一種硫唑嘌呤的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及硫唑嘌呤的新用途，具體涉及硫唑嘌呤的藥物組 合物及其醫(yī)藥用途。
【背景技術】
[0002] 硫唑嘌呤是6-巰基嘌呤的咪唑衍生物，為具有免疫抑制作用的抗代謝劑?？僧a生 烷基化作用阻斷SH組群，抑制核酸的生物合成，防止細胞的增生，并可引起DNA的損害。動物 實驗證實，本藥可使胸腺、脾內DNA、RNA減少，影響DNA、RNA，以及蛋白質的合成，主要抑制T-淋巴細胞而影響免疫，所以可抑制遲發(fā)過敏反應，器官移植的排斥反應。本藥的療效需于治 療數(shù)周或數(shù)月后才出現(xiàn)。在上消化道內吸收較佳。
[0003] 神經炎癥是中樞神經系統(tǒng)的固有免疫應答反應，主要由腦內免疫細胞小J3父質細胞 和星形膠質細胞介導。當腦組織受到各種病理因素的損傷或刺激時，小膠質細胞和星型膠 質細胞可由靜息態(tài)轉變?yōu)榧せ顟B(tài)，吞噬清除變性的神經組織碎片，因此適度激活的膠質細 胞對神經元起保護作用。但是在病理條件下，膠質細胞會被過度激活，引起神經炎癥，釋放 大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素（IL)、谷氨酸鹽和一氧化氮(N0)等，導致 神經元功能喪失、變性甚至死亡，進而引起神經元的損傷。盡管神經炎癥的機制還沒有完全 研究清楚，但是普遍認為神經炎癥與多種神經系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病密切相關。
[0004] 迄今為止，尚未見硫唑嘌呤及其藥物組合物與神經炎癥的相關性報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種硫唑嘌呤的藥物組合物，該藥物組合物中含有硫唑嘌 呤和一種結構新穎的天然產物，硫唑嘌呤和該天然產物可以協(xié)同治療神經炎癥。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
[0007] 一種具有下述結構式的化合物（I)，

[0009] -種硫唑嘌呤的藥物組合物，包括硫唑嘌呤、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0010] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0011]進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0012]上述化合物⑴的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將黃連的干燥根莖粉碎，用75 ~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的 正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁 醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個柱體積，收 集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正 相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組 分；⑷步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓 濃縮得到化合物(I)。
[0013]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0014]進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0015]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制備治療神經炎癥的藥物中的應用。
[0017] 上述硫唑嘌呤的藥物組合物在制備治療神經炎癥的藥物中的應用。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0019] 本發(fā)明提供的硫唑嘌呤的藥物組合物中含有硫唑嘌呤和一種從黃連的干燥根莖 中分離得到的結構新穎的天然產物，硫唑嘌呤和該天然產物單獨作用時，對神經炎癥具有 治療作用;二者聯(lián)合作用時，對神經炎癥的治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療神經炎癥 的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。
[0021 ]實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0022]分離方法：（a)將黃連的干燥根莖(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5L X 3次）， 合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的 正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙 醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、 25:1(10個柱體積）和15:1(8個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟 (c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(10個柱體積）、15:1(8個柱體積） 和1:1(6個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16 個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (190mg，HPLC歸一化純度大于98% )。 [0023] 結構確證:黃色粉末;HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 523.3021，結合核磁特征可得 分子式為C32H42O6，不飽和度為12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)SH( ppm，DMS〇-d6，600MHz):H-1 (6.07， d，J=12.8Hz)，H-2(5.89，d，J = 12.9Hz)，H-5(2.15，d，J = 3.1Hz)，H-6(1.22，m)，H-6(1.64， m)，H-7(1.13，m)，H-7(1.41，m)，H-8(1.77，dd，J=10.5,6.6Hz)，H-ll(1.50，m)，H-ll(2.11， m)，H-12(1.64，m)，H-12(1.71，m)，H-15(1.28，m)，H-15(2.33，dd，J=14.9,7.2Hz)，H-16 (5.33，m)，H-16b(2.06，s)，H-17(2.27，m)，H-18(l.ll，s)，H-19(0.88，d，J=4.4Hz)，H-19 (0.98，d，J = 4.4Hz)，H-20(2.50，m)，H-21(0.88，d，J = 6.9Hz)，H-24a(5.89，s)，H-24a (6.03，s)，H-25(2.99，m)，H-26(1.05，d，J = 6.8Hz)，H-27(l.ll，d，J = 6.6Hz)，H-28(5.27， (1，了=12.8泡），11-28(5.45，(1，了=12.8抱），11-30(0.97,8) ;核磁共振碳譜數(shù)據(jù)知(卯111，0130-d6，150MHz):150.5(CH，l-C)，119.6(CH，2-C)，160.2(C，3-C)，159.2(C，4-C)，44.7(CH，5-C)，23.2(CH2,6-C)，21.6(CH2,7-C)，45.9(CH，8-C)，30.2(C，9-C)，37.0(C，10-C)，28.5(CH2， 11-C)，32.6(CH2，12-C)，45.2(C，13-C)，47.3(C，14-C)，46.9(CH2，15-C)，77.1(CH，16-C)， 170.2(C，16a-C)，22.3(CH 3，16b-C)，50.5(CH，17-C)，18.5(CH3，18-C)，32.5(CH2，19-C)， 32.5(CH，20-C)，12.1(CH 3,21-C)，203.7(C，22-C)，195.2(C，23-C)，154.3(C，24-C)，120.3 (CH 2,24a-C)，29.0(CH，25-C)，22.1(CH3,26-C)，21.9(CH3,27-C)，99.8(CH 2,28-C)，20.2 (CH3，30-C)。IR譜圖中的1715cnf1與1694cnf 1吸收帶表明該化合物結構中存在羰基與共輒羰 基;UV譜圖中的最大吸收207nm與245nm說明結構中存在共輒雙鍵。氫譜核磁數(shù)據(jù)表明該結 構中不飽和度是由三個C-C雙鍵結構，四個羰基結構以及五個環(huán)狀骨架組成。碳譜核磁數(shù)據(jù) 與DEPT譜數(shù)據(jù)表明該化合物結構中含有32個碳，其中有六個甲基，八個亞甲基(兩個烯屬亞 甲基），八個次甲基(兩個烯屬次甲基，一個連氧次甲基），十個叔碳(兩個酯羰基，兩個酮羰 基，兩個烯屬季碳）。一組高場亞甲基質子信號S H0.88與0.98及它們的偶合常數(shù)4.4Hz，表明 該化合物含有環(huán)丙烷結構。HMBC譜中H3-16b(S H2.06)與C-16a(Sc170.2)，以及H-16(Sh5.33) 與C-16a的相關性表明C-16(S c77.1)位連有一個乙酰氧基。此外，HMBC譜中H2-28(SH5.27和 5.45)與04(知159.2)和(：-5(知44.7)的相關性表明(：-28為環(huán)外雙鍵。綜合氫譜、碳譜、腿8〇 譜和N0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構型 進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0024]該化合物化學式及碳原子編號如下：

d
[0026] 實施例2:藥理作用 [0027] 1、材料與方法
[0028] 1.1藥品與試劑
[0029] 硫唑嘌呤購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1。 DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；新生胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司；脂多糖 (LPS)購自默克密理博公司；小鼠TNF-a、IL-6ELISA檢測試劑盒為欣博盛生物科技有限公司 廣品。
[0030] 1.2儀器
[0031] MQX-200酶標儀（Bio-Te K. Instruments Inc.，USA) ;Sigma 2K15離心機；垂直電 泳儀和電轉移系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；LAS4000化學發(fā)光系統(tǒng)（GE公司，USA);FV1000MPE Multiphoton Laser Scanning Microscope(奧林巴斯，日本）〇
[0032] 1.3細胞培養(yǎng)
[0033] 小膠質細胞系BV2細胞由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心提供，于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37°C、5%⑶ 2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每隔2~3天傳代，所 用消化液為〇. 25 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA。
[0034] 1.4N0 測定
[0035]采用Griess法測定亞硝酸鹽(N02-)的含量來反映N0的濃度。取對數(shù)生長期的BV2細 胞，經消化計數(shù)后，以5 X 103個/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入硫唑嘌呤、化合物（I)、 硫唑嘌呤與化合物（I)組合物預孵育lh，然后加入LPS(lmg ? I/1)繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集上清100 yL，加入等體積Griess試劑（以蒸餾水配制0.1 %奈乙二胺，以5 %磷酸配制1 %對氨基苯磺 酸，兩者在臨用前以1:1等體積混合），室溫靜置l〇min，蒸餾水調零，在酶標儀上測定540nm 處吸光度值，同時以硝酸鈉為標準品，測定吸光度值，計算亞硝酸鹽的含量。
[0036] 1 ? 5酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)
[0037] BV2細胞以5.0 X104個/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后，加入硫唑嘌呤、化合物 (I)、硫唑嘌呤與化合物（I)組合物預孵育lh，加入LPS(lmg ? I/1)繼續(xù)培養(yǎng)，分別在3h和12h 后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，測定細胞上清液中TNF-a和IL-6的 含量。
[0038] 1.6統(tǒng)計學分析
[0039]用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組結果以x±s表示，各組間的差異比較采用 單因素方差分析(〇ne-wayAN0VA)。
[0040] 2、實驗結果
[0041 ] 2 ? 1對LPS刺激的BV2細胞產生N0的影響
[0042] N0作為細胞內重要的信使分子，參與神經遞質的釋放和重攝取、神經傳導和突觸 可塑性等重要的生理過程，但是過量產生的N0也可以引起嚴重的神經毒性。表1結果顯示， LPS( lmg ? I/1)與BV2細胞共同孵育24h可激活小膠質細胞，使N0產生大量增加，而硫唑嘌呤、 化合物（I)、硫唑嘌呤與化合物（I)組合物可明顯抑制N0的產生(P〈0.05，P〈0.05，P〈0.01)， 表明硫唑嘌呤與化合物（I)組合物對LPS刺激BV2細胞產生的炎癥因子具有顯著的抑制作 用，且這種抑制作用強于硫唑嘌呤或化合物（I)單獨的抑制作用。
[0043] 表1對LPS刺激的BV2細胞產生N0的影響

[0045] 2 ? 2對LPS刺激BV2細胞產生TNF-a、IL-6的影響
[0046] 激活的小膠質細胞釋放過量的炎癥因子是造成神經元損傷、導致神經功能障礙的 主要因素。TNF-a和IL-6是兩類常見的炎癥因子，故本實驗中進一步檢測了藥物對LPS刺激 BV2細胞產生的TNF-a和IL-6的影響。結果如表2所示，對照組BV2細胞中TNF-a、IL-6的分泌 量很低，與對照組相比，LPS(lmg ? I/1)刺激BV2細胞后，可使二者的釋放量明顯升高，提示 LPS激活了小膠質細胞，產生炎癥反應。同模型組相比，給藥硫唑嘌呤、化合物（I)、硫唑嘌呤 與化合物（I)組合物可明顯降低二者的釋放(P〈〇. 05，P〈0.05，P〈0.01)，表明硫唑嘌呤與化 合物（I)組合物對LPS刺激BV2細胞產生的炎癥因子具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用 強于硫唑嘌呤或化合物（I)單獨應用時的抑制作用。
[0047] 表2對LPS刺激BV2細胞產生TNF-a、IL_6的影響

[0049] 以上結果表明，硫唑嘌呤、化合物（I)單獨應用時均具有較好的抑制神經炎癥的作 用，聯(lián)合使用對神經炎癥的抑制作用進一步增強，可以開發(fā)成抑制神經炎癥的藥物。
[0050] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物α)，'02. -種硫唑嘌呤的藥物組合物，其特征在于:包括硫唑嘌呤、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權利要求2所述的硫唑嘌呤的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權利要求2所述的硫唑嘌呤的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將黃 連的干燥根莖粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中 70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85 :1、45:1、25 :1和15:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比 為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16 個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療神經炎癥的藥物中的應用。10.權利要求2~4任一所述的硫唑嘌呤的藥物組合物在制備治療神經炎癥的藥物中的 應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種硫唑嘌呤的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的硫唑嘌呤的藥物組合物中含有硫唑嘌呤和一種從黃連的干燥根莖中分離得到的結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，硫唑嘌呤、化合物(Ⅰ)單獨應用時均具有較好的抑制神經炎癥的作用，聯(lián)合使用對神經炎癥的抑制作用進一步增強，可以開發(fā)成抑制神經炎癥的藥物，與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【IPC分類】A61P29/00, A61P25/00, A61K31/52, A61K31/585, C07J73/00
【公開號】CN105713065
【申請?zhí)枴緾N201610260396
【發(fā)明人】何淑瓊
【申請人】何淑瓊