發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明提供了生物合成3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa的方法，其使用具有β-酮硫解酶活性的多肽，并且使用具有coa轉(zhuǎn)移酶、硫酯酶、脫羧酶，或仲醇脫氫酶活性的一種或多種多肽，或表達一種或多種此類酶的重組宿主細胞將3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa酶促轉(zhuǎn)化為1,3-丁二醇(1,3-bdo；也稱為1,3-丁烯乙二醇)。

發(fā)明背景

1,3-bdo用于各種目的，其作為生產(chǎn)各種化合物如香料、信息素、殺蟲劑、青霉烯類和碳青霉烯類的起始單元。1,3-bdo通常可通過以下化學(xué)生產(chǎn)(1)使用膦-氨基膦(phosphine-aminophosphine)的釕絡(luò)合物氫化4-羥基-2-丁酮和(2)在溴離子存在下從蘇氨酸通過亞硝基脫氨(nitrousdeamination)，然后進行酯化和還原。然而，該方法通常是能量密集型的、涉及多個步驟、消耗大量的溶劑和/或生產(chǎn)大量副產(chǎn)物，從而限制了大規(guī)模生產(chǎn)。特別是，這些方法對于經(jīng)由1,3-bdo的催化脫水大規(guī)模生產(chǎn)1,3-丁二烯是不經(jīng)濟的。因此，很清楚需要可持續(xù)和有效生產(chǎn)1,3-bdo的方法。

發(fā)明概述

本文件至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即可以構(gòu)建生物化學(xué)途徑，特別是使用β-酮硫解酶以產(chǎn)生3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa，其可以使用例如coa轉(zhuǎn)移酶或硫酯酶、脫羧酶和/或仲醇脫氫酶在一個或多個酶促步驟中轉(zhuǎn)化為1,3-bdo。

一方面，本文件特征在于生產(chǎn)3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa的方法。所述方法包括使用歸類于ec.2.3.1.-(例如ec2.3.1.16或ec2.3.1.174)下的β-酮硫解酶將3-羥基丙?；鵦oa酶促轉(zhuǎn)化為3-氧代-5-羥基戊酰基coa。所述β-酮硫解酶可以與seqidnos:1或2所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述方法還可以包括使用硫酯酶或coa轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶,和仲醇脫氫酶將3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa酶促轉(zhuǎn)化為1,3-丁二醇。所述硫酯酶可以歸類于ec3.1.2.-下。例如，所述硫酯酶可以與seqidno:3所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述coa轉(zhuǎn)移酶可以歸類于ec2.8.3.-下。例如，所述coa轉(zhuǎn)移酶可以與seqidnos:5、6，或12所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述脫羧酶可以歸類于ec4.1.1.4下。例如，所述脫羧酶可以與seqidnos:8或10所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述仲醇脫氫酶可以歸類于ec1.1.1.b3、ec1.1.1.b4，或ec1.1.1.80下。所述仲醇脫氫酶可以與seqidnos:4、9，或11所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。

本文件特征還在于生物合成1,3-丁二醇的方法。所述方法包括使用歸類于ec.2.3.1.-下的β-酮硫解酶從3-羥基丙?；鵦oa酶促合成3-氧代-5-羥基戊酰基coa，然后將3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa酶促轉(zhuǎn)化為1,3-丁二醇。所述β-酮硫解酶可以與seqidnos:1或2所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性?？梢允褂胏oa轉(zhuǎn)移酶或硫酯酶將3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa轉(zhuǎn)化為3-氧代-5羥基戊酸，可以使用脫羧酶將3-氧代-5羥基戊酸轉(zhuǎn)化為4-羥基丁烷-2-酮，以及可以使用仲醇脫氫酶將4-羥基丁烷-2-酮轉(zhuǎn)化為1,3-丁二醇。所述硫酯酶可以與seqidno:3所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述仲醇脫氫酶可以與seqidnos:4、9，或11所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述脫羧酶可以與seqidnos:8或10所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述coa轉(zhuǎn)移酶可以與seqidnos:5或6所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。

在任何的方法中，可以從丙二酰coa酶促生產(chǎn)3-羥基丙?；鵦oa。例如，可以使用丙二酰coa還原酶、3-羥基丙酸脫氫酶、coa轉(zhuǎn)移酶,和3-羥基丙?；鵦oa合酶的一種或多種，從丙二酰coa酶促生產(chǎn)3-羥基丙?；鵦oa。

任何方法都可以在重組宿主中進行。在一些實施方案中，使用陶瓷膜保留宿主。在一些實施方案中，培養(yǎng)策略使得實現(xiàn)需氧、微需氧，或厭氧培養(yǎng)條件。在一些實施方案中，培養(yǎng)策略包括限制營養(yǎng)物，如限制氮、磷酸鹽或氧。

在任何方法中，發(fā)酵補料的主要碳源可以源自生物原料。例如，生物原料可以是或可以源自單糖、二糖、木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃縮酒糟(condenseddistillers'solubles)，或城市廢物。

在任何方法中，發(fā)酵補料的主要碳源可以源自非生物原料。例如，非生物原料可以是或可以源自天然氣、合成氣、co2/h2、甲醇、乙醇、苯甲酸鹽、非揮發(fā)性殘留物(nvr)或來自環(huán)己烷氧化過程的堿洗液(causticwash)廢物流、或?qū)Ρ蕉姿?異酞酸混合物廢物流。

在一些實施方案中，通過在選擇的環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)來改善宿主對高濃度1,3-bdo的耐受。

本文件特征還在于重組宿主，其包含至少一種編碼以下的外源核酸：(i)β-酮硫解酶，(ii)仲醇脫氫酶，以及(iii)脫羧酶,和(iv)硫酯酶或coa轉(zhuǎn)移酶一種或多種，所述宿主生產(chǎn)1,3-丁二醇。所述宿主還可以包括一種或多種以下的外源酶：(v)丙二酰coa還原酶,(vi)3-羥基丙酸脫氫酶,和(vii)丙酸coa-轉(zhuǎn)移酶或3-羥基丙?；鵦oa合酶。所述β-酮硫解酶可以與seqidnos:1或2所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述仲醇脫氫酶可以與seqidnos:4、9，或11所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述脫羧酶可以與seqidnos:8或10所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述硫酯酶可以與seqidno:3所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。所述coa轉(zhuǎn)移酶可以與seqidnos:5、6、7或12所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。

在一些實施方案中，減弱或增強宿主的內(nèi)源生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以(1)確保丙二酰coa或乙酰coa的胞內(nèi)利用度，(2)創(chuàng)建nadh或nadph不平衡，其可以僅經(jīng)由一種或多種導(dǎo)致1,3-bdo生產(chǎn)的構(gòu)件塊的形成來平衡，(3)阻止導(dǎo)致1,3-bdo生產(chǎn)的中心代謝物，中心前體的降解和(4)確保從細胞的有效流出。

任何重組宿主可以是原核生物，如選自下組的原核生物：埃希氏菌屬(escherichia)；梭菌屬(clostridia)；棒狀桿菌屬(corynebacteria)；貪銅菌屬(cupriavidus)；假單胞菌屬(pseudomonas)；代爾夫特菌屬(delftia)；芽孢桿菌屬(bacillus)；乳桿菌屬(lactobacillus)；乳球菌屬(lactococcus)；和紅球菌屬(rhodococcus)。例如，所述原核生物可以選自下組：大腸桿菌(escherichiacoli)、楊氏梭菌(clostridiumljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌(clostridiumautoethanogenum)、克魯佛梭菌(clostridiumkluyveri)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)、鉤蟲貪銅菌(cupriavidusnecator)、耐金屬貪銅菌(cupriavidusmetallidurans)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、食油假單胞菌(pseudomonasoleavorans)、食酸代爾夫特菌(delftiaacidovorans)、枯草芽胞桿菌(bacillussubtillis)、德氏乳桿菌(lactobacillusdelbrueckii)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，和馬紅球菌(rhodococcusequi)。此類原核生物還可以是用于構(gòu)建本文中所述的能夠生產(chǎn)1,3-bdo的重組宿主細胞的基因的來源。

任何重組宿主可以是真核生物，如選自下組的真核生物：曲霉屬(aspergillus)、酵母屬(saccharomyces)、畢赤氏酵屬(pichia)、耶羅維亞酵母屬(yarrowia)、伊薩酵母屬(issatchenkia)、德巴利酵母屬(debaryomyces)、arxula屬和克魯維酵母菌屬(kluyveromyces)。例如，所述真核生物可以選自下組：黑曲霉(aspergillusniger)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、解脂耶羅維亞酵母(yarrowialipolytica)、東方伊薩酵母(issathenkiaorientalis)、漢遜德巴利酵母(debaryomyceshansenii)、arxulaadenoinivorans和乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)。此類真核生物還可以是用于構(gòu)建本文中所述的能夠生產(chǎn)1,3-bdo的重組宿主細胞的基因的來源。

本文所述的任何重組宿主還可以包括一種或多種弱化的下述酶：聚羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)合酶、乙酰coa硫酯酶、形成乙酸的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脫氫酶、menaquinol-富馬酸氧化還原酶、形成乙醇的醇脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、丙酮酸脫羧酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、消耗nad(p)h的轉(zhuǎn)氫酶、nad(p)h特異性谷氨酸脫氫酶，和利用nadh/nadph的谷氨酸脫氫酶。

本文所述的任何重組宿主還可以過表達一種或多種編碼以下的基因：乙酰coa合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；轉(zhuǎn)酮醇酶；嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)氫酶；甘油醛-3p-脫氫酶；蘋果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；葡萄糖脫氫酶；果糖1,6二磷酸酶；l-丙氨酸脫氫酶；l-谷氨酸脫氫酶；甲酸脫氫酶；和/或l-谷氨酰胺合成酶。

本文所述的許多酶催化可逆反應(yīng)，并且感興趣的反應(yīng)可以是所述反應(yīng)的逆向物(reverse)。示于圖1的示意途徑說明了每種中間體的感興趣的反應(yīng)。

一方面，本文件特征在于生產(chǎn)生物衍生的四碳化合物的方法。所述用于生產(chǎn)生物衍生的四碳化合物的方法可以包括在條件下培養(yǎng)或生長本文所述的宿主達足夠的時間段以生產(chǎn)生物衍生的四碳化合物，其中，任選地，所述生物衍生的四碳化合物是1,3-丁二醇。

一方面，文件特征在于組合物，其包含如本文所述的生物衍生的四碳化合物以及除生物衍生的四碳化合物以外的化合物，其中所述生物衍生的四碳化合物是1,3-丁二醇。例如，所述生物衍生的四碳化合物是宿主細胞或生物體的細胞部分。

文件特征還在于生物基聚合物，其包含生物衍生的1,3-丁二醇。

文件特征還在于生物基樹脂，其包含生物衍生的1,3-丁二醇，以及獲得自模制生物基樹脂的模制的產(chǎn)品。

另一方面，本文件特征在于生產(chǎn)生物基聚合物的方法，其包括在聚合物生產(chǎn)反應(yīng)中將生物衍生的1,3-丁二醇與其自身或另一化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

另一方面，本文件特征在于生產(chǎn)生物基樹脂的方法，其包括在樹脂生產(chǎn)反應(yīng)中將生物衍生的1,3-丁二醇與其自身或另一化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

本文還描述的是包含具有β-酮硫解酶活性的多肽的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，其中所述具有β-酮硫解酶活性的多肽將3-羥基丙酰基coa酶促轉(zhuǎn)化為3-氧代-5-羥基戊酰基coa。

所述生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)還可以包括具有硫酯酶活性的多肽或具有coa轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，具有脫羧酶活性的多肽，和具有仲醇脫氫酶活性的多肽。一方面，生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)是非天然存在的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，其包含至少一種圖1的底物、至少一種外源核酸，其編碼具有至少一種圖1的酶活性的多肽，以及至少一種圖1的產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一方面，生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)是非天然存在的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，其包含3-羥基丙?；鵦oa、編碼歸類于ec.2.3.1下的具有β-酮硫解酶活性的多肽的外源核酸，以及3-羥基丙?；鵦oa。

本發(fā)明的一方面，描述的是用于形成至少一種圖1的化合物的步驟。本發(fā)明的一方面，描述的是用于形成至少一種圖1化合物的手段。

在一些方面中，本公開提供了核酸構(gòu)建體和/或表達載體，其包含編碼具有β-酮硫解酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接于一種或多種指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的異源控制序列，并且其中所述具有β-酮硫解酶活性的的多肽選自下組：(a)與seqidnos:1或2所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；編碼具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接于一種或多種指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的異源控制序列，并且其中所述具有硫酯酶活性的多肽選自下組：(a)與seqidnos:3或14所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；編碼具有coa轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接于一種或多種指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的異源控制序列，并且其中所述具有coa轉(zhuǎn)移酶活性的多肽選自下組：(a)與seqidnos:5、6、7、12或13所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；編碼具有脫羧酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接于一種或多種指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的異源控制序列，并且其中所述具有脫羧酶活性的多肽選自下組：(a)與seqidnos:8或10所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；或者編碼具有仲醇脫氫酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接于一種或多種指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的異源控制序列，并且其中所述具有仲醇脫氫酶活性的多肽選自下組：(a)與seqidnos:4、9或11所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。本公開還提供了包含如上描述的核酸構(gòu)建體或表達載體的組合物。

除非另外定義，本申請使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。雖然與本申請所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料也可用于實踐本發(fā)明，下文描述適合的方法和材料。本文提及的所有公開、專利申請、專利和其它參考文獻通過提述完整并入本文。在沖突的情況下，以本說明書包括定義為準。另外，材料、方法，和實施例僅為說明性的而不意圖限制。

本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)列于下面的附圖和描述中。根據(jù)說明書和附圖，并根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將顯而易見。根據(jù)專利法的標準實踐，詞語“包含”在權(quán)利要求中可被“基本上由…組成”或者“由…組成”替代。

附圖簡述

圖1是使用丙二酰coa作為中心代謝物導(dǎo)致1,3-bdo的示例性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖2含有以下的氨基酸序列：由bktb編碼的鉤蟲貪銅菌β-酮硫解酶(參見genbank登錄號aac38322.1,seqidno:1)、由paaj編碼的大腸桿菌β-酮硫解酶(參見genbank登錄號aac74479.1,seqidno:2)、由tesb編碼的大腸桿菌硫酯酶(參見genbank登錄號aaa24665.1,seqidno:3)、藤黃微球菌(micrococcusluteus)醇脫氫酶(參見genbank登錄號add83022.1,seqidno:4)；由atoad編碼的大腸桿菌coa轉(zhuǎn)移酶(參見genbank登錄號aac75282.1和aac75281.1,seqidno:5)、由pcaij編碼的惡臭假單胞菌coa轉(zhuǎn)移酶(參見genbank登錄號aca73091.1和aca73090.1,seqidno:6)、由ydif編碼的丙酸羧菌(clostridiumpropionicum)coa轉(zhuǎn)移酶(參見genbank登錄號cab77207.1,seqidno:7)、紫色色桿菌(chromobacteriumviolaceum)乙酰乙酸脫羧酶(參見genbank登錄號aaq61181.1,seqidno:8)、短乳桿菌(lactobacillusbrevis)醇脫氫酶(參見genbank登錄號cad66648.1,seqidno:9)、丙酮丁醇羧菌(clostridiumacetobutylicum)乙酰乙酸脫羧酶(genbank登錄號aaa63761.1,seqidno:10)、拜氏羧菌(clostridiumbeijerinckii)仲醇脫氫酶(參見genbank登錄號aaa23199.2,seqidno:11)、由pc編碼的鉤蟲貪銅菌coa轉(zhuǎn)移酶t(參見genbank登錄號caj93797.1,seqidno:12)、由abft編碼的氨基丁酸羧菌(clostridiumaminobutyricum)coa轉(zhuǎn)移酶(參見genbank登錄號cab60036.2,seqidno:13)，和由ycia編碼的大腸桿菌硫酯酶(參見genbank登錄號aab60068.1,seqidno:14)。

發(fā)明詳述

一般而言，本文件描述了用于生產(chǎn)3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa的酶、非天然途徑、培養(yǎng)策略、原料、宿主微生物和宿主生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的弱化(attenuation)，所述3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa可以在一個或多個酶促步驟中被轉(zhuǎn)化為1,3-bdo。如本文所用，術(shù)語“中心前體”用于表示本文所示的任何代謝途徑中的任何代謝物，其導(dǎo)致1,3-bdo的合成。術(shù)語“中心代謝物”在本文中用于表示在所有微生物中產(chǎn)生以支持生長的代謝物。

本文所述的宿主微生物可以包括內(nèi)源途徑，其可以被操作使得可以產(chǎn)生1,3-bdo。在內(nèi)源途徑中，宿主微生物天然表達催化該途徑內(nèi)的反應(yīng)的所有酶。含有工程化途徑的宿主微生物不天然表達催化該途徑內(nèi)的反應(yīng)的所有酶，但是已經(jīng)被工程化使得該途徑內(nèi)的所有酶在宿主中表達。

術(shù)語“外源”指不像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)一樣存在于特定類型細胞中(并且不能從特定類型細胞獲得)的核酸或由所述核酸編碼的蛋白質(zhì)。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即視為對于宿主而言外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸序列的核酸亞序列或片段，只要該核酸作為整體不存在于自然界中。例如，表達載體內(nèi)含有基因組dna序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦導(dǎo)入宿主中對于宿主細胞而言是外源的，因為該核酸分子作為整體(基因組dna加載體dna)不存在于自然界中。如此，作為整體不存在于自然界中的任何載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或皰疹病毒)視為非天然存在的核酸。由此得出結(jié)論通過pcr或限制內(nèi)切性核酸酶處理產(chǎn)生的基因組dna片段以及cdna也視為非天然存在的核酸，因為它們作為未見于自然界的分開的分子存在。由此還得出結(jié)論任何以未見于自然界中的排布含有啟動子序列和多肽編碼序列(例如cdna或基因組dna)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是對于特定宿主微生物而言外源的。例如，從酵母x的細胞分離的完整染色體一旦將該染色體導(dǎo)入酵母y的細胞中就酵母y細胞而言是外源核酸。

比較而言，如本文中提及核酸(例如基因)(或蛋白質(zhì))和宿主使用的，術(shù)語“內(nèi)源的”指就像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)一樣的確存在于特定宿主中(并且可以從特定宿主獲得)的核酸(或蛋白質(zhì))。此外，“內(nèi)源表達”核酸(或蛋白質(zhì))的細胞就像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)的相同特定類型的宿主那樣表達所述核酸(或蛋白質(zhì))。此外，“內(nèi)源產(chǎn)生”核酸、蛋白質(zhì)、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時相同特定類型的宿主那樣生成所述核酸、蛋白質(zhì)、或化合物。

例如，取決于宿主和宿主所生產(chǎn)的化合物，除了β-酮硫解酶以外，可以表達一種或多種以下酶：仲醇脫氫酶、硫酯酶、coa轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶、丙二酰coa還原酶、3-羥基丙酸脫氫酶，或3-羥基丙?；鵦oa合酶。

例如，重組宿主可以包括外源β-酮硫解酶并生產(chǎn)可以轉(zhuǎn)化為1,3-bdo的3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa。

例如，重組宿主可以包括外源β-酮硫解酶、外源硫酯酶或外源coa轉(zhuǎn)移酶、外源脫羧酶，和外源仲醇脫氫酶，并生產(chǎn)1,3-bdo。例如，重組宿主可以包括外源β-酮硫解酶、外源硫酯酶、外源脫羧酶，和外源仲醇脫氫酶，并生產(chǎn)1,3-bdo。例如，重組宿主可以包括外源β-酮硫解酶、外源coa轉(zhuǎn)移酶、外源脫羧酶，和外源仲醇脫氫酶，并生產(chǎn)1,3-bdo。任何此類宿主還可以包括丙二酰coa還原酶、3-羥基丙酸脫氫酶和3-羥基丙?；鵦oa合酶的一種或多種(例如丙二酰coa還原酶、3-羥基丙酸脫氫酶和3-羥基丙?；鵦oa合酶的每一個)。

在工程化的途徑內(nèi)，酶可以來自單一來源，即來自一個物種或?qū)伲蚩蓙碜远鄠€來源，即不同的物種或?qū)?。已?jīng)從各種生物體鑒定了編碼本文所述酶的核酸，并且可容易地在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(如genbank或embl)中獲得。

如本文所用，提及特定的酶(例如β-酮硫解酶)意指具有特定酶活性的多肽(例如具有β-酮硫解酶活性的多肽)。

本文描述的可用于生產(chǎn)1,3-bdo的任何酶可與相應(yīng)的野生型酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。應(yīng)當(dāng)理解，可以基于成熟酶(例如，除去任何信號序列)或基于未成熟酶(例如，包括任何信號序列)確定序列同一性。還應(yīng)當(dāng)理解，起始甲硫氨酸殘基可以存在于或可以不存在于本文所述的任何酶序列上。

例如，本文所述的β-酮硫解酶可以與鉤蟲貪銅菌β-酮硫解酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aac38322.1,seqidno:1)或與大腸桿菌β-酮硫解酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aac74479.1,seqidno:2)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。參見圖2。

例如，本文所述的硫酯酶可以與由tesb編碼的大腸桿菌硫酯酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aaa24665.1,seqidno:3)或由ycia編碼的大腸桿菌硫酯酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aab60068.1,seqidno:14)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。參見圖2。

例如，本文所述的醇脫氫酶可以與藤黃微球菌仲醇脫氫酶(genbank登錄號add83022.1；seqidno:4)的氨基酸序列、短乳桿菌醇脫氫酶(參見genbank登錄號cad66648.1,seqidno:9)的氨基酸序列或拜氏羧菌仲醇脫氫酶(參見genbank登錄號aaa23199.2,seqidno:11)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。參見圖2。

例如，本文所述的乙酰乙酸脫羧酶可以與紫色色桿菌乙酰乙酸脫羧酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aaq61181.1,seqidno:8)或丙酮丁醇羧菌乙酰乙酸脫羧酶的氨基酸序列(genbank登錄號aaa63761.1,seqidno:10)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。參見圖2。

例如，本文所述的coa轉(zhuǎn)移酶可以與由atoad編碼的大腸桿菌coa轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aac75282.1和aac75281.1,seqidno:5)、由pcaij編碼的惡臭假單胞菌coa轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號aca73091.1&aca73090.1,seqidno:6)、由ydif編碼的丙酸羧菌coa轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號cab77207.1,seqidno:7)、由pct編碼的鉤蟲貪銅菌coa轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號caj93797.1,seqidno:12)、由abft編碼的氨基丁酸羧菌coa轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(參見genbank登錄號cab60036.2,seqidno:13)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。

可以如下測定兩種氨基酸序列間的百分比同一性(同源性)。首先，使用來自含有blastp第2.0.14版的單機版blastz的blast2sequences(bl2seq)程序比對氨基酸序列。此單機版blastz可以獲自fish&richardson的網(wǎng)站(例如www.fr.com/blast/)或美國政府國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解釋如何使用bl2seq程序的用法說明可以參見伴隨blastz的自述文件。bl2seq使用blastp算法實施兩種氨基酸序列之間的比較。為了比較兩種氨基酸序列，如下設(shè)置bl2seq的選項：-i設(shè)置為含有要比較的第一氨基酸序列的文件(例如c:\seq1.txt)；-j設(shè)置為含有要比較的第二氨基酸序列的文件(例如c:\seq2.txt)；-p設(shè)置為blastp；-o設(shè)置為任何期望的文件名稱(例如c:\output.txt)；并且所有其它選項保持為其缺省設(shè)置。例如，可以使用以下命令來產(chǎn)生含有兩種氨基酸序列間的比較的輸出文件：c:\bl2seq–ic:\seq1.txt–jc:\seq2.txt–pblastp–oc:\output.txt。如果兩種比較序列共享同源性(同一性)，那么指定的輸出文件會呈現(xiàn)那些同源性區(qū)作為比對序列。如果兩種比較序列不共享同源性(同一性)，那么指定的輸出文件不會呈現(xiàn)比對序列?？梢詫怂嵝蛄凶裱嗨频囊?guī)程，只是使用blastn。

一旦比對，通過計算相同氨基酸殘基在這兩種序列中呈現(xiàn)的位置的數(shù)目確定匹配數(shù)目。通過用匹配數(shù)目除以全長多肽氨基酸序列的長度，接著將所得的數(shù)值乘以100來確定百分比同一性(同源性)。注意到百分比同一性(同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和78.19被向上四舍五入到78.2。還注意到長度值會總是整數(shù)。

應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，許多核酸可以編碼具有特定氨基酸序列的多肽。遺傳密碼的簡并性是本領(lǐng)域中公知的；即對于許多氨基酸，存在有超過一種充當(dāng)氨基酸密碼子的核苷酸三聯(lián)體。例如，可以修飾給定酶的編碼序列中的密碼子，從而獲得特定物種(例如細菌或真菌)中的最佳表達，這使用適合于所述物種的密碼子偏愛表進行。

也可以在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用的，術(shù)語“功能性片段”指具有相應(yīng)成熟、全長、野生型蛋白質(zhì)的活性的至少25％(例如至少30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；或甚至大于100％)的蛋白質(zhì)的肽片段。功能性片段一般但不總是可以由蛋白質(zhì)的連續(xù)區(qū)構(gòu)成，其中該區(qū)具有功能性活性。

此文件還提供了(i)本文件的方法中使用的酶的功能性變體和(ii)上文描述的功能性片段的功能性變體。相對于相應(yīng)的野生型序列，酶和功能性片段的功能性變體可以含有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般會具有不超過50(例如不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)處氨基酸取代(例如保守取代)。這適用于本文中描述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一種氨基酸取代具有相似特征的另一種。保守取代包括下列組內(nèi)的取代：纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸、和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸、半胱氨酸、和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用上文提及的極性、堿性或酸性組的一種成員被相同組的另一種成員的任何取代可以視為保守取代。比較而言，非保守取代是用一種氨基酸取代具有不同特征的另一種。

缺失變體可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個氨基酸的區(qū)段(兩個或更多個氨基酸)或非連續(xù)的單一氨基酸。添加(添加變體)包括融合蛋白，其含有：(a)本文中描述的任何酶或其片段；和(b)內(nèi)部或末端(c或n)無關(guān)或外源氨基酸序列。在此類融合蛋白的背景中，術(shù)語“外源氨基酸序列”指與(a)不同的氨基酸序列。外源序列可以是例如用于純化重組蛋白的序列(例如flag、多組氨酸(例如六組氨酸)、凝集素(ha)、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、或麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp))。外源序列也可以是可用作可檢測標志物的蛋白質(zhì)，例如螢光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(cat)。在一些實施方案中，融合蛋白含有來自另一種蛋白質(zhì)的信號序列。在某些宿主細胞(例如酵母宿主細胞)中，可以經(jīng)由使用外源信號序列提高靶蛋白的表達和/或分泌。在一些實施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引發(fā)免疫應(yīng)答以生成抗體的載體(例如klh)或er或高爾基體保留信號。外源序列可以是不同長度的，并且在一些情況中可以是比與外源序列附接的全長靶蛋白質(zhì)更長的序列。

工程化宿主可天然表達本文所述途徑的酶的無一(none)或一些(例如，一種或多種、兩種或多種、三種或多種、四種或多種、五種或多種，或六種或多種)。因此，工程化宿主內(nèi)的途徑可以包括所有外源性酶，或者可以包括內(nèi)源性和外源性酶兩者。工程化宿主的內(nèi)源基因也可以被破壞以防止不期望的代謝物的形成或防止通過作用于此類中間體的其他酶導(dǎo)致途徑中的中間體的損失。工程化宿主可以稱為重組宿主或重組宿主細胞。如本文所述，重組宿主可以包括編碼如下的一種或多種的核酸：如本文所述的β-酮硫解酶、仲醇脫氫酶、脫氫酶、脫羧酶、合酶、還原酶、硫酯酶，或coa轉(zhuǎn)移酶。

此外，可以使用本文所述的分離的酶，使用來自宿主微生物的裂解物(例如，細胞裂解物)作為酶的來源，或使用來自不同宿主微生物的多種裂解物作為酶的來源，體外進行1,3-bdo的生產(chǎn)。

本文中所述的途徑的反應(yīng)可以在一種或多種宿主菌株中進行，所述宿主菌株(a)天然表達一種或多種的相關(guān)酶，(b)經(jīng)遺傳工程化以表達一種或多種相關(guān)的酶，或(c)天然表達一種或多種相關(guān)的酶并經(jīng)遺傳工程化以表達一種或多種相關(guān)的酶?；蛘?，可以從上述類型的宿主細胞中提取相關(guān)的酶，并以純化或半純化形式使用。此外，此類提取物包括可用作相關(guān)酶來源的裂解物(例如細胞裂解物)。在由本文件所提供的方法中，所有步驟可以在宿主細胞中進行，所有步驟可以使用提取的酶進行，或者一些步驟可以在細胞中進行，而其它步驟可以使用提取的酶進行。

生成1,3-丁二醇的酶

如圖1所示，可以使用β-酮硫解酶、仲醇脫氫酶、硫酯酶、coa轉(zhuǎn)移酶，和脫羧酶從3-羥基丙?；鵦oa生產(chǎn)1,3-bdo。

在一些實施方案中，β-酮硫解酶可以歸類于ec2.3.1.16下，如bktb的基因產(chǎn)物，或者可以歸類于ec2.3.1.174下，如paaj的基因產(chǎn)物。由來自鉤蟲貪銅菌的bktb編碼的β-酮硫解酶接受乙酰coa和丙酰coa作為底物，形成coa活化的脂肪族骨架(參見例如haywoodetal.,femsmicrobiologyletters,1988,52:91-96；slateretal.,j.bacteriol.,1998,180(8):1979-1987)。類似地，來自鉤蟲貪銅菌的bktb接受末端羥基化的底物(如乙醇酸)，形成具有末端官能化的coa活化的脂肪族骨架(martinetal.,nat.commun.,2013,4,1414)。由來自大腸桿菌的paaj編碼的β-酮硫解酶接受琥珀酰coa和乙酰coa作為底物，形成具有末端官能化的coa活化的骨架(nogalesetal.,microbiology,2007,153,357-365)。合適的β-酮硫解酶可以與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:7或seqidno:13所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。參見圖2。

在一些實施方案中，使用歸類于ec3.1.2.-下的硫酯酶或者例如歸類于ec2.8.3.-(如ec2.8.3.6或ec2.8.3.8)下的coa轉(zhuǎn)移酶，如atoad或pcaij的基因產(chǎn)物來水解coa部分。例如，合適的coa轉(zhuǎn)移酶可以與seqidno:1、seqidno:5或seqidno:6所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。參見圖2。

硫酯酶可以是tesb的基因產(chǎn)物(cantuetal.,proteinscience,2010,19,1281–1295；zhuangetal.,biochemistry,2008,47(9):2789–2796；naggertetal.,j.biol.chem.,1991,266(17):11044–11050)。硫酯酶可以是ycia的基因產(chǎn)物(zhuangetal.,biochemistry,2008,47,2789–2796)，其接受3-酮脂酰coa底物(如乙酰乙酰coa)用于水解。例如，合適的硫酯酶可以與seqidno:3或seqidno.14所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。參見圖2。

可以使用例如歸類于ec4.1.1.4下的乙酰乙酸脫羧酶從3-氧代-5羥基戊酸去除羧基以生產(chǎn)4-羥基丁烷-2-酮。例如，合適的乙酰乙酸脫羧酶可以與seqidno:8或seqidno.10所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。該反應(yīng)也可以自動發(fā)生。

可以使用例如歸類于ec1.1.1.-如ec1.1.1.b3,ec1.1.1.b4,或ec1.1.1.80下的醇脫氫酶(例如仲醇脫氫酶)從4-羥基丁烷-2-酮生產(chǎn)1,3-丁二醇。例如，合適的仲醇脫氫酶可以與seqidno:4、seqidno:9或seqidno:11所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。參見圖2。

通向1,3-bdo的途徑

在一些實施方案中，如下從中心代謝物丙二酰coa合成1,3-bdo：通過丙二酰coa還原酶(例如歸類于ec1.2.1.75下)將丙二酰coa轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛；然后通過3-羥基丙酸脫氫酶(例如歸類于ec1.1.1.59下)將丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸；然后通過3-羥基丙?；鵦oa合酶(例如歸類于ec6.2.1.36下)或通過coa轉(zhuǎn)移酶(例如歸類于ec2.8.3.-下)如ydif的基因產(chǎn)物(例如seqidno:7)、pct的基因產(chǎn)物(例如seqidno:12)或abft的基因產(chǎn)物(參見genbank登錄號cab60036.2,seqidno:13)將3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙?；鵦oa；然后通過使用β-酮硫解酶(例如歸類于ec2.3.1.16或ec2.3.1.174下)如bktb或paaj的基因產(chǎn)物(例如seqidno:1或2)或由cab60036.2或cab77207.1編碼的(例如seqidno:7或13)將3-羥基丙?；鵦oa轉(zhuǎn)化為3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa；然后通過coa轉(zhuǎn)移酶(例如歸類于ec2.8.3.-下)如來自大腸桿菌的atoad的基因產(chǎn)物(例如seqidno:5)或來自惡臭假單胞菌的pcaij的基因產(chǎn)物(例如seqidno:6)，或者硫酯酶(例如歸類于ec3.1.2.-下)如testb的基因產(chǎn)物(例如seqidno:3)或ycia的基因產(chǎn)物(例如seqidno:14)將3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa轉(zhuǎn)化為3-氧代-5羥基戊酸；然后通過乙酰乙酸脫羧酶，例如歸類于ec4.1.1.4下(例如seqidno:8或seqidno:10)將3-氧代-5羥基戊酸轉(zhuǎn)化為4-羥基丁烷-2-酮；然后通過仲醇脫氫酶，例如歸類于ec1.1.1.b3、ec1.1.1.b4,或ec1.1.1.80下(例如seqidno:4、seqidno:9或seqidno:11)將4-羥基丁烷-2-酮轉(zhuǎn)化為1,3-bdo。參見圖1。

培養(yǎng)策略

在一些實施方案中，使用厭氧，需氧或微需氧培養(yǎng)條件在重組宿主中生物合成1,3-bdo。在一些實施方案中，培養(yǎng)策略需要營養(yǎng)限制，如氮，磷酸鹽或氧限制。

在一些實施方案中，可以采用使用例如纖維膜的細胞保留策略來實現(xiàn)并維持補料分批或連續(xù)發(fā)酵期間的高細胞密度。

在一些實施方案中，在1,3-bdo的合成中對發(fā)酵補料的主要碳源可以源自生物或非生物原料。

在一些實施方案中，生物原料可以是或可以源自單糖，二糖，木質(zhì)纖維素，半纖維素，纖維素，木質(zhì)素，乙酰丙酸和甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，農(nóng)業(yè)廢物，濃縮的酒糟可溶物(condenseddistillers'solubles)，或城市廢物。

已經(jīng)在幾種微生物(諸如大腸桿菌、鉤蟲貪銅菌、食油假單胞菌、惡臭假單胞菌和解脂耶羅維亞酵母)中證明了源自生物柴油生產(chǎn)的粗制甘油的有效分解代謝(lee等,appl.biochem.biotechnol.,2012,166:1801-1813；yang等,biotechnologyforbiofuels,2012,5:13；meijnen等,appl.microbiol.biotechnol.,2011,90:885-893)。

已經(jīng)在幾種生物體(諸如鉤蟲貪銅菌和惡臭假單胞菌)中在經(jīng)由前體丙?；?coa合成3-羥基戊酸中證明了木質(zhì)纖維素衍生的乙酰丙酸的有效分解代謝(jaremkoandyu,journalofbiotechnology,2011,155,2011,293-298；martinandprather,journalofbiotechnology,2009,139,61-67)。

已經(jīng)在幾種微生物(諸如惡臭假單胞菌、鉤蟲貪銅菌)中證明了木質(zhì)素衍生的芳香族化合物諸如苯甲酸類似物的有效分解代謝(bugg等,currentopinioninbiotechnology,2011,22,394-400；pérez-pantoja等,femsmicrobiol.rev.,2008,32,736-794)。

已經(jīng)在幾種微生物(包括解脂耶羅維亞酵母)中證明了農(nóng)業(yè)廢物(諸如橄欖磨坊廢水)的有效利用(papanikolaouetal.,bioresour.technol.,2008,99(7):2419-2428)。

已經(jīng)對幾種微生物(諸如大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和德氏乳桿菌和乳酸乳球菌)證明了可發(fā)酵糖類(諸如源自纖維素、半纖維素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它農(nóng)業(yè)來源的單糖和二糖)的有效利用(參見例如hermannetal,j.biotechnol.,2003,104:155-172；weeetal.,foodtechnol.biotechnol.,2006,44(2):163-172；ohashietal.,j.bioscienceandbioengineering,1999,87(5):647-654)。

已經(jīng)對鉤蟲貪銅菌證明了源自多種農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維素來源的糠醛的有效利用(lietal.,biodegradation,2011,22:1215-1225)。

在一些實施方案中，非生物給料可以是或者可以源自天然氣、合成氣、co2/h2、甲醇、乙醇、苯甲酸酯、非揮發(fā)性殘留物(nvr)或來自環(huán)己烷氧化過程的堿洗液(causticwash)廢物流，或?qū)Ρ蕉姿?間苯二甲酸混合物廢物流。

已經(jīng)對甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母證明了甲醇的有效分解代謝。

已經(jīng)對克魯佛梭菌證明了乙醇的有效分解代謝(seedorfetal.,proc.natl.acad.sci.usa,2008,105(6)2128-2133)。

已經(jīng)對鉤蟲貪銅菌證明了co2和h2(其可以源自天然氣和其它化學(xué)和石油化學(xué)來源)的有效分解代謝(prybylskietal.,energy,sustainabilityandsociety,2012,2:11)。

已經(jīng)對多種微生物(諸如楊氏梭菌和自產(chǎn)乙醇梭菌)證明了合成氣的有效分解代謝(etal.,appliedandenvironmentalmicrobiology,2011,77(15):5467–5475)。

已經(jīng)對多種微生物(諸如食酸代爾夫特菌和鉤蟲貪銅菌)證明了來自環(huán)己烷過程的非揮發(fā)性殘留物廢物流的有效分解代謝(ramsayetal.,appliedandenvironmentalmicrobiology,1986,52(1):152–156)。

在一些實施方案中，宿主微生物可以是原核生物。例如，原核生物可以是來自以下的細菌：埃希氏菌屬如大腸桿菌；梭菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；棒狀桿菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；假單胞菌屬如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；代爾夫特菌屬(delftia)如食酸代爾夫特菌；芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者乳球菌屬如乳酸乳球菌。此類原核生物也可以是構(gòu)建能夠生成1,3-bdo的本文中描述的重組宿主細胞的基因來源。

在一些實施方案中，宿主微生物可以是真核生物。例如，真核生物可以是絲狀真菌，例如來自曲霉屬(aspergillus)如黑曲霉的。另外，真核生物可以是酵母，例如來自酵母屬(saccharomyces)如釀酒酵母；來自畢赤氏酵屬(pichia)如巴斯德畢赤酵母；來自耶羅維亞酵母屬(yarrowia)如解脂耶羅維亞酵母；來自伊薩酵母屬(issatchenkia)如東方伊薩酵母；來自德巴利酵母屬(debaryomyces)如漢遜德巴利酵母；來自arxula屬如arxulaadenoinivorans；或者來自克魯維酵母菌屬(kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母菌的酵母。此類真核生物也可以是構(gòu)建能夠生成1,3-bdo的本文中描述的重組宿主細胞的基因來源。

代謝工程

本文件提供方法，所述方法牽涉對所有上述途徑描述的少于所有的步驟。此類方法可牽涉例如此類步驟中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或者更多個。在此類方法包含少于所有步驟的情況下，第一個步驟(并且在一些實施方案中唯一的步驟)可以是所列步驟中的任一個。

此外，本文中描述的重組宿主可以包括上述酶中的任何組合，使得所述步驟中的一個或者多個，例如此類步驟中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或者更多個可以在重組宿主內(nèi)實施。本文件提供了所列出的任何屬和種的宿主細胞，并且被遺傳工程化以表達一種或多種(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多種)本文件中所述的任何酶的重組形式。因此，例如，宿主細胞可以含有編碼酶的外源核酸，所述酶催化本文中所述的任何途徑的一個或多個步驟。

另外，本文件認識到，在酶已經(jīng)被描述為接受coa活化的底物的情況下，存在與[acp]結(jié)合底物相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。

此外，本文件認識到，在酶已經(jīng)被描述為接受底物的(r)-對映異構(gòu)體的情況下，存在與底物的(s)-對映異構(gòu)體相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。

本文件還認識到，在已經(jīng)顯示酶接受特定輔因子如nadph或者共底物如乙?；?coa的情況下，許多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同輔因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件認識到，在酶對例如特定輔因子如nadh具有高特異性的情況下，對輔助因子nadph具有高特異性的具有相似或者相同活性的酶可為不同的酶種類。

在一些實施方案中，概述于本文途徑中的酶是經(jīng)由非直接或者合理酶設(shè)計方法的酶工程的結(jié)果，目的在于改善活性、改善特異性、降低反饋抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改變立體特異性，或者改變輔因子特異性。

在一些實施方案中，將概述于本文途徑中的酶經(jīng)由附加型或者染色體整合方法基因投入(genedose)(即，通過在宿主生物中具有多個拷貝的基因的過表達)至所得的經(jīng)遺傳修飾的生物體中。

在一些實施方案中，使用基因組級別(genome-scale)系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)如通量平衡分析(fluxbalanceanalysis)來設(shè)計用于將碳流量引導(dǎo)至1,3-bdo的基因組級別的弱化或者敲除策略。

弱化策略包括但不限于使用轉(zhuǎn)座子、同源重組(雙交叉方法)、誘變、酶抑制劑和rnai干擾。

在一些實施方案中，利用通量組(fluxomic)、代謝物組(metabolomic)和轉(zhuǎn)錄物組(transcriptomal)數(shù)據(jù)來告知或者支持基因組級別的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，由此在將碳流量導(dǎo)向1,3-bdo中設(shè)計基因組級別的弱化或者敲除策略。

在一些實施方案中，通過在選擇性環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)，改善宿主微生物對高濃度1,3-bdo的耐受性。

在一些實施方案中，弱化或增強宿主微生物的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以(1)確保乙酰coa和丙二酰coa的細胞內(nèi)利用度，(2)創(chuàng)建nadh或nadph不平衡，其僅可通過形成1,3-bdo來平衡，(3)防止導(dǎo)致并包括一種或多種1,3-bdo的中心代謝物、中心前體的降解和/或(4)確保從細胞有效的流出。

在一些需要乙酰coa的細胞內(nèi)利用度的實施方案中，可以在宿主生物體中弱化催化乙酰coa水解的內(nèi)源酶，如短鏈長度硫酯酶。

在一些實施方案中，其中需要乙酰coa的細胞內(nèi)利用度，可以弱化產(chǎn)生乙酸的內(nèi)源磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，如pta(shenetal.,appl.environ.microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。

在一些實施方案中，其中需要乙酰coa的細胞內(nèi)利用度，可以弱化在乙酸合成途徑中編碼乙酸激酶的內(nèi)源基因，如ack。

在一些實施方案中，其中需要用于1,3-bdo合成的乙酰coa和nadh細胞內(nèi)利用度，可以弱化編碼催化丙酮酸降解為乳酸的酶(如由ldha編碼的乳酸脫氫酶)的內(nèi)源基因(shenetal.,2011,同上)。

在一些實施方案中，可以在宿主生物體中過表達催化anapleurotic反應(yīng)的酶，如pep羧化酶和/或丙酮酸羧化酶。

在一些實施方案中，其中需要用于1,3-bdo合成的乙酰coa和nadh細胞內(nèi)利用度，可以弱化編碼催化磷酸烯醇式丙酮酸降解為琥珀酸的menaquinol-富馬酸氧化還原酶的內(nèi)源基因，如frdbc(參見例如shenetal.,2011,同上)。

在一些實施方案中，其中需要用于1,3-bdo合成的乙酰coa和nadh細胞內(nèi)利用度，可以弱化編碼催化乙酰coa降解為乙醇的酶(如由adhe編碼的醇脫氫酶)的內(nèi)源基因(shenetal.,2011同上)。

在一些實施方案中，其中需要丙二酰coa的細胞內(nèi)利用度，可以在宿主生物體中過表達乙酰coa羧化酶。

在一些實施方案中，其中需要丙二酰coa的細胞內(nèi)利用度，可以在宿主生物體中弱化或壓制(repressed)丙二酰coaacp轉(zhuǎn)酰酶。

在一些實施方案中，其中需要丙二酰coa的細胞內(nèi)利用度，可以在宿主生物體中過表達由fadr編碼的β-氧化的調(diào)節(jié)蛋白(regulator)(zhangetal.,2012,metabolicengineering,14,653–660)。

在一些實施方案中，其中途徑需要過量的nadh輔因子用于1,3-bdo合成，可以在宿主生物體中過表達重組甲酸脫氫酶基因(shenetal.,2011,同上)。

在一些實施方案中，其中途徑需要過量的nadh輔因子用于1,3-bdo合成，可以弱化重組消耗nadh的轉(zhuǎn)氫酶。

在一些實施方案中，可以弱化編碼催化丙酮酸降解為乙醇的酶(如丙酮酸脫羧酶)的內(nèi)源基因。

在一些實施方案中，其中需要用于1,3-bdo合成的乙酰coa細胞內(nèi)利用度，可以在微生物中過表達重組乙酰coa合成酶，如acs的基因產(chǎn)物(satohetal.,j.bioscienceandbioengineering,2003,95(4):335–341)。

在一些實施方案中，通過弱化內(nèi)源葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(ec5.3.1.9)將碳流引導(dǎo)入戊糖磷酸循環(huán)中以提高nadph的供應(yīng)。

在一些實施方案中，通過過表達6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和/或轉(zhuǎn)酮醇酶將碳流重新引導(dǎo)入戊糖磷酸循環(huán)中以提高nadph的供應(yīng)(leeetal.,2003,biotechnologyprogress,19(5),1444–1449)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以在宿主生物體中過表達編碼嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因，如udha(brighametal.,advancedbiofuelsandbioproducts,2012,chapter39,1065-1090)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以在宿主生物體中過表達重組甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，如gapn(brighametal.,2012,同上)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以在宿主生物體中過表達重組蘋果酸酶基因，如maea或maeb(brighametal.,2012,同上)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以在宿主生物體中過表達重組葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因，如zwf(limetal.,j.bioscienceandbioengineering,2002,93(6),543-549)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以在宿主生物體中過表達重組果糖1,6二磷酸酶基因，如fbp(beckeretal.,j.biotechnol.,2007,132:99-109)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以弱化內(nèi)源丙糖磷酸異構(gòu)酶(ec5.3.1.1)。

在一些實施方案中，其中在1,3-bdo合成中途徑需要過量nadph輔因子，可以在宿主生物體中過表達重組葡萄糖脫氫酶，如gdh的基因產(chǎn)物(satohetal.,j.bioscienceandbioengineering,2003,95(4):335–341)。

在一些實施方案中，可以弱化促進nadph轉(zhuǎn)化為nadh的內(nèi)源酶，如nadh生產(chǎn)循環(huán)，其可以經(jīng)由ec1.4.1.2(nadh-特異性)和ec1.4.1.4(nadph-特異性)下分類的谷氨酸脫氫酶活性的多肽的相互轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。

在一些實施方案中，可以減弱利用nadh和nadph兩者作為輔因子的具有谷氨酸脫氫酶活性(ec1.4.1.3)的內(nèi)源多肽。

在一些實施方案中，將3-羥基丙?；鵦oa和乙酰coa縮合為3-氧代-5-羥基戊?；鵦oa的β-酮硫解酶被酶工程化以對3-羥基丙酰coa和乙酰coa的縮合是選擇性的。

在使用天然累積聚羥基鏈烷酸的宿主的一些實施方案中，可以在宿主菌株中弱化內(nèi)源聚合物合酶。

在一些實施方案中，可以通過對細胞膜的基因工程結(jié)構(gòu)修飾或增加任何與1,3-bdo相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白活性來增強或放大跨越細胞膜至細胞外培養(yǎng)基的1,3-bdo流出。

使用重組宿主生產(chǎn)1,3-bdo

通常，可以通過提供宿主微生物，并且用含有如上文描述的合適的碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)提供的微生物生成1,3-bdo。一般地，培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件可以使得微生物生長到足夠的密度并且有效產(chǎn)生1,3-bdo構(gòu)件塊。對于大規(guī)模生產(chǎn)過程，可以使用任何方法，諸如別處描述的(manualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology,2^ndedition,editors:a.l.demainandj.e.davies,asmpress；andprinciplesoffermentationtechnology,p.f.stanburyanda.whitaker,pergamon)。簡言之，用特定微生物接種含有合適的培養(yǎng)基的大罐(例如，100加侖、200加侖、500加侖、或更多的罐)。在接種后，培養(yǎng)微生物以容許產(chǎn)生生物量。一旦達到期望的生物量，可以將含有微生物的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到第二個罐。此第二個罐可以是任何大小。例如，第二個罐可以是較大的，較小的，或者與第一個罐相同大小的。通常，第二個罐大于第一個，使得可以對來自第一個罐的培養(yǎng)基添加額外的培養(yǎng)基。另外，此第二個罐內(nèi)的培養(yǎng)基可以與第一個罐中使用的培養(yǎng)基相同或不同。

一旦轉(zhuǎn)移，可以溫育微生物以容許生成1,3-bdo。一旦生成，可以使用任何方法來分離1,3-bdo。例如，可以經(jīng)由吸附方法從發(fā)酵液選擇性回收1,3-bdo，或通過蒸餾實現(xiàn)期望的產(chǎn)物純度。

其它實施方案

應(yīng)理解的是，盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其詳細說明進行描述，但是前面描述意圖說明并且不限制發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書的范圍限定。其它方面、優(yōu)點和修改也在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

序列表

<110>英威達技術(shù)有限責(zé)任公司

<120>1,3-丁二醇的生物合成

<130>35643-0079wo1

<150>us62/079,954

<151>2014-11-14

<160>14

<170>fastseqforwindowsversion4.0

<210>1

<211>394

<212>prt

<213>鉤蟲貪銅菌

<400>1

metthrarggluvalvalvalvalserglyvalargthralailegly

151015

thrpheglyglyserleulysaspvalalaproalagluleuglyala

202530

leuvalvalargglualaleualaargalaglnvalserglyaspasp

354045

valglyhisvalvalpheglyasnvalileglnthrgluproargasp

505560

mettyrleuglyargvalalaalavalasnglyglyvalthrileasn

65707580

alaproalaleuthrvalasnargleucysglyserglyleuglnala

859095

ilevalseralaalaglnthrileleuleuglyaspthraspvalala

100105110

ileglyglyglyalaglusermetserargalaprotyrleualapro

115120125

alaalaargtrpglyalaargmetglyaspalaglyleuvalaspmet

130135140

metleuglyalaleuhisaspprophehisargilehismetglyval

145150155160

thralagluasnvalalalysglutyraspileserargalaglngln

165170175

aspglualaalaleugluserhisargargalaseralaalailelys

180185190

alaglytyrphelysaspglnilevalprovalvalserlysglyarg

195200205

lysglyaspvalthrpheaspthraspgluhisvalarghisaspala

210215220

thrileaspaspmetthrlysleuargprovalphevallysgluasn

225230235240

glythrvalthralaglyasnalaserglyleuasnaspalaalaala

245250255

alavalvalmetmetgluargalaglualagluargargglyleulys

260265270

proleualaargleuvalsertyrglyhisalaglyvalaspprolys

275280285

alametglyileglyprovalproalathrlysilealaleugluarg

290295300

alaglyleuglnvalseraspleuaspvalileglualaasngluala

305310315320

phealaalaglnalacysalavalthrlysalaleuglyleuasppro

325330335

alalysvalasnproasnglyserglyileserleuglyhisproile

340345350

glyalathrglyalaleuilethrvallysalaleuhisgluleuasn

355360365

argvalglnglyargtyralaleuvalthrmetcysileglyglygly

370375380

glnglyilealaalailephegluargile

385390

<210>2

<211>401

<212>prt

<213>大腸桿菌

<400>2

metargglualapheilecysaspglyileargthrproileglyarg

151015

tyrglyglyalaleuserservalargalaaspaspleualaalaile

202530

proleuarggluleuleuvalargasnproargleuaspalaglucys

354045

ileaspaspvalileleuglycysalaasnglnalaglygluaspasn

505560

argasnvalalaargmetalathrleuleualaglyleuproglnser

65707580

valserglythrthrileasnargleucysglyserglyleuaspala

859095

leuglyphealaalaargalailelysalaglyaspglyaspleuleu

100105110

ilealaglyglyvalglusermetserargalaprophevalmetgly

115120125

lysalaalaseralapheserargglnalaglumetpheaspthrthr

130135140

ileglytrpargphevalasnproleumetalaglnglnpheglythr

145150155160

aspsermetprogluthralagluasnvalalagluleuleulysile

165170175

serarggluaspglnaspserphealaleuargserglnglnargthr

180185190

alalysalaglnserserglyileleualaglugluilevalproval

195200205

valleulysasnlyslysglyvalvalthrgluileglnhisaspglu

210215220

hisleuargprogluthrthrleugluglnleuargglyleulysala

225230235240

propheargalaasnglyvalilethralaglyasnalaserglyval

245250255

asnaspglyalaalaalaleuileilealasergluglnmetalaala

260265270

alaglnglyleuthrproargalaargilevalalametalathrala

275280285

glyvalgluproargleumetglyleuglyprovalproalathrarg

290295300

argvalleugluargalaglyleuserilehisaspmetaspvalile

305310315320

gluleuasnglualaphealaalaglnalaleuglyvalleuargglu

325330335

leuglyleuproaspaspalaprohisvalasnproasnglyglyala

340345350

ilealaleuglyhisproleuglymetserglyalaargleualaleu

355360365

alaalaserhisgluleuhisargargasnglyargtyralaleucys

370375380

thrmetcysileglyvalglyglnglyilealametileleugluarg

385390395400

val

<210>3

<211>286

<212>prt

<213>大腸桿菌

<400>3

metserglnalaleulysasnleuleuthrleuleuasnleuglulys

151015

ileglugluglyleupheargglyglnsergluaspleuglyleuarg

202530

glnvalpheglyglyglnvalvalglyglnalaleutyralaalalys

354045

gluthrvalproglugluargleuvalhisserphehissertyrphe

505560

leuargproglyaspserlyslysproileiletyraspvalgluthr

65707580

leuargaspglyasnserpheseralaargargvalalaalailegln

859095

asnglylysproilephetyrmetthralaserpheglnalaproglu

100105110

alaglyphegluhisglnlysthrmetproseralaproalaproasp

115120125

glyleuprosergluthrglnilealaglnserleualahisleuleu

130135140

proprovalleulysasplyspheilecysaspargproleugluval

145150155160

argprovalgluphehisasnproleulysglyhisvalalaglupro

165170175

hisargglnvaltrpileargalaasnglyservalproaspaspleu

180185190

argvalhisglntyrleuleuglytyralaseraspleuasnpheleu

195200205

provalalaleuglnprohisglyileglypheleugluproglyile

210215220

glnilealathrileasphissermettrpphehisargpropheasn

225230235240

leuasnglutrpleuleutyrservalgluserthrseralaserser

245250255

alaargglyphevalargglygluphetyrthrglnaspglyvalleu

260265270

valalaserthrvalglngluglyvalmetargasnhisasn

275280285

<210>4

<211>310

<212>prt

<213>藤黃微球菌

<400>4

metsergluphethrargphegluglnvalthrvalleuglythrgly

151015

valleuglyserglnileilemetglnalaalatyrhisglylyslys

202530

valmetalatyraspalavalproalaalaleugluasnleuasplys

354045

argtrpalatrpileargglnglytyrglualaaspleuglyglugly

505560

tyraspalaalaargpheaspglualailealaargilethrprothr

65707580

seraspleualaglualavalalaaspalaaspilevalilegluala

859095

valprogluasnleugluleulysarglysvaltrpalaglnvalgly

100105110

gluleualaproalathrthrleuphealathrasnthrserserleu

115120125

leuproseraspphealaaspalaserglyhisprogluargpheleu

130135140

alaleuhistyralaasnargiletrpalaglnasnthralagluval

145150155160

metglythralaalathrserproglualavalalaglyalaleugln

165170175

phealaglugluthrglymetvalprovalhisvalarglysgluile

180185190

proglytyrpheleuasnserleuleuileprotrpleuglnalagly

195200205

serlysleutyrmethisglyvalglyasnproalaaspileasparg

210215220

thrtrpargvalalathrglyasngluargglypropheglnthrtyr

225230235240

aspilevalglyphehisvalalaalaasnvalserargasnthrgly

245250255

valasptrpglnleuglyphealaglumetleuglulysserileala

260265270

gluglyhisserglyvalalaaspglyglnglyphetyrargtyrgly

275280285

proaspglygluasnleuglyprovalgluasptrpasnleuglyasp

290295300

lysaspthrproleugly

305310

<210>5

<211>436

<212>prt

<213>大腸桿菌

<400>5

metaspalalysglnargilealaargargvalalaglngluleuarg

151015

aspglyaspilevalasnleuglyileglyleuprothrmetvalala

202530

asntyrleuprogluglyilehisilethrleuglnsergluasngly

354045

pheleuglyleuglyprovalthrthralahisproaspleuvalasn

505560

alaglyglyglnprocysglyvalleuproglyalaalametpheasp

65707580

seralametserphealaleuileargglyglyhisileaspalacys

859095

valleuglyglyleuglnvalaspgluglualaasnleualaasntrp

100105110

valvalproglylysmetvalproglymetglyglyalametaspleu

115120125

valthrglyserarglysvalileilealametgluhiscysalalys

130135140

aspglyseralalysileleuargargcysthrmetproleuthrala

145150155160

glnhisalavalhismetleuvalthrgluleualavalpheargphe

165170175

ileaspglylysmettrpleuthrgluilealaaspglycysaspleu

180185190

alathrvalargalalysthrglualaargphegluvalalaalaasp

195200205

leuasnthrglnargglyaspleumetlysthrlysleumetthrleu

210215220

glnaspalathrglyphepheargaspglymetthrilemetvalgly

225230235240

glyphemetglyileglythrproserargleuvalglualaleuleu

245250255

gluserglyvalargaspleuthrleuilealaasnaspthralaphe

260265270

valaspthrglyileglyproleuilevalasnglyargvalarglys

275280285

valilealaserhisileglythrasnprogluthrglyargargmet

290295300

ileserglyglumetaspvalvalleuvalproglnglythrleuile

305310315320

gluglnileargcysglyglyalaglyleuglyglypheleuthrpro

325330335

thrglyvalglythrvalvalglugluglylysglnthrleuthrleu

340345350

aspglylysthrtrpleuleugluargproleuargalaaspleuala

355360365

leuileargalahisargcysaspthrleuglyasnleuthrtyrgln

370375380

leuseralaargasnpheasnproleuilealaleualaalaaspile

385390395400

thrleuvalgluproaspgluleuvalgluthrglygluleuglnpro

405410415

asphisilevalthrproglyalavalileasphisileilevalser

420425430

glngluserlys

435

<210>6

<211>440

<212>prt

<213>惡臭假單胞菌

<400>6

metileasnlysthrtyrgluserilealaseralavalgluglyile

151015

thraspglyserthrilemetvalglyglypheglythralaglymet

202530

prosergluleuileaspalaleuileaspthrglythrargaspleu

354045

thrileileserasnasnalaglyasnglygluileglyleualaala

505560

leuleulysalaglyservalarglysvalvalcysserpheproarg

65707580

glnseraspsertyrvalpheaspgluleutyrargalaglylysile

859095

gluleugluvalvalproglnglyasnleualagluargileargala

100105110

alaglyserglyileglyalaphepheserprothrglytyrglythr

115120125

leuleusergluglylysgluthrarggluileaspglyargglntyr

130135140

valleuglumetproleuhisalaaspphealaleuilelysalatyr

145150155160

lysglyaspargtrpglyasnleuiletyrarglysalaalaargasn

165170175

pheglyproilemetalametalaalalysthralailealaglnval

180185190

aspglnilevalgluleuglygluleuaspprogluhisileilethr

195200205

proglyilephevalglnargvalvalalavalthrglyalaalaser

210215220

serilealametthrilethrthrlysleuserargthrglnmetala

225230235240

glnargvalalaalaaspileglngluglyalatyrvalasnleugly

245250255

ileglyalaprothrleuvalalaasnpheleuglyasplysgluval

260265270

pheleuhissergluasnglyleuleuglymetglyproserproala

275280285

proglyglugluaspaspaspleuileasnalaglylysglnhisval

290295300

thrleuleuthrglyglyalaphephehishisalaaspserpheser

305310315320

metmetargglyglyhisleuaspilealavalleuglyalaphegln

325330335

valservallysglyaspleualaasntrphisthrglyalaglugly

340345350

serileproalavalglyglyalametaspleualathrglyalaarg

355360365

glnvalphevalmetmetasphisleuthrlysserglygluserlys

370375380

ilevalproglucysthrtyrproleuthrglyileglycysvalser

385390395400

argiletyrthraspleualavalleugluvalthrseraspglyleu

405410415

lysvalvalgluilecysalaaspileasppheaspgluleuglnlys

420425430

leuserglyvalproleuilelys

435440

<210>7

<211>524

<212>prt

<213>丙酸羧菌

<400>7

metarglysvalproileilethralaaspglualaalalysleuile

151015

lysaspglyaspthrvalthrthrserglyphevalglyasnalaile

202530

proglualaleuaspargalavalglulysargpheleugluthrgly

354045

gluprolysasnilethrtyrvaltyrcysglyserglnglyasnarg

505560

aspglyargglyalagluhisphealahisgluglyleuleulysarg

65707580

tyrilealaglyhistrpalathrvalproalaleuglylysmetala

859095

metgluasnlysmetglualatyrasnvalserglnglyalaleucys

100105110

hisleupheargaspilealaserhislysproglyvalphethrlys

115120125

valglyileglythrpheileaspproargasnglyglyglylysval

130135140

asnaspilethrlysgluaspilevalgluleuvalgluilelysgly

145150155160

glnglutyrleuphetyrproalapheproilehisvalalaleuile

165170175

argglythrtyralaaspgluserglyasnilethrpheglulysglu

180185190

valalaproleugluglythrservalcysglnalavallysasnser

195200205

glyglyilevalvalvalglnvalgluargvalvallysalaglythr

210215220

leuaspproarghisvallysvalproglyiletyrvalasptyrval

225230235240

valvalalaaspprogluasphisglnglnserleuaspcysglutyr

245250255

aspproalaleuserglygluhisargargprogluvalvalglyglu

260265270

proleuproleuseralalyslysvalileglyargargglyalaile

275280285

gluleuglulysaspvalalavalasnleuglyvalglyalaproglu

290295300

tyrvalalaservalalaaspglugluglyilevalaspphemetthr

305310315320

leuthralagluserglyalaileglyglyvalproalaglyglyval

325330335

argpheglyalasertyrasnalaaspalaleuileaspglnglytyr

340345350

glnpheasptyrtyraspglyglyglyleuaspleucystyrleugly

355360365

leualaglucysaspglulysglyasnileasnvalserargphegly

370375380

proargilealaglycysglyglypheileasnilethrglnasnthr

385390395400

prolysvalphephecysglythrphethralaglyglyleulysval

405410415

lysilegluaspglylysvalileilevalglngluglylysglnlys

420425430

lyspheleulysalavalgluglnilethrpheasnglyaspvalala

435440445

leualaasnlysglnglnvalthrtyrilethrgluargcysvalphe

450455460

leuleulysgluaspglyleuhisleusergluilealaproglyile

465470475480

aspleuglnthrglnileleuaspvalmetaspphealaproileile

485490495

aspargaspalaasnglyglnilelysleumetaspalaalaleuphe

500505510

alagluglyleumetglyleulysglumetlysser

515520

<210>8

<211>246

<212>prt

<213>紫色色桿菌

<400>8

metlysglnglngluvalargglnargalaphealametproleuthr

151015

serproalapheproproglyprotyrargphevalasnargglutyr

202530

metileilethrtyrargthraspproalaalaileglualavalleu

354045

progluproleuglnmetalagluprovalvalargtyrglupheile

505560

argmetproaspserthrglypheglyasptyrsergluserglygln

65707580

valileprovalthrpheargglygluargglysertyrthrleuala

859095

metpheleuaspaspglnproproleualaglyglyarggluleutrp

100105110

glypheprolyslysalaglylysproargleugluvalhisglnasp

115120125

thrleuvalglyserleuasppheglyprovalargilealathrgly

130135140

thrmetglytyrlystyrglualaleuaspargseralaleuleuala

145150155160

serleualagluproasnpheleuleulysileileprohisvalasp

165170175

glyserproargilecysgluleuvalargtyrhisthrthraspval

180185190

alailelysglyalatrpseralaproglyserleugluleuhispro

195200205

hisalaleualaprovalalaalaleuprovalleugluvalleuser

210215220

alaarghisphevalcysaspleuthrleuaspleuglythrvalval

225230235240

pheasptyrleuarggln

245

<210>9

<211>252

<212>prt

<213>短乳桿菌

<400>9

metserasnargleuaspglylysvalalaileilethrglyglythr

151015

leuglyileglyleualailealathrlysphevalglugluglyala

202530

lysvalmetilethrglyarghisseraspvalglyglulysalaala

354045

lysservalglythrproaspglnileglnphepheglnhisaspser

505560

seraspgluaspglytrpthrlysleupheaspalathrglulysala

65707580

pheglyprovalserthrleuvalasnasnalaglyilealavalasn

859095

lysservalglugluthrthrthralaglutrparglysleuleuala

100105110

valasnleuaspglyvalphepheglythrargleuglyileglnarg

115120125

metlysasnlysglyleuglyalaserileileasnmetserserile

130135140

gluglyphevalglyaspproserleuglyalatyrasnalaserlys

145150155160

glyalavalargilemetserlysseralaalaleuaspcysalaleu

165170175

lysasptyraspvalargvalasnthrvalhisproglytyrilelys

180185190

thrproleuvalaspaspleuproglyalagluglualametsergln

195200205

argthrlysthrprometglyhisileglygluproasnaspileala

210215220

tyrilecysvaltyrleualaserasngluserlysphealathrgly

225230235240

sergluphevalvalaspglyglytyrthralagln

245250

<210>10

<211>244

<212>prt

<213>丙酮丁醇羧菌

<400>10

metleulysaspgluvalilelysglnileserthrproleuthrser

151015

proalapheproargglyprotyrlysphehisasnargglutyrphe

202530

asnilevaltyrargthraspmetaspalaleuarglysvalvalpro

354045

gluproleugluileaspgluproleuvalargphegluilemetala

505560

methisaspthrserglyleuglycystyrthrgluserglyglnala

65707580

ileprovalserpheasnglyvallysglyasptyrleuhismetmet

859095

tyrleuaspasngluproalailealavalglyarggluleuserala

100105110

tyrprolyslysleuglytyrprolysleuphevalaspseraspthr

115120125

leuvalglythrleuasptyrglylysleuargvalalathralathr

130135140

metglytyrlyshislysalaleuaspalaasnglualalysaspgln

145150155160

ilecysargproasntyrmetleulysileileproasntyraspgly

165170175

serproargilecysgluleuileasnalalysilethraspvalthr

180185190

valhisglualatrpthrglyprothrargleuglnleupheasphis

195200205

alametalaproleuasnaspleuprovallysgluilevalserser

210215220

serhisileleualaaspileileleuproargalagluvaliletyr

225230235240

asptyrleulys

<210>11

<211>351

<212>prt

<213>拜氏羧菌

<400>11

metlysglyphealametleuglyileasnlysleuglytrpileglu

151015

lysgluargprovalalaglysertyraspalailevalargproleu

202530

alavalserprocysthrseraspilehisthrvalphegluglyala

354045

leuglyasparglysasnmetileleuglyhisglualavalglyglu

505560

valvalgluvalglysergluvallysaspphelysproglyasparg

65707580

valilevalprocysthrthrproasptrpargserleugluvalgln

859095

alaglypheglnglnhisserasnglymetleualaglytrplysphe

100105110

serasnphelysaspglyvalpheglyglutyrphehisvalasnasp

115120125

alaaspmetasnleualaileleuprolysaspmetproleugluasn

130135140

alavalmetilethraspmetmetthrthrglyphehisglyalaglu

145150155160

leualaaspileglnmetglyserservalvalvalileglyilegly

165170175

alavalglyleumetglyilealaglyalalysleuargglyalagly

180185190

argileileglyvalglyserargproilecysvalglualaalalys

195200205

phetyrglyalathraspileleuasntyrlysasnglyhisileval

210215220

aspglnvalmetlysleuthrasnglylysglyvalaspargvalile

225230235240

metalaglyglyglysergluthrleuserglnalavalsermetval

245250255

lysproglyglyileileserasnileasntyrhisglyserglyasp

260265270

alaleuleuileproargvalglutrpglycysglymetalahislys

275280285

thrilelysglyglyleucysproglyglyargleuargalaglumet

290295300

leuargaspmetvalvaltyrasnargvalaspleuserlysleuval

305310315320

thrhisvaltyrhisglypheasphisilegluglualaleuleuleu

325330335

metlysasplysprolysaspleuilelysalavalvalileleu

340345350

<210>12

<211>542

<212>prt

<213>鉤蟲貪銅菌

<400>12

metlysvalilethralaargglualaalaalaleuvalglnaspgly

151015

trpthrvalalaseralaglyphevalglyalaglyhisalagluala

202530

valthrglualaleugluglnargpheleuglnserglyleuproarg

354045

aspleuthrleuvaltyrseralaglyglnglyaspargglyalaarg

505560

glyvalasnhispheglyasnalaglymetthralaserilevalgly

65707580

glyhistrpargseralathrargleualathrleualametalaglu

859095

glncysgluglytyrasnleuproglnglyvalleuthrhisleutyr

100105110

argalailealaglyglylysproglyvalmetthrlysileglyleu

115120125

histhrphevalaspproargthralaglnaspalaargtyrhisgly

130135140

glyalavalasngluargalaargglnalailealagluglylysala

145150155160

cystrpvalaspalavalasppheargglyaspglutyrleuphetyr

165170175

proserpheproilehiscysalaleuileargcysthralaalaasp

180185190

alaargglyasnleuserthrhisargglualaphehishisgluleu

195200205

leualametalaglnalaalahisasnserglyglyilevalileala

210215220

glnvalgluserleuvalasphishisgluileleuglnalailehis

225230235240

valproglyileleuvalasptyrvalvalvalcysaspasnproala

245250255

asnhisglnmetthrphealaglusertyrasnproalatyrvalthr

260265270

protrpglnglyglualaalavalalaglualaglualaalaproval

275280285

alaalaglyproleuaspalaargthrilevalglnargargalaval

290295300

metgluleualaargargalaproargvalvalasnleuglyvalgly

305310315320

metproalaalavalglymetleualahisglnalaglyleuaspgly

325330335

phethrleuthrvalglualaglyproileglyglythrproalaasp

340345350

glyleuserpheglyalaseralatyrproglualavalvalaspgln

355360365

proalaglnpheaspphetyrgluglyglyglyileaspleualaile

370375380

leuglyleualagluleuaspglyhisglyasnvalasnvalserlys

385390395400

pheglygluglygluglyalaserilealaglyvalglyglypheile

405410415

asnilethrglnseralaargalavalvalphemetglythrleuthr

420425430

alaglyglyleugluvalargalaglyaspglyglyleuglnileval

435440445

arggluglyargvallyslysilevalprogluvalserhisleuser

450455460

pheasnglyprotyrvalalaserleuglyileprovalleutyrile

465470475480

thrgluargalavalpheglumetargalaglyalaaspglygluala

485490495

argleuthrleuvalgluilealaproglyvalaspleuglnargasp

500505510

valleuaspglncysserthrproilealavalalaglnaspleuarg

515520525

glumetaspalaargleupheglnalaglyproleuhisleu

530535540

<210>13

<211>438

<212>prt

<213>氨基丁酸羧菌

<400>13

metasptrplyslysiletyrgluaspargthrcysthralaaspglu

151015

alavallysserilelysserglyaspargvalleuphealahiscys

202530

valalagluproprovalleuvalglualametvalalaasnalaala

354045

alatyrlysasnvalthrvalserhismetvalthrleuglylysgly

505560

glutyrserlysproglutyrlysgluasnphethrphegluglytrp

65707580

phethrserproserthrargglyserilealagluglyhisglygln

859095

phevalprovalphephehisgluvalproserleuilearglysasp

100105110

ilephehisvalaspvalphemetvalmetvalserproproasphis

115120125

asnglyphecyscysvalglyvalserserasptyrthrmetglnala

130135140

ilelysseralalysilevalleualagluvalasnaspglnvalpro

145150155160

valvaltyrglyaspthrphevalhisvalsergluileasplysphe

165170175

valgluthrserhisproleuprogluileglyleuprolysilegly

180185190

gluvalglualaalaileglylyshiscysalaserleuilegluasp

195200205

glyserthrleuglnleuglyileglyalaileproaspalavalleu

210215220

serglnleulysasplyslyshisleuglyilehisserglumetile

225230235240

seraspglyvalvalaspleutyrglualaglyvalileaspcysser

245250255

glnlysserileasplysglylysmetalailethrpheleumetgly

260265270

thrlysargleutyraspphealaalaasnasnprolysvalgluleu

275280285

lysprovalasptyrileasnhisproservalvalalaglncysser

290295300

lysmetvalcysileasnalacysleuglnvalaspphemetglygln

305310315320

ilevalseraspserileglythrlysglnpheserglyvalglygly

325330335

glnvalaspphevalargglyalasermetserileaspglylysgly

340345350

lysalaileilealametproservalalalyslyslysaspglyser

355360365

metileserlysilevalpropheileasphisglyalaalavalthr

370375380

thrserargasnaspalaasptyrvalvalthrglutyrglyileala

385390395400

glumetlysglylysserleuglnaspargalaargalaleuileasn

405410415

ilealahisproaspphelysaspgluleulysalaglupheglulys

420425430

argpheasnalaalaphe

435

<210>14

<211>132

<212>prt

<213>大腸桿菌

<400>14

metserthrthrhisasnvalproglnglyaspleuvalleuargthr

151015

leualametproalaaspthrasnalaasnglyaspilepheglygly

202530

trpleumetserglnmetaspileglyglyalaileleualalysglu

354045

ilealahisglyargvalvalthrvalargvalgluglymetthrphe

505560

leuargprovalalavalglyaspvalvalcyscystyralaargcys

65707580

valglnlysglythrthrservalserileasnilegluvaltrpval

859095

lyslysvalalasergluproileglyglnargtyrlysalathrglu

100105110

alaleuphelystyrvalalavalaspprogluglylysproargala

115120125

leuprovalglu

130