多核的原生質(zhì)團在細(xì)胞內(nèi)開始發(fā)育(Rush，2003)。雖然根毛侵染的作用還不是很清楚，但一般認(rèn)為根毛侵染能夠增加根腫菌在感病寄主中的群體數(shù)量，并導(dǎo)致寄主的嚴(yán)重發(fā)病(Mitanietal.，2003)。在初侵染階段，孢子囊的原生質(zhì)團在表皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育成一個薄壁游動孢子囊，內(nèi)含4至8個次生游動孢子(Agrios，2005)。但是第二階段的侵染深入發(fā)生在被侵染寄主根部的皮層細(xì)胞和中柱細(xì)胞(Dixon&Page，1998)。侵染的結(jié)果導(dǎo)致寄主植物組織的變態(tài)的增值，產(chǎn)孢原生質(zhì)團發(fā)育并形成根腫(Rush，2003)。當(dāng)被根腫菌侵染寄生的根腫裂解腐爛以后產(chǎn)生大量的厚壁休眠孢子釋放進(jìn)入土壤，并能夠長期在土壤中存活達(dá)7年以上。接種方法方面，由于根腫菌是嚴(yán)格專性寄生菌，根腫菌的人工繁殖與接種鑒定對所采用接種方法及試驗材料要求嚴(yán)格，這項工作也是開展根腫病研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前根腫菌的接種鑒定方法有蘸根法、點滴法和菌土法；接種濃度大多為1×107～1×108spores/ml；操作程序比較復(fù)雜要求嚴(yán)格，而且過程中容易形成不同菌源間的交叉污染。使用不同的營養(yǎng)基質(zhì)接種根腫菌后寄主苗的發(fā)病效果不一樣，根腫菌接種發(fā)病不穩(wěn)定影響試驗鑒定的結(jié)果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)及其制備方法，旨在解決目前根腫菌的接種鑒定方法操作程序比較復(fù)雜要求嚴(yán)格，容易形成不同菌源間的交叉污染和接菌后植株發(fā)病不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)，該根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)組分按照體積比為：泥炭土：蛭石：珍珠巖＝1:0.8～1.2:0.8～1.2。本發(fā)明的另一目的在于提供一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)的制備方法，所述根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)的制備方法包括以下步驟：將泥炭土、蛭石、珍珠巖按照體積比1:0.8～1.2:0.8～1.2比例均勻混合，并將制備的營養(yǎng)基質(zhì)分裝入滅菌袋中；將裝有營養(yǎng)基質(zhì)的滅菌袋放入高壓滅菌器中，滅菌；將經(jīng)滅菌處理后的營養(yǎng)基質(zhì)分裝入圓形塑料營養(yǎng)缽中并壓實；用濃鹽酸配置酸性水，從營養(yǎng)缽底部的托盤中澆入用濃鹽酸配置的酸性水，使?fàn)I養(yǎng)基質(zhì)土壤中浸透酸性水分待用。進(jìn)一步，滅菌方法為：121℃濕熱滅菌30分鐘。進(jìn)一步，所述用濃鹽酸配置的酸性水pH值為6.0。本發(fā)明的另一目的在于提供一種在根腫菌擴繁中應(yīng)用的營養(yǎng)基質(zhì)，該在根腫菌擴繁中應(yīng)用的營養(yǎng)基質(zhì)組分為100％石英砂。進(jìn)一步，石英砂粒徑為1mm～2mm。本發(fā)明的另一目的在于提供一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)在根腫菌接種鑒定繁殖中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)及其制備方法，通過對6種培養(yǎng)基質(zhì)的比較，發(fā)現(xiàn)的6號培養(yǎng)基質(zhì)的配方即按照體積比包括：泥炭土：蛭石：珍珠巖＝1:0.8～1.2:0.8～1.2，在感病寄主的發(fā)病率達(dá)100％、病情指數(shù)達(dá)到69.6(大于病情指數(shù)50的閾值)，是一種可用于根腫菌接種鑒定的良好的培養(yǎng)基質(zhì)；在根腫菌接種試驗中感病寄主發(fā)病表現(xiàn)穩(wěn)定，能夠用來進(jìn)行根腫菌生理小種鑒定及品種抗根腫病的篩選鑒定；根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)按照體積比包括：泥炭土：蛭石：珍珠巖＝1:0.8～1.2:0.8～1.2，采用此配比配方的營養(yǎng)基質(zhì)接種根腫菌，感病品種的發(fā)病率達(dá)100％，發(fā)病穩(wěn)定；2號培養(yǎng)基質(zhì)配方即100％石英砂的寄主苗的發(fā)病率較低，但是其寄主苗發(fā)病后營養(yǎng)體的生長良好容易形成大的單個的腫瘤，2號培養(yǎng)基可以用來作為根腫菌的擴繁，容易得到較好的大腫塊使用。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例提供的根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)的制備方法流程圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種簡便高效的根腫菌接種鑒定繁殖的方法，采用點滴接種法比較不同配比的營養(yǎng)基質(zhì)以及不同的接種濃度下根腫菌的接種效率，為開展根腫病本發(fā)明提供了統(tǒng)一的接種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)，該根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)組分按照體積比為：泥炭土：蛭石：珍珠巖＝1:0.8～1.2:0.8～1.2。如圖1所示：本發(fā)明的另一目的在于提供一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)的制備方法，所述根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)的制備方法包括以下步驟：S101：將泥炭土、蛭石、珍珠巖按照體積比1:0.8～1.2:0.8～1.2比例均勻混合，并將制備的營養(yǎng)基質(zhì)分裝入滅菌袋中；S102：將裝有營養(yǎng)基質(zhì)的滅菌袋放入高壓滅菌器中，滅菌；S103：將經(jīng)滅菌處理后的營養(yǎng)基質(zhì)分裝入圓形塑料營養(yǎng)缽中并壓實；S104：用濃鹽酸配置酸性水，從營養(yǎng)缽底部的托盤中澆入用濃鹽酸配置的酸性水，使?fàn)I養(yǎng)基質(zhì)土壤中浸透酸性水分待用。滅菌方法為：121℃濕熱滅菌30分鐘。所述用濃鹽酸配置的酸性水pH值為6.0。本發(fā)明提供一種在根腫菌擴繁中應(yīng)用的營養(yǎng)基質(zhì)，該在根腫菌擴繁中應(yīng)用的營養(yǎng)基質(zhì)組分為100％石英砂。石英砂粒徑為1mm～2mm。本發(fā)明提供一種根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)在根腫菌接種鑒定繁殖中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)及其制備方法，通過對6種培養(yǎng)基質(zhì)的比較，發(fā)現(xiàn)的6號培養(yǎng)基質(zhì)的配方即按照體積比包括：泥炭土：蛭石：珍珠巖＝1:0.8～1.2:0.8～1.2，在感病寄主的發(fā)病率達(dá)100％、病情指數(shù)達(dá)到69.6(大于病情指數(shù)50的閾值)，是一種可用于根腫菌接種鑒定的良好的培養(yǎng)基質(zhì)；在根腫菌接種試驗中感病寄主發(fā)病表現(xiàn)穩(wěn)定，能夠用來進(jìn)行根腫菌生理小種鑒定及品種抗根腫病的篩選鑒定；根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)按照體積比包括：泥炭土：蛭石：珍珠巖＝1:0.8～1.2:0.8～1.2，采用此配比配方的營養(yǎng)基質(zhì)接種根腫菌，感病品種的發(fā)病率達(dá)100％，發(fā)病穩(wěn)定；2號培養(yǎng)基質(zhì)配方即100％石英砂的寄主苗的發(fā)病率較低，但是其寄主苗發(fā)病后營養(yǎng)體的生長良好容易形成大的單個的腫瘤，2號培養(yǎng)基可以用來作為根腫菌的擴繁，容易得到較好的大腫塊使用。下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。本發(fā)明通過試驗6種營養(yǎng)基質(zhì)配方和7個根腫菌接種濃度(休眠孢子懸浮液濃度)對根腫菌接種鑒定效果的影響。試驗結(jié)果表明2號(石英沙)與6號(泥炭土-蛭石-珍珠巖)營養(yǎng)基質(zhì)配方的處理均有根腫病發(fā)病癥狀，其它處理(1、3、4、5號處理)均不發(fā)病。其中6號營養(yǎng)基質(zhì)配方的處理根腫病發(fā)病率達(dá)100％，病情指數(shù)達(dá)69.6，是一種理想的根腫菌接種用營養(yǎng)基質(zhì)配方，其發(fā)病率高、發(fā)病穩(wěn)定可用來進(jìn)行根腫菌生理小種的鑒別與抗根腫病育種材料的鑒定篩選；2號處理的營養(yǎng)體生長旺盛容易形成較大的根腫，可用來作為根腫菌的擴繁的營養(yǎng)基質(zhì)。根腫病的發(fā)病率隨著接種濃度的增加發(fā)病率與病情指數(shù)均表現(xiàn)升高，其中接種濃度為1×106、1×107和1×108spores/ml的處理在接種后50dai發(fā)病率均達(dá)到100％，而且根腫病發(fā)病穩(wěn)定是理想的接種濃度。試驗的具體步驟如下：1材料與方法1.1試驗材料與設(shè)備條件根腫菌來源于安徽省黟縣柯村王貴華田甘藍(lán)型油菜根腫病病株，經(jīng)Williams生理小種鑒別寄主鑒定為4號小種，接種用寄主材料為白菜感病品種“速生2號”(由中國農(nóng)科院花卉與蔬菜本發(fā)明所張慧博士提供)。人工接種試驗在氣候溫室中進(jìn)行，光照控制為白天16h、黑夜8h；溫度控制為白天24℃、黑夜18℃，濕度控制為80％。1.2營養(yǎng)基質(zhì)配方接種試驗營養(yǎng)基質(zhì)成分主要有營養(yǎng)土、泥炭土、石英砂、蛭石、珍珠巖等5種，試驗設(shè)計6種營養(yǎng)基質(zhì)配方處理，其營養(yǎng)基質(zhì)的配比如下(表1)。將配置的營養(yǎng)基質(zhì)使用前先用高壓滅菌鍋滅菌處理(121℃，30min)。將滅菌的營養(yǎng)基質(zhì)分裝入50孔(每孔100ml)的育苗盤中，并放在配套的托盤上用酸水(pH6.0)澆透；感病品種“速生2號”用70％(v/v)乙醇消毒10s后用無菌去離子水(ddH2O)震蕩漂洗2次，然后每孔播種3粒，每個試驗處理3次重復(fù)，每重復(fù)30棵苗。出苗7d接種，用塑料滴管吸取接種濃度為1×107spores/ml的休眠孢子懸浮液1ml接種于苗子根部。接種后用酸水(pH6.0，用濃鹽酸配置)澆入托盤中，接種苗放入人工氣候溫室；接種后2周內(nèi)保持營養(yǎng)土中水分充足。6周后調(diào)查病害發(fā)病。表1、營養(yǎng)基質(zhì)配方編號處理1100％蛭石2100％石英砂3蛭石/石英砂1:14蛭石/石英砂/營養(yǎng)土1:1:15蛭石/營養(yǎng)土1:16泥炭土/蛭石/珍珠巖1:1:11.3根腫菌接種濃度試驗根腫菌休眠孢子濃度分別設(shè)1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108spores/ml等7個接種濃度處理(表2)。使用的營養(yǎng)基質(zhì)為營養(yǎng)基質(zhì)配方接種試驗中的營養(yǎng)基質(zhì)6號配方，主要成分為泥炭土、蛭石、珍珠巖按照1:1:1比列均勻混合，營養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)滅菌處理后分裝入圓形塑料營養(yǎng)缽(直徑15cm，高12cm)中。接種苗(速生2號)的播種處理與接種方法同營養(yǎng)基質(zhì)配方接種試驗，每個營養(yǎng)缽播種10棵苗，每個試驗處理3次重復(fù)，每重復(fù)30棵苗。接種后15dai或20dai取樣使用光學(xué)顯微鏡觀察寄主根毛的根腫菌侵染情況，接種6周后調(diào)查評價根腫病發(fā)病情況。表2、休眠孢子懸浮液的接種濃度處理號休眠孢子懸浮液的濃度(spores/ml)11×10221×10331×10441×10551×10661×10771×1081.4根腫菌接種液制備收集休眠孢子采用Feng等(2013)方法，從冰柜中取出儲藏在-20℃下的油菜根腫1個(30克左右)，置于室溫下1h，將解凍軟化后的根腫放入攪拌機中(九陽料理機JYL-C16D)，加入100ml的無菌去離子水(ddH2O)攪拌。待根腫充分?jǐn)囁楹蠡旌弦河?層紗布過濾后，得到根腫菌休眠孢子懸浮液在50g離心5分鐘，收集上清液(含休眠孢子)，從中上清液中取樣1ml稀釋50倍，用醫(yī)用血球計數(shù)板檢查根腫菌休眠孢子數(shù)量并計算休眠孢子的濃度(1毫升休眠孢子懸浮液中休眠孢子的個數(shù)＝80個小格中的休眠孢子數(shù)量/80×400×104×50)，然后用無菌去離子水(ddH2O)將孢子懸浮液的濃度調(diào)到所需濃度置入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.5光學(xué)顯微觀察接種后20d(dai)，用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX51)觀察根腫菌侵染寄主情況，每個重復(fù)取3棵苗，將根部用手術(shù)刀片切成5mm長的根段，分別用光學(xué)顯微鏡的20倍和40倍物鏡觀察根毛侵染率與細(xì)胞中次生原生質(zhì)團數(shù)量的情況，獲得的3株苗子的數(shù)據(jù)的平均值作為重復(fù)的數(shù)據(jù)值。1.6根腫調(diào)查與數(shù)據(jù)處理接種后42d(dai)，調(diào)查記載油菜根腫病的發(fā)病情況，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)采用0至3級來分級，苗期油菜根腫病分級標(biāo)準(zhǔn)：0級為根部無病，1級為根部有細(xì)小腫瘤，2級為根部有中等腫瘤，3級為根部有異常大腫瘤。分別計算病株率及病情指數(shù)。病株率％＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100；病情指數(shù)＝∑(病株數(shù)×相應(yīng)級別)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級別)×100。采用Excell軟件整理試驗原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行相關(guān)回歸統(tǒng)計分析并作圖；利用SAS9.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1營養(yǎng)基質(zhì)對根腫菌侵染感病寄主的影響使用6種不同的營養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行根腫菌接種效果的本發(fā)明結(jié)果表明不同營養(yǎng)基質(zhì)的處理根腫病發(fā)病情況差異較大(表3)。試驗接種6周后根據(jù)0至3級的根腫病調(diào)查分類標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查接種寄主苗油菜根腫病的發(fā)病情況，只有2號處理(100％石英砂培養(yǎng)基質(zhì))和6號處理(泥炭土/蛭石/珍珠巖1:1:1)接種寄主苗有根腫病發(fā)病，其他1號、3號、4號、5號處理接種寄主苗均不發(fā)病。其中6號處理的寄主苗發(fā)病率達(dá)100％，病情指數(shù)達(dá)69.6，是理想的根腫病接種用的營養(yǎng)基質(zhì)。2號處理接種寄主苗根腫病發(fā)病率為52.4％。從苗子的生長勢來看，6種培養(yǎng)基基質(zhì)上培養(yǎng)的寄主苗生長勢來看1號至5號培養(yǎng)基質(zhì)的寄主苗生長旺盛，2號處理的寄主苗與未發(fā)病處理的寄主苗在生長勢上沒有差別，但是6號營養(yǎng)基質(zhì)上的寄主苗生長勢較弱，寄主苗明顯小于其他未發(fā)病的處理的寄主苗，這種現(xiàn)象是由于發(fā)病株根部的養(yǎng)分與水分的吸收能力受到病根腫塊的限制影響的結(jié)果。6號處理與同樣發(fā)病的2號處理比較，2號處理的苗子明顯大于6號處理，從病株的根腫發(fā)育特點來看，6號處理的根部出現(xiàn)多腫塊，在須根上也有腫塊出現(xiàn)，呈現(xiàn)發(fā)病早、病害重的特點；而2號處理的病株根部呈現(xiàn)單一的較大腫塊。表3、6種營養(yǎng)基質(zhì)的根腫病發(fā)病情況編號處理病株率％病情指數(shù)1100％蛭石0.00.02100％石英砂52.436.63蛭石/石英砂1:10.00.04蛭石/石英砂/營養(yǎng)土1:1:10.00.05蛭石/營養(yǎng)土1:10.00.06泥炭土/蛭石/珍珠巖1:1:1100.069.62.2接種濃度對根腫菌接種鑒定的影響對7種接種濃度的休眠孢子懸浮液接種感病寄主20dai后在光學(xué)顯微觀察根腫菌侵染的結(jié)果表明：在接種后20dai全部處理的根毛均有根腫菌侵染，不同的接種濃度處理間的根毛侵染率差異顯著，并隨著接種濃度的增加而根毛侵染率升高，接種濃度為1×107和1×108spores/ml的處理20dai根毛侵染率達(dá)到或接近100％，而且接種濃度為1×105、1×106、1×107和1×108spores/ml的處理在接種后20dai就已經(jīng)出現(xiàn)了根腫，但低接種濃度的處理則沒有出現(xiàn)根腫。在接種后20dai不同接種濃度處理間的次生原生質(zhì)團數(shù)差異不顯著。接種后50dai根腫病分級調(diào)查結(jié)果表明：7種接種濃度的處理均出現(xiàn)有根腫，不同接種濃度處理間發(fā)病率與病情指數(shù)均達(dá)到顯著的差異。發(fā)病率為12％至100％，隨著接種濃度的增加感病品種的發(fā)病率和病情指數(shù)均表現(xiàn)升高，其中接種濃度為1×106、1×107和1×108spores/ml的處理在接種后50dai發(fā)病率均達(dá)到100％；低接種濃度的處理則有大量未發(fā)病株，其中休眠孢子濃度1×102spores/ml的處理發(fā)病率小于20％。本試驗通過對6種培養(yǎng)基質(zhì)的比較，發(fā)現(xiàn)的6號培養(yǎng)基質(zhì)的配方在感病寄主的發(fā)病率達(dá)100％、病情指數(shù)達(dá)到69.6(大于病情指數(shù)50的閾值)，是一種可用于根腫病接種鑒定的良好的培養(yǎng)基質(zhì)。由于其在根腫菌接種試驗中表現(xiàn)的發(fā)病穩(wěn)定性，這種營養(yǎng)基質(zhì)配方能夠用來進(jìn)行生理小種鑒定及品種抗性的篩選鑒定。2號培養(yǎng)基質(zhì)配方的寄主苗的發(fā)病率較低，但是其寄主苗發(fā)病后營養(yǎng)體的生長良好容易形成大的單個的腫瘤，因此2號培養(yǎng)基可以用來作為本發(fā)明中的根腫菌的擴繁，用該2號培養(yǎng)基擴繁根腫菌容易得到單個大的根腫。根腫菌接種鑒定的濃度以1×106至1×107spores/ml為宜，低濃度發(fā)病率較低，孢子濃度太高則會出現(xiàn)發(fā)病早過早形成死苗。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3