本發(fā)明具體涉及一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2015年中國預(yù)計(jì)有429.2萬例新發(fā)腫瘤病例和281.4萬例死亡病例。肺癌是發(fā)病率最高的腫瘤，也是癌癥死因之首。胃癌、食管癌和肝癌是緊隨其后的我國發(fā)病率和死亡率較高的常見腫瘤。

癌癥治療傳統(tǒng)的方法有手術(shù)、化療、放療。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，靶向藥物治療中晚期肺癌越來越成為一條新路，其中的治療也根據(jù)疾病類型各不相同。對不同驅(qū)動(dòng)基因類型的癌癥患者，在治療上一定要區(qū)別對待。存在有靶點(diǎn)的患者，可優(yōu)先采用靶向治療。靶向治療和化療是完全不同的治療措施，有很多的機(jī)制參與腫瘤的發(fā)病，而這些機(jī)制往往是腫瘤細(xì)胞所特有的，所謂的靶向治療就是阻斷腫瘤發(fā)病機(jī)制當(dāng)中特有的信號傳導(dǎo)通路，或者某一分子發(fā)病機(jī)制，從而達(dá)到扼殺腫瘤的目的。因此靶向治療能顯著減少患者的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。

目前具有明確指導(dǎo)意義的靶點(diǎn)部分信息如下：

egfr基因：egfr基因位于染色體7p22-p12上。表皮細(xì)胞生長因子受體(egfr)及其配體是影響不同細(xì)胞功能的細(xì)胞信號分子，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和生存，并影響組織生長。egfr(表皮生長因子受體)分子有3個(gè)部分：第一個(gè)部分延伸在細(xì)胞外，包括結(jié)合表皮生長因子(egf)的位點(diǎn)；第二部分嵌入細(xì)胞膜中；第三部分延伸至細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)中。egfr是一種由相連的磷酸化酪氨酸殘基組成的蛋白質(zhì)激酶。

egfr是一種跨膜受體酪氨酸激酶，該區(qū)域的激活即磷酸化對癌細(xì)胞增值、生長的相關(guān)信號傳遞具有重要意義。因此，egfr作為癌癥治療的分子靶標(biāo)受體普遍關(guān)注，并陸續(xù)開發(fā)出了吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)和埃克替尼(icotinib)等egfr酪氨酸激酶抑制劑(egfr-tyrosinekinaseinhibitor,egfr-tki)和抗egfr抗體等。

大量研究結(jié)果顯示，egfr基因突變狀態(tài)是決定egfr-tki療效最重要的預(yù)測因子。而egfr基因突變的發(fā)生率在女性、非吸煙者、腺癌、亞裔人群中發(fā)生頻率較高。egfr基因突變的發(fā)生率雖然在腺癌中較高，但在未分化腺癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌(尤其是與腺癌的復(fù)合型)等患者中也經(jīng)常可以檢測到egfr基因的突變。

在非小細(xì)胞肺癌患者中檢測egfr基因的突變狀態(tài)具有重要的臨床意義，是決定患者是否能夠應(yīng)用egfr-tki治療的先決條件。

k-ras基因：k-ras基因長約38kb，帶有4個(gè)外顯子，其中外顯子4具有2種轉(zhuǎn)錄形式，分別為4a和4b。隨后研究發(fā)現(xiàn)k-ras基因總共帶有6個(gè)外顯子，外顯子2、3、4是保守不變的外顯子編碼區(qū)，外顯子5在轉(zhuǎn)錄時(shí)有可能發(fā)生拼接而形成k-rasb蛋白。在k-rasa的轉(zhuǎn)錄mrna中外顯子6編碼3端非編碼區(qū)，而在k-ras的轉(zhuǎn)錄mrna中外顯子6編碼碳端區(qū)域。

在細(xì)胞增殖分化信號從激活的跨膜受體傳遞到下游蛋白激酶的過程中k-ras起重要作用。ras蛋白為膜結(jié)合型的三磷酸鳥苷(gtp)p二磷酸鳥苷(gdp)結(jié)合蛋白，相對分子質(zhì)量21×103，又稱為p21蛋白，以兩種形式存在于細(xì)胞膜內(nèi)表面，活性形式p21-gtp，非活性形式為p21-gdp，當(dāng)p21蛋白受一些影響細(xì)胞生長，發(fā)育，分化的因子誘導(dǎo)激活后，就將細(xì)胞膜表面的信號，如生長因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)等轉(zhuǎn)遞到細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器上，同時(shí)自身受由縫隙控制的gtpase水解，從活性狀態(tài)恢復(fù)到非活性狀態(tài)。通過ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活下游信號分子，持續(xù)刺激細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖，引起細(xì)胞惡變。

k-ras基因是啟動(dòng)與維持惡性轉(zhuǎn)化表型所必需的，但它不誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移表型。在臨床實(shí)驗(yàn)中，只有當(dāng)細(xì)胞處于增殖階段時(shí)，k-ras才能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。k-ras突變基因產(chǎn)生的癌蛋白與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)。對于腫瘤來說，腫瘤的生長主要依賴于腫瘤周圍的血管不斷補(bǔ)充營養(yǎng)，這個(gè)過程大部分是通過癌蛋白的活性來激發(fā)的，使腫瘤抑制基因失活，致癌基因能夠在癌細(xì)胞中促進(jìn)瘤血管的生成。k-ras的基因12位密碼子野生型為甘氨酸，突變型常為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸三種，突變的結(jié)果導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變，從而產(chǎn)生具有致癌活性的p21蛋白。k-ras基因發(fā)生異常時(shí)，鳥苷三磷酸酶(gtpase)活性降低，p21-gtp牢固結(jié)合而不被gtpase水解，一直處于激活狀態(tài)，持續(xù)刺激細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖，引起細(xì)胞惡變。因此，k-ras基因在12、13密碼子的基因突變產(chǎn)生具有致癌活性的p21蛋白，通過ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活下游信號分子，持續(xù)刺激細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖，引起細(xì)胞惡變。

k-ras是最容易被激活的原癌基因之一，在所有人類腫瘤中k-ras突變率能達(dá)到17％至25％。k-ras基因易激活的主要區(qū)域包括密碼子12、13、25、61和63。這些突變激活能導(dǎo)致ras蛋白聚集，影響gtp結(jié)合狀態(tài)，從而抑制gtp酶活性和阻抑gtp酶激活蛋白。

西妥昔單抗和帕尼單抗是作用于egfr的單克隆抗體靶向藥物，可以抑制下游的信號通路傳導(dǎo)。ras/raf/mapk通路位于egfr信號傳導(dǎo)通路的下游。大約40％的結(jié)直腸癌伴有編碼kras基因的區(qū)域第2外顯子的12、13和61密碼子突變。研究表明kras基因突變接受西妥昔單抗與帕尼單抗的治療無效，因此美國fda對西妥昔單抗和帕尼單抗的產(chǎn)品說明書里特別指明，這類藥品不推薦用于kras突變型的結(jié)直腸癌。

b-raf基因：b-raf基因全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌(v-raf)致癌同源體b1，定位于人染色體7q34，其具有功能的編碼區(qū)由2150對堿基組成，編碼mapk通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，該酶將信號從ras轉(zhuǎn)導(dǎo)至mek1/2，從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。b-raf基因突變能激活erk信號，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，防止細(xì)胞凋亡。約70％的惡性黑色素瘤和15％的結(jié)腸癌中存在體細(xì)胞b-raf基因錯(cuò)義突變。

b-raf基因作為raf-mek-erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。正常的b-raf蛋白的功能是傳遞來自細(xì)胞膜的信號。b-raf蛋白通常只在需要傳遞信號時(shí)保持活性狀態(tài)。然而，突變的b-raf則一直保持活性狀態(tài)，并因此干擾了細(xì)胞信號傳遞鏈的正常功能，引起細(xì)胞的異常。使用小分子抑制劑mapk/erk激酶和合成基因及藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)b-raf突變能增強(qiáng)mek途徑，無論其是否有野生型細(xì)胞還是ras突變細(xì)胞。mek依賴于組織是否攜帶有b-raf突變，與組織相關(guān)性無關(guān)，與細(xì)胞周期蛋白d1蛋白表達(dá)和g1期阻滯誘導(dǎo)下調(diào)無關(guān)。用藥物抑制mek作用能完全消除帶有b-raf突變的腫瘤的生長。

braf基因突變最先在黑色素瘤患者中檢測到，在黑色素瘤、甲狀腺瘤中突變率較多(約80％)，而在淋巴瘤、直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中突變率較少。其中非小細(xì)胞肺癌(nsclc)中braf突變率約為3％，大部分是腺癌。

n-ras基因：n-ras基因由四個(gè)外顯子組成，分布于全長約30kb的dna上。它們的編碼產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量2.1萬的蛋白質(zhì)，故稱為p21蛋白。n-ras位于1號染色體短臂上(1p22～p32)。

作為原癌基因的n-ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因。n-ras基因激活的方式有3種：基因點(diǎn)突變，基因大量表達(dá)，基因插入及轉(zhuǎn)位.其中n-ras基因被激活最常見的方式就是點(diǎn)突變，多發(fā)生在n端第12,13和61密碼子，其中又以第12密碼子突變最常見。不同突變位點(diǎn)對p21的活化機(jī)制不同，第12密碼子突變可以減弱p21內(nèi)在的gtp酶活性，并使細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞間接觸抑制減弱；第61密碼子突變可削弱gap對p21的內(nèi)在gtp酶活性，并可減弱gap與p21結(jié)合的穩(wěn)定性。

n-ras基因激活構(gòu)成癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物ras蛋白發(fā)生構(gòu)型改變，功能也隨之改變，與gdp的結(jié)合能力減弱，和gtp結(jié)合后不需外界生長信號的刺激便自身活化.此時(shí)ras蛋白內(nèi)在的gtp酶活性降低，或影響了gtp的活性，使ras蛋白和gtp解離減少，失去了gtp與gdp的有節(jié)制的調(diào)節(jié)，活化狀態(tài)的ras蛋白持續(xù)地激活plc產(chǎn)生第二信使，造成細(xì)胞不可控制地增殖，惡變。同時(shí)細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞間接觸抑制增強(qiáng)也加速了這一過程。

西妥昔單抗和帕尼單抗是作用于egfr的單克隆抗體靶向藥物，可以抑制下游的信號通路傳導(dǎo)。ras/raf/mapk通路位于egfr信號傳導(dǎo)通路的下游。大約20％的結(jié)直腸癌伴有編碼n-ras基因的區(qū)域第2外顯子的12、13和61密碼子突變。研究表明n-ras基因突變接受西妥昔單抗與帕尼單抗的治療無效。

pik3ca基因：pik3ca基因位于3q26.3，長34kb，包含21個(gè)外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產(chǎn)生一組長124kd的蛋白。pik3ca編碼i類磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases,pi3ks)的p110催化亞單位，即pi3kp110a。

pik3ca的突變約4/5發(fā)生在螺旋區(qū)(exon9)和激酶區(qū)(exon20)這兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域。其突變不僅可以減少細(xì)胞的凋亡還可以促進(jìn)腫瘤的浸潤、提高其下游激酶pi3ks的活性。關(guān)于pik3ca突變這兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，激酶區(qū)和螺旋區(qū)的突變可能通過不同的機(jī)制引起酶功能性的改變。不同區(qū)域的突變，分別通過與pi3ks的調(diào)節(jié)亞單位p85和ras-gtp相互作用的不同機(jī)制導(dǎo)致pi3ks的活化。

癌基因pik3ca是在關(guān)于pi3ks家族與腫瘤的發(fā)生關(guān)系及其機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)的。pi3ks活性改變與pik3ca癌基因的突變有關(guān)，pik3ca的突變可以通過增強(qiáng)pi3ks的活性參與人類原發(fā)性腫瘤的發(fā)生。約30％的人類實(shí)體腫瘤中存在癌基因pik3ca的突變，其突變的比例在結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌中分別約為32％、27％、25％、8％和4％。

her2基因：her2基因，即c-erbb-2基因，定位于染色體17q12-21.32上，編碼相對分子質(zhì)量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。

her2/erbb2是表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)家族的一員，其他3個(gè)成員分別為her1/erbb1、her3/erbb3、her4/erbb4，其中her2無可溶性的配體，因此又稱“孤兒受體”(orphansreceptor)。然而其他3個(gè)受體成員在形成異二聚體時(shí)都優(yōu)先選擇her2共同形成異二聚體。egfr家族是磷酸激酶受體，當(dāng)egf結(jié)合到細(xì)胞表面egfr時(shí)，使受體發(fā)生磷酸化，并與grb2結(jié)合，激活sos(促gtp釋放酶)，進(jìn)而激活ras通路，活化的erk進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)。

her2無可溶性的配體，但可與muc4相互作用。muc4在氣管、胰腺等組織的腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)，muc4的egf-likedomain可與her2結(jié)合，并活化her2。但在僅有muc4和her2時(shí)，它們作用可促進(jìn)cdk抑制劑p27kip1表達(dá)，使細(xì)胞周期處于停滯狀態(tài)。如果同時(shí)還存在神經(jīng)調(diào)節(jié)素neuregμlin，則可同時(shí)激活her3，進(jìn)而激活ras-erk途徑和pi3k-akt途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移。

her2基因突變，在框內(nèi)插入大量的20號外顯子，在1％～4％的非小細(xì)胞肺癌中，專門針對腺癌組織學(xué)類型，已經(jīng)被認(rèn)為是一種致癌驅(qū)動(dòng)改變。i期和ii期的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：阿法替尼、來那替尼和dacomitinib對這些分子亞型組有一些活性。

c-met基因：原癌基因c-met位于人類第7號染色體7q31上，編碼met酪氨酸激酶。正常的生理?xiàng)l件下，met酪氨酸激酶受體及其配體hgf(肝細(xì)胞生長因子)顯著影響并控制組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究顯示，met酪氨酸激酶在肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等組織中存在擴(kuò)增和過表達(dá)等現(xiàn)象。

c-met基因擴(kuò)增是tkis獲得性耐藥的次要因素。研究顯示met基因擴(kuò)增能激活erbb3/pi3k/akt信號途徑，引發(fā)對egfr激酶抑制劑的耐藥性。由于c-met基因擴(kuò)增和nsclc預(yù)后不良以及對表皮生長因子受體(egfr)抑制劑(如厄洛替尼和吉非替尼)耐藥相關(guān)，c-met受體酪氨酸激酶成為了nsclc治療中受關(guān)注的抗癌靶點(diǎn)。

akt1基因：akt1基因編碼絲蘇蛋白激酶，在pi3k相關(guān)的信號通路中起重要的作用，影響細(xì)胞的生存、增值和侵襲等。3個(gè)高度同源的蛋白akt1、akt2和akt3均是由三個(gè)功能域構(gòu)成：一個(gè)氨基酸pleckstrin同源性(ph)區(qū)域，一個(gè)中央的催化區(qū)域和一個(gè)羧基端具有疏水結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)區(qū)域。

pi3-激酶/akt途徑是人類腫瘤中最為活躍的細(xì)胞途徑之一，導(dǎo)致癌細(xì)胞的生存和增長，途徑中的許多成分是新藥研發(fā)的候選靶標(biāo)。akt1是該途徑的活性中心，在癌癥中是聯(lián)系上游突變調(diào)控蛋白和下游存活信號途徑蛋白的中間環(huán)節(jié)。

akt活性失調(diào)是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的遺傳缺陷，在激活狀態(tài)下，akt通過對大量底物的激酶活性執(zhí)行抗凋亡及細(xì)胞增殖功能。

乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)一種akt1基因復(fù)發(fā)突變(recurringmutation)，這種突變akt1基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，并幫助癌細(xì)胞抵抗某些治療劑。

c-kit基因：c-kit基因位于人染色體4q12-13，屬于原癌基因，其產(chǎn)物是ⅲ型酪氨酸激酶。c-kit原癌基因表達(dá)產(chǎn)物c-kit受體與其配體細(xì)胞因子結(jié)合后，可激發(fā)酪氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，對腫瘤的增殖、惡性演進(jìn)及凋亡等方面都有重要作用。

格列衛(wèi)(glivec)是一種酪氨酸激酶抑制劑，經(jīng)fda批準(zhǔn)可用于治療c-kit陽性、不能手術(shù)切除和/或轉(zhuǎn)移性的惡性gist，其臨床療效令人振奮。其作用機(jī)理在于藥物結(jié)合于kit蛋白胞漿內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)的atp結(jié)合位點(diǎn)，阻斷磷酸基團(tuán)由atp向底物酪氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，從而抑制細(xì)胞增殖并恢復(fù)細(xì)胞凋亡程序。

臨床研究表明gist中c-kit基因的突變情況與格列衛(wèi)分子靶向治療的療效相關(guān)：存在11號外顯子突變患者的療效最好，存在9號外顯子突變的患者療效次之，而野生型gist的療效最差。另外，對于9號外顯子突變的患者，提高用藥劑量可顯著提高療效。格列衛(wèi)耐藥相關(guān)突變主要發(fā)生在17號外顯子d816v突變。檢測c-kit基因突變對于指導(dǎo)gist患者的合理用藥，具有重要的參考價(jià)值。

pdgfra基因：pdgfra基因編碼一種單鏈跨膜糖蛋白，能將有絲分裂等信號傳遞入細(xì)胞核，引起細(xì)胞分裂和增殖，該基因突變可導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生。

pdgfra基因d842v突變是導(dǎo)致gist患者格列衛(wèi)原發(fā)耐藥的原因，pdgfra突變與c-kit基因突變是相互獨(dú)立的。因此，檢測腫瘤患者pdgfra基因突變情況可用于判斷格列衛(wèi)治療能否有效。

pdgfra在胃腸道間質(zhì)瘤(gist)中表達(dá)概率較高，因此常作為gist診斷中的參考指標(biāo)。

alk-eml4基因：alk-eml4融合基因(間變性淋巴瘤激酶-棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4)2007年由soda等在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)1。alk-eml4融合基因的重排發(fā)生在2號染色體短臂上的2區(qū)1帶和2區(qū)3帶，其alk部分均包括開始于第20外顯子的編碼細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的基因片段，eml4部分則包括長短不一的編碼蛋白n端部分的基因片段，共有9種具有生物性功能的融合基因，其表達(dá)產(chǎn)物為一種嵌合酪氨酸激酶，可持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移。

alk-eml4融合的突變基因，在全球的非小細(xì)胞肺癌中約占5％(超過7萬人/年)，其中東亞患者約占3～13％。alk-eml4在基因水平下融合，此融合與alk抑制劑藥物的反應(yīng)性有關(guān)，原因可能是因?yàn)檫@種突變改變了alk基因的atp結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)，提高了alk對alk抑制劑(克唑替尼)的結(jié)合能力。據(jù)2010年臨床研究報(bào)道alk抑制劑能使alk-eml4的非小細(xì)胞肺癌患者中57％腫瘤體積縮小，87％停止疾病發(fā)展。

克唑替尼(crizotinib)是第一個(gè)針對alk基因融合的alk抑制劑靶向藥物，2011年由美國fda批準(zhǔn)用于治療alk陽性的非小細(xì)胞肺癌患者。

ros1基因：ros1(c-rosoncogene1receptortyrosinekinase,c-ros,原癌基因1酪氨酸激酶)，在腫瘤患者中，染色體的重排式ros1活化的首要機(jī)制，而原癌基因形式的ros1被看做是激活與惡性腫瘤形成相關(guān)的下游信號通路物質(zhì)，ros1基因可能參與了肺癌發(fā)生的過程。

crizotinib治療ros1陽性nsclc患者的初步療效，研究結(jié)果提示：與alk-eml4陽性相似，ros1重排是crizotinib治療的又一個(gè)潛在靶點(diǎn)。攜帶ros1融合基因患者對alk抑制劑crizotinib高度敏感，緩解率高達(dá)到57.1％。

肺癌患者ros1基因重排陽性率約0.8-1.7％。ros1基因重排的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌能夠從克唑替尼治療中獲益，檢測ros1重排是篩選克唑替尼合適患者的重要前提。

ret基因：ret原癌基因1985年takahashi等首先在轉(zhuǎn)化小鼠的nih3t3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了ret原癌基因。它位于10ql1.2，含有21個(gè)外顯子，全長60kb，與其他染色體易位或10號染色體發(fā)生倒置可使ret活化。ret原癌基因編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體ret蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化。

ret基因的致癌作用ret基因的致瘤作用最初發(fā)現(xiàn)于甲狀腺乳頭狀癌，不同形式的染色體異位和插入導(dǎo)致ptc/ret融合基因的形成，被認(rèn)為是乳頭狀甲狀腺癌的驅(qū)動(dòng)突變。除基因重排外，ret基因突變與甲狀腺髓樣癌(mtc)相關(guān)。一項(xiàng)ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，多靶點(diǎn)激酶抑制劑凡德他尼(vandetanib)治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性家族遺傳性mtc，疾病控制率為73％，且不良反應(yīng)可控；另一項(xiàng)關(guān)于mtc的ⅲ期臨床試驗(yàn)(zeta)結(jié)果顯示，截止至2009年7月31日，凡德他尼組較安慰劑組無進(jìn)展生存期(pfs)明顯延長，疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低54％。因此，凡德他尼被美國食品藥品管理局(fda)批準(zhǔn)用于不宜手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性mtc的治療。此外文獻(xiàn)報(bào)道在胰腺癌、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)ret激活。

kif5b—ret融合基因kif5b和ret分別位于lopl1.22和10ql1.21，相距10.6mb，通過臂間倒位后相融合，形成kif5b-ret融合基因。kif5b和ret雙螺旋dna的融合斷點(diǎn)并非完全一致，目前已發(fā)現(xiàn)kif5b-ret至少存在7種變體。kif5b-ret融合蛋白由卷曲螺旋域和蛋白激酶域組成，卷曲螺旋域誘導(dǎo)融合激酶二聚體化，從而使蛋白酪氨酸激酶域自身磷酸化而激活。

ret抑制劑的抗腫瘤作用凡德他尼是vegfr-2、egfr和ret信號通路的抑制劑。在表達(dá)kif5b—ret而無野生型或其他ret融合基因的人肺癌細(xì)胞中，ret激酶活化環(huán)上的tyr905在無血清刺激的情況下磷酸化，提示與kif5b的融合使ret激酶異?；罨?。這種磷酸化作用可被凡德他尼所抑制。由kif5b-ret誘導(dǎo)的nih3t3纖維母細(xì)胞的生長可被凡德他尼所抑制，而由k-ras突變導(dǎo)致的細(xì)胞生長則不能被其所抑制。此外，還在該融合基因陽性的肺腺癌標(biāo)本中檢測到kifsb-ret蛋白在tyrg05的磷酸化。

由上述各靶點(diǎn)信息可知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、多信號通路激活的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程。近年的腫瘤基因研究發(fā)現(xiàn)，每個(gè)腫瘤均可通過靶標(biāo)檢測明確其驅(qū)動(dòng)變異基因，從而針對性實(shí)施治療。靶向藥物作用于與癌癥發(fā)生、腫瘤生長所必需的特定分子靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長增殖的信號傳導(dǎo)通路殺滅癌細(xì)胞，阻止其進(jìn)展，具有針對性強(qiáng)，毒副作用低等特點(diǎn)。多項(xiàng)臨床研究表明，單一檢測某項(xiàng)靶標(biāo)對患者接受治療的指導(dǎo)意義存在明顯局限，通過多通路多靶標(biāo)并行檢測獲得每位患者腫瘤的全面基因信息，才能為患者制定出針對這些驅(qū)動(dòng)基因的最佳藥物組合。本試劑盒基于腫瘤組織樣本，通過高通量測序的方法，檢測腫瘤靶向藥物相關(guān)的多基因突變進(jìn)行快速的變異檢測。

現(xiàn)有的腫瘤基因檢測主要采用熒光定量pcr法，檢測通量低，對于多基因多靶點(diǎn)檢測時(shí)，費(fèi)用高及樣本量需求大，導(dǎo)致臨床收費(fèi)高及樣本量不足。而目前行業(yè)公認(rèn)的基因突變檢測金標(biāo)準(zhǔn)是sanger測序法，這類技術(shù)操作復(fù)雜，通量較低，靈敏度低，具有一定的漏檢風(fēng)險(xiǎn)，難以滿足大量腫瘤患者的檢測需求。因此，發(fā)展一種準(zhǔn)確率高、通量大、安全的腫瘤多基因檢測方法，是對現(xiàn)有腫瘤個(gè)體化診療的有效補(bǔ)充和完善。

高通量測序(high-throughputsequencing)又名下一代測序(nextgenerationsequencing，ngs)，能夠?qū)崿F(xiàn)一次并行對幾十萬到幾百萬條目標(biāo)核酸分子進(jìn)行序列測定，具有高輸出量與高解析度的特性，不僅提供了豐富的序列變異信息，而且使得測序的費(fèi)用和時(shí)間大大縮短，迅速獲得認(rèn)可。在癌癥多通路多靶標(biāo)研究中發(fā)揮顯著作用，凸顯出這一全新技術(shù)手段的臨床重要性。多項(xiàng)創(chuàng)新型臨床研究(如lung-map1、cruk、winconsortium和nci-match等)表明基于ngs平臺的多通路多靶標(biāo)檢測可成為多種治療方案的伴隨診斷方法。但現(xiàn)有技術(shù)仍未出現(xiàn)理想的用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供基于上述構(gòu)建方法的試劑盒。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法，覆蓋人類基因egfr、k-ras、b-raf、pik3ca、n-ras、c-met、akt1、her2、c-kit、pdgfra、alk-eml4、ros1和ret上的總共389種體細(xì)胞突變，具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因egfr、k-ras、b-raf、pik3ca、n-ras、c-met、akt1、her2、c-kit和pdgfra設(shè)計(jì)第一基本擴(kuò)增引物組，該第一基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該第一基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃；

(2)針對目的基因alk-eml4、ros1和ret的融合突變設(shè)計(jì)第二基本擴(kuò)增引物組，該第二基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該若干對第一基本擴(kuò)增引物的tm值相差不超過1℃；

(3)設(shè)計(jì)對應(yīng)第一基本擴(kuò)增引物組的第一不對稱連接探針組、對應(yīng)第二基本擴(kuò)增引物組的第二不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，第一不對稱連接探針組含有多對不同的第一不對稱連接探針，第二不對稱連接探針組含有多對不同的第二不對稱連接探針，每對第一不對稱連接探針和每對第二不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補(bǔ)序列、一與所述通用引物互補(bǔ)配對的擴(kuò)增序列和一與上述2～5個(gè)t相對應(yīng)的粘性末端識別序列，同時(shí)各正向探針和反向探針均具有相應(yīng)的標(biāo)簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的tm值相差不超過1℃；

(4)將模板、上述第一基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第一pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；將第一擴(kuò)增產(chǎn)物、第一不對稱連接探針組、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得第一文庫產(chǎn)物；

(5)將模板、上述第二基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第二pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第二擴(kuò)增引物；將第二擴(kuò)增產(chǎn)物、第二不對稱連接探針組、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得第二文庫產(chǎn)物；

(6)將第一文庫產(chǎn)物和第二文庫產(chǎn)物組成所述用于高通量測序的腫瘤基因變異文庫；

上述ringcap-taq酶由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述目的基因egfr具體為egfr基因的18、19、20和21外顯子，目的基因k-ras具體為k-ras基因外顯子2、3和4，目的基因b-raf具體為b-raf基因的外顯子15，目的基因pik3ca具體為pik3ca基因的外顯子9和20，目的基因n-ras具體為n-ras基因的2、3和4，目的基因c-met具體為c-met基因的外顯子2、14、16和19，目的基因akt1具體為akt1基因的外顯子3，目的基因her2具體為her2基因的外顯子19、20和21,，目的基因c-kit具體為c-kit基因的外顯子9、11、13和17，目的基因pdgfra具體為pdgfra基因的外顯子16和18。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一擴(kuò)增引物組包括e-18-f、e-18-r、e-19-f、e-19-r、e-20-f、e-20-r、e-21-f、e-21-r、k-2-f、k-2-r、k-3-f、k-3-r、k-4-f、k-4-r、b-15-f、b-15-r、pi-9-f、pi-9-r、pi-20-f、pi-20-r、n-2-f、n-2-r、n-3-f、n-3-r、n-4-f、n-4-r、he-19-f、he-19-r、he-20-f、he-20-r、he-21-f、he-21-r、met-2-f、met-2-r、met-14-f、met-14-r、met-16-f、met-16-r、met-19-f、met-19-r、akt-3-f、akt-3-r、kit-9-f、kit-9-r、kit-11-f、kit-11-r、kit-13-f、kit-13-r、kit-17-f、kit-17-r、pdg-16-f、pdg-16-r、pdg-18-f和pdg-18-r，其序列依次如seqid01～seqid54所示。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第一不對稱連接探針組包括ion-bc1-ff、ion-bc1-fr、ion-bc1-rf、ion-bc1-rr、ion-bc2-ff、ion-bc2-fr、ion-bc2-rf、ion-bc2-rr、ion-bc3-ff、ion-bc3-fr、ion-bc3-rf、ion-bc3-rr、ion-bc4-ff、ion-bc4-fr、ion-bc4-rf、ion-bc4-rr、ion-bc5-ff、ion-bc5-fr、ion-bc5-rf、ion-bc5-rr、ion-bc6-ff、ion-bc6-fr、ion-bc6-rf、ion-bc6-rr、ion-bc7-ff、ion-bc7-fr、ion-bc7-rf、ion-bc7-rr、ion-bc8-ff、ion-bc8-fr、ion-bc8-rf和ion-bc8-rr，其序列依次如seqid114～seqid145所示，上述bc1～8分別表示八種不同的標(biāo)簽序列。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二擴(kuò)增引物組包括ea-1-f、ea-1-r、ea-2-f、ea-2-r、ea-3-f、ea-4-f、ea-5-f、ea-5-r、ea-6-f、ea-7-f、ea-9-f、ea-10-f、rs-1-f、rs-1-r、rs-2-r、rs-3-f、rs-4-f、rs-4-r、rs-5-r、rs-6-f、rs-7-f、rs-8-f、rs-9-f、rs-10-f、rs-11-f、rs-12-f、rs-12-r、rs-13-f、rs-13-r、rs-14-f、rs-14-r、rs-15-f、rs-15-r、rt-1-f、rt-1-r、rt-2-f、rt-2-r、rt-4-f、rt-4-r、rt-5-f、rt-17-r、rt-18-f、rt-18-r、rt-19-f、rt-19-r、rt-20-f、rt-20-r、rt-21-f、rt-21-r、alk-3p-f、alk-3p-r、alk-5p-f、alk-5p-r、ret-3p-f、ret-3p-r、ret-5p-f、ret-5p-r、ros1-3p-f和ros1-3p-r，其序列依次如seqid55～seqid113所示。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第二不對稱連接探針組包括ion-bc9-ff、ion-bc9-fr、ion-bc9-rf、ion-bc9-rr、ion-bc10-ff、ion-bc10-fr、ion-bc10-rf、ion-bc10-rr、ion-bc11-ff、ion-bc11-fr、ion-bc11-rf、ion-bc11-rr、ion-bc12-ff、ion-bc12-fr、ion-bc12-rf、ion-bc12-rr、ion-bc13-ff、ion-bc13-fr、ion-bc13-rf、ion-bc13-rr、ion-bc14-ff、ion-bc14-fr、ion-bc14-rf、ion-bc14-rr、ion-bc15-ff、ion-bc15-fr、ion-bc15-rf、ion-bc15-rr、ion-bc16-ff、ion-bc16-fr、ion-bc16-rf和ion-bc16-rr，其序列依次如seqid146～seqid177所示，上述bc9～16分別表示八種不同的標(biāo)簽序列。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述通用引物為c-primer，其序列如seqid178所示。

一種基于上述構(gòu)建方法的試劑盒，包括：

一dna富集反應(yīng)組件，包括第一擴(kuò)增引物組；

一rna富集反應(yīng)組件，包括第二擴(kuò)增引物組；

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成；

一barcode1～8反應(yīng)組件，包括第一不對稱連接探針組和通用引物，具體包括連在一起的八個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的第一不對稱連接探針和通用引物；

一barcode9～16反應(yīng)組件，包括第二不對稱連接探針組和通用引物，每個(gè)反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的第二不對稱連接探針和通用引物；

一陽性質(zhì)控品；

和一陰性質(zhì)控品。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的構(gòu)建方法針對多個(gè)靶序列進(jìn)行單管，快速完成文庫的構(gòu)建，整個(gè)文庫構(gòu)建過程僅需要2～3小時(shí)，手動(dòng)時(shí)間僅僅需要15～30分鐘即可，結(jié)合高通量測序平臺可以十分有效的解決目前對于臨床上腫瘤、遺傳病等疾病中在少量的臨床樣本基礎(chǔ)上需要對體細(xì)胞多基因、多靶點(diǎn)檢測這一難點(diǎn)，且成本低廉。

2、本發(fā)明的構(gòu)建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)文庫構(gòu)建進(jìn)行核酸序列的檢測的應(yīng)用，該核酸檢測可應(yīng)用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺。

3、本發(fā)明的構(gòu)建方法對于來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自血漿的樣品所獲得的短片段dna依然適用，基于其的檢測方法依然具有與新鮮組織樣品dna同樣的擴(kuò)增和檢測能力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實(shí)施例構(gòu)建的核酸文庫進(jìn)行高通量測序總數(shù)據(jù)圖。

圖2為本發(fā)明的實(shí)施例檢測腫瘤13個(gè)基因突變的檢測均一性結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明的實(shí)施例檢測腫瘤13個(gè)基因突變的檢測突變結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。

下述實(shí)施例中的hotstar-taq酶、t4dna連接酶、dna末端修飾酶、ringcapbuffer、mgcl2和dntps均購自中國大連寶生物公司。

實(shí)施例1

一種用于高通量測序檢測的腫瘤基因變異文庫的構(gòu)建方法，覆蓋人類基因egfr、k-ras、b-raf、pik3ca、n-ras、c-met、akt1、her2、c-kit、pdgfra、alk-eml4、ros1和ret上的總共389種體細(xì)胞突變，該389種體細(xì)胞突變的信息如下表：

具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因egfr、k-ras、b-raf、pik3ca、n-ras、c-met、akt1、her2、c-kit和pdgfra設(shè)計(jì)第一基本擴(kuò)增引物組，該第一基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該第一基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃；具體的，所述目的基因egfr具體為egfr基因的18、19、20和21外顯子，目的基因k-ras具體為k-ras基因外顯子2、3和4，目的基因b-raf具體為b-raf基因的外顯子15，目的基因pik3ca具體為pik3ca基因的外顯子9和20，目的基因n-ras具體為n-ras基因的2、3和4，目的基因c-met具體為c-met基因的外顯子2、14、16和19，目的基因akt1具體為akt1基因的外顯子3，目的基因her2具體為her2基因的外顯子19、20和21,，目的基因c-kit具體為c-kit基因的外顯子9、11、13和17，目的基因pdgfra具體為pdgfra基因的外顯子16和18；所述第一擴(kuò)增引物組包括e-18-f、e-18-r、e-19-f、e-19-r、e-20-f、e-20-r、e-21-f、e-21-r、k-2-f、k-2-r、k-3-f、k-3-r、k-4-f、k-4-r、b-15-f、b-15-r、pi-9-f、pi-9-r、pi-20-f、pi-20-r、n-2-f、n-2-r、n-3-f、n-3-r、n-4-f、n-4-r、he-19-f、he-19-r、he-20-f、he-20-r、he-21-f、he-21-r、met-2-f、met-2-r、met-14-f、met-14-r、met-16-f、met-16-r、met-19-f、met-19-r、akt-3-f、akt-3-r、kit-9-f、kit-9-r、kit-11-f、kit-11-r、kit-13-f、kit-13-r、kit-17-f、kit-17-r、pdg-16-f、pdg-16-r、pdg-18-f和pdg-18-r，其序列依次如seqid01～seqid54所示；

(2)針對目的基因alk-eml4、ros1和ret的融合突變設(shè)計(jì)第二基本擴(kuò)增引物組，該第二基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該若干對第一基本擴(kuò)增引物的tm值相差不超過1℃；所述第二擴(kuò)增引物組包括ea-1-f、ea-1-r、ea-2-f、ea-2-r、ea-3-f、ea-4-f、ea-5-f、ea-5-r、ea-6-f、ea-7-f、ea-9-f、ea-10-f、rs-1-f、rs-1-r、rs-2-r、rs-3-f、rs-4-f、rs-4-r、rs-5-r、rs-6-f、rs-7-f、rs-8-f、rs-9-f、rs-10-f、rs-11-f、rs-12-f、rs-12-r、rs-13-f、rs-13-r、rs-14-f、rs-14-r、rs-15-f、rs-15-r、rt-1-f、rt-1-r、rt-2-f、rt-2-r、rt-4-f、rt-4-r、rt-5-f、rt-17-r、rt-18-f、rt-18-r、rt-19-f、rt-19-r、rt-20-f、rt-20-r、rt-21-f、rt-21-r、alk-3p-f、alk-3p-r、alk-5p-f、alk-5p-r、ret-3p-f、ret-3p-r、ret-5p-f、ret-5p-r、ros1-3p-f和ros1-3p-r，其序列依次如seqid55～seqid113所示；

(3)設(shè)計(jì)對應(yīng)第一基本擴(kuò)增引物組的第一不對稱連接探針組、對應(yīng)第二基本擴(kuò)增引物組的第二不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，第一不對稱連接探針組含有多對不同的第一不對稱連接探針，第二不對稱連接探針組含有多對不同的第二不對稱連接探針，每對第一不對稱連接探針和每對第二不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補(bǔ)序列、一與所述通用引物互補(bǔ)配對的擴(kuò)增序列和一與上述2～5個(gè)t相對應(yīng)的粘性末端識別序列，同時(shí)各正向探針和反向探針均具有相應(yīng)的標(biāo)簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的tm值相差不超過1℃；具體的，所述第一不對稱連接探針組包括ion-bc1-ff、ion-bc1-fr、ion-bc1-rf、ion-bc1-rr、ion-bc2-ff、ion-bc2-fr、ion-bc2-rf、ion-bc2-rr、ion-bc3-ff、ion-bc3-fr、ion-bc3-rf、ion-bc3-rr、ion-bc4-ff、ion-bc4-fr、ion-bc4-rf、ion-bc4-rr、ion-bc5-ff、ion-bc5-fr、ion-bc5-rf、ion-bc5-rr、ion-bc6-ff、ion-bc6-fr、ion-bc6-rf、ion-bc6-rr、ion-bc7-ff、ion-bc7-fr、ion-bc7-rf、ion-bc7-rr、ion-bc8-ff、ion-bc8-fr、ion-bc8-rf和ion-bc8-rr，其序列依次如seqid114～seqid145所示，上述bc1～8分別表示八種不同的標(biāo)簽序列；所述第二不對稱連接探針組包括ion-bc9-ff、ion-bc9-fr、ion-bc9-rf、ion-bc9-rr、ion-bc10-ff、ion-bc10-fr、ion-bc10-rf、ion-bc10-rr、ion-bc11-ff、ion-bc11-fr、ion-bc11-rf、ion-bc11-rr、ion-bc12-ff、ion-bc12-fr、ion-bc12-rf、ion-bc12-rr、ion-bc13-ff、ion-bc13-fr、ion-bc13-rf、ion-bc13-rr、ion-bc14-ff、ion-bc14-fr、ion-bc14-rf、ion-bc14-rr、ion-bc15-ff、ion-bc15-fr、ion-bc15-rf、ion-bc15-rr、ion-bc16-ff、ion-bc16-fr、ion-bc16-rf和ion-bc16-rr，其序列依次如seqid146～seqid177所示，上述bc9～16分別表示八種不同的標(biāo)簽序列；所述通用引物為c-primer，其序列如seqid178所示；

(4)將模板、上述第一基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第一pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；將第一擴(kuò)增產(chǎn)物、第一不對稱連接探針組、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得第一文庫產(chǎn)物；

(5)將模板、上述第二基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第二pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第二擴(kuò)增引物；將第二擴(kuò)增產(chǎn)物、第二不對稱連接探針組、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得第二文庫產(chǎn)物；

(6)第一文庫產(chǎn)物和第二文庫產(chǎn)物組成所述用于高通量測序的腫瘤基因變異文庫；

(7)通過iontorrentpgm高通量測序儀進(jìn)行文庫上機(jī)檢測，獲得目標(biāo)序列信息，通過vc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)信息比對分析，得到樣本突變狀態(tài)。

上述模板所來自的樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標(biāo)本。

新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用qiagen公司組織dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。

蠟塊樣品切成5～8μm切片，取5片，或已經(jīng)制成的5～8μm切片取5片，經(jīng)過二甲苯脫蠟后，使用qiagen公司石蠟包埋dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。

全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用qiagen公司組織dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200μl，血漿、血清以及胸腔積液不少于800μl。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph8.0)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用tris-hcl溶液(10mmol/l,ph8.0)調(diào)整dna濃度到2ng/μl作為pcr擴(kuò)增的模板。

基于上述構(gòu)建方法的試劑盒包括：

一dna富集反應(yīng)組件，包括第一擴(kuò)增引物組，每人份的dna富集反應(yīng)組件的配方如下表所示：

一rna富集反應(yīng)組件，包括第二擴(kuò)增引物組，每人份rna富集反應(yīng)組件的配方如下表所示：

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成，比例為0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，優(yōu)選比例1:1:1；

一barcode1～8反應(yīng)組件，包括第一不對稱連接探針組和通用引物，具體包括連在一起的八個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的第一不對稱連接探針和通用引物，每人份的barcode1～8反應(yīng)組件的配方如下表所示：

一barcode9～16反應(yīng)組件，包括第二不對稱連接探針組和通用引物，具體包括連在一起的八個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的第二不對稱連接探針和通用引物，每人份的barcode9～16反應(yīng)組件的配方如下表所示：

一陰性質(zhì)控品，具體為無核酸水；

和一陽性質(zhì)控品，具體由20個(gè)陽性突變質(zhì)粒序列野生型基因組dna混合而成，濃度為2ng/μl。

將上述試劑盒用前述的構(gòu)建方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以egfr基因熱點(diǎn)突變外顯子19上的e746_a750del(2235_2249del15)突變?yōu)槔齺矸治霰景l(fā)明的檢測腫瘤13個(gè)基因突變的方法。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系4株，分別為h1650(帶e746_a750del突變)、h460(egfr基因野生型)、293t(egfr基因野生型)、sw480(egfr基因野生型)；100份健康的全血樣品、50份臨床肺癌樣品(包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血)：

所述第一和第二pcr反應(yīng)體系的模板量(待測樣品、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品)為5μl，其余組分如下表所示：

pcr擴(kuò)增程序設(shè)置如下表：

上述第一和第二pcr反應(yīng)體系所得的第一和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的純化具體如下：

取出agencourtampurexp試劑置于室溫，同時(shí)要打散磁珠，同時(shí)配制新鮮的70％的乙醇(230μl無水乙醇+100μl無核酸酶水)，必須是新鮮配制的。

第一輪純化步驟

(1)向每個(gè)樣品反應(yīng)管25μl產(chǎn)物中分別加入12.5μl(0.5x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育5分鐘，一直到溶液澄清；

(4)小心地吸取上清液置于新的離心管，不要擾動(dòng)磁珠；注意：上清液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物不要丟棄。

第二輪純化步驟

(1)向上述吸取的上清液25μl中加入30μl(1.2x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育3分鐘，一直到溶液澄清，小心地吸走并棄掉上清，不要擾動(dòng)磁珠；注意：磁珠上含有擴(kuò)增文庫不要丟棄。

(4)加入150μl新鮮配制的70％乙醇，沒過磁珠樣品即可，離心管正反方向移動(dòng)5次，然后磁力架上孵育2分鐘，去除上清液；

(5)重復(fù)上述步驟4，進(jìn)行第二次洗滌；

(6)確保乙醇液滴已全部從孔中吸走，將板放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。

(7)將樣品管從磁力架上拿開，在每孔中加入25μlte(ph8.0)緩沖液充分浸潤磁珠。充分振蕩混勻，快速離心將液體收集到管底。(也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻)；注意：上清液含有擴(kuò)增文庫不要丟棄。

將樣品管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物。取出20μl上清。

上述純化所得的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物制備第一文庫產(chǎn)物和第二文庫產(chǎn)物的pcr反應(yīng)的模板量為5μl，ringcap-taq酶(具體由hotstar-taq酶、t4dna連接酶和dna末端修飾酶以1:1:1的比例組成，物料濃度：5u/μl/每種)的加入量為0.25μl，其余組分如下表所示：

pcr擴(kuò)增程序設(shè)置如下表：

pcr產(chǎn)物分別按純化第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物方法進(jìn)行純化，制得第一文庫產(chǎn)物和第二文庫產(chǎn)物。

上述第一文庫產(chǎn)物和第二文庫產(chǎn)物的檢測具體如下：

采用iontorrentpgm半導(dǎo)體測序儀(thermofisher公司)一次可以檢測16份樣品(包括陰陽性對照)。

如圖1所示，本發(fā)明的構(gòu)建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)文庫構(gòu)建進(jìn)行核酸序列的檢測的應(yīng)用，該核酸檢測可應(yīng)用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺。且如圖2和圖3所示，本發(fā)明的構(gòu)建方法對于來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自血漿的樣品所獲得的短片段dna依然適用，基于其的檢測方法依然具有與新鮮組織樣品dna同樣的擴(kuò)增和檢測能力。

前述100份全血樣品以及細(xì)胞系h460(egfr基因野生型)、293t(egfr基因野生型)、sw480(egfr基因野生型)，突變細(xì)胞系h1650(帶e746_a750del突變)經(jīng)本發(fā)明的體系檢測，只有h1650細(xì)胞系dna有檢測到突變序列，其他樣品無突變序列，進(jìn)一步證明了該方法的特異性。

靈敏度分析：將突變型細(xì)胞系h1650dna從100ng/μl連續(xù)10倍梯度稀釋，分別為100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl。每次反應(yīng)加入5μldna。結(jié)果表明本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法的靈敏度高，50拷貝dna基因組即可檢出。

選擇性能力分析：固定每次pcr反應(yīng)總dna用量，100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。先將突變細(xì)胞系(h1650)的dna和野生型細(xì)胞系(h460)dna濃度都調(diào)整為20ng/μl和2ng/μl。這樣每個(gè)反應(yīng)加5μl模板即為100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。按下述方法配置模擬dna模板。

a:50％即為100ng/μl突變細(xì)胞dna。

b:30％取a液60μl后混入40μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

c:20％取a液40μl后混入60μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

d:15％取b液50μl后混入50μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

e:10％取c液50μl后混入50μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

f:5％取e液50μl后混入50μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

g:1％取f液20μl后混入80μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

h:0.5％取g液50μl后混入50μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

i:0.1％取h液20μl后混入80μl100ng/μlh460細(xì)胞dna，震蕩混均。

結(jié)果表明本發(fā)明的腫瘤13個(gè)基因方法的選擇性檢測能力為在10ng總dna中可以檢出50拷貝的突變dna，檢測能力為1％。

重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)反應(yīng)分別加入突變細(xì)胞系h1650dna10ng、1ng和100pg，重復(fù)10次進(jìn)行高通量測序檢測，10次結(jié)果一致，符合率100％。

收集手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本，全血和血漿標(biāo)本以及胸水標(biāo)本共50例，其中29組織樣品，5例血漿，6例胸水，10例全血。其中男性28例，女性22例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。

對于13個(gè)腫瘤基因，本發(fā)明檢測結(jié)果與dna測序結(jié)果完全一致：50例樣品中有16例發(fā)生egfr基因突變，3例發(fā)生kras基因突變，2例發(fā)生braf基因突變，3例發(fā)生alk-eml4基因突變，26例正常肺組織對照均為野生型，具體如下表：

以上可知本發(fā)明腫瘤多基因文庫構(gòu)建反應(yīng)就可以同時(shí)檢測13個(gè)腫瘤基因389個(gè)突變位點(diǎn)，文庫構(gòu)建時(shí)間僅需3小時(shí)，因此本發(fā)明省時(shí)省力，準(zhǔn)確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，高通量測序法和傳統(tǒng)測序方法結(jié)果的符合率為100％，高通量測序法靈敏度和選擇性檢測能力高于傳統(tǒng)測序方法，10ng樣品dna中含1％的突變dna即可檢出。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。