相關申請的交叉引用

本申請要求2014年8月20日提交的現在未決的美國臨時申請no.62/039,497的優(yōu)先權，其公開內容通過引用并入本文。

表皮生長因子受體(egfr)也稱為erbb1或her-1，是在多種細胞應答中起主要作用的細胞表面受體。其為四個密切相關的受體酪氨酸激酶：erbb1、erbb2(her-2)、erbb3(her-3)、erbb4(her-4)的成員。與這些受體的胞外域結合的配體導致同二聚化或異二聚化，隨后是參與一系列細胞事件的受體酪氨酸磷酸化和許多信號蛋白的磷酸化/激活。erbb受體下游的關鍵信號通路包括pi3k/akt/mtor通路、ras/raf/erk通路和jak/stat通路。erbb的激活導致提高的dna合成、細胞生長、細胞增殖、細胞分化和細胞遷移，這或許在癌細胞中最清楚地顯示。實際上，erbb受體已成為癌癥治療的主要藥物靶點。已知erbb受體的激酶結構域的過表達或激活突變與多種癌癥相關聯(lián)。

erbb1在其激酶結構域中的過表達或激活突變發(fā)生在許多癌癥中，包括但不限于腦癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌和頭頸癌。多種erbb1靶向藥物已經上市，包括帕尼單抗(penitumumab)、西妥昔單抗、吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼(afatinib)。帕尼珠單抗(igg2同種型)和西妥昔單抗(igg1同種型)是單克隆抗體，而吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼是低分子量酪氨酸激酶抑制劑。然而，很多患者或者固有地對這些藥劑不敏感，或者發(fā)展了獲得性抗性。因此，對于開發(fā)靶向癌癥中的erbb1的新治療方法存在持續(xù)的和未滿足的需要。本公開滿足了這一需求。

技術實現要素：

本公開提供可用于預防和/或治療erbb1陽性癌癥的組合物和方法。組合物和方法部分地涉及以下發(fā)現：氨?；彼岫拿?prolidase)或肽酶d(本文稱為pepd)是erbb1受體的配體。然而，與描述了pepd與erbb1結合刺激erbb1和癌細胞增殖的之前的報道(yang等人,prolidasedirectlybindsandactivatesepidermalgrowthfactorreceptorandstimulatesdownstreamsignaling,jbiolchem.2013年1月25日；288(4):2365-75)相反，本公開證明pepd可用于抑制erbb1+癌細胞的生長。特別地，本公開證明了快速pepd-erbb1結合誘導過表達erbb1的癌細胞生長抑制，而最初刺激表達低或中等水平的erbb1的癌細胞的生長(24小時治療)，但隨后抑制(24小時后)；參見例如圖5,6b)。此外，認為本公開首次描述了與兩個erbb1單體交聯(lián)的任何erbb1配體?！敖宦?lián)”是指兩個erbb1單體同時與單個pepd二聚體結合，但并不意味著erb1二聚體彼此共價結合。

氨?；彼岫拿敢卜Q為肽酶d(pepd)、xaa-pro二肽酶或脯氨酸二肽酶或亞胺二肽酶，是水解在羧基末端具有脯氨酸或羥脯氨酸的二肽的蛋白酶。pepd是廣泛表達的胞質蛋白質，并且作為同二聚體(人pepd的單體分子量：54kd；如下文seqidno:1所示的493個氨基酸，其提供人氨?；彼岫拿傅陌被嵝蛄?存在。在一些實施方案中，用于本公開的組合物和方法的pepd是哺乳動物pepd。在一個實施方案中，pepd是人pepd。在一些實施方案中，pepd可以是酶活性的或具有降低的或不具有可檢測的酶活性。

用于本文公開的方法的組合物包含含有分離和/或純化的pepd或重組和/或修飾的pepd的藥物制劑，并且還可以包含另外的試劑，例如抗凝血劑。在一些實施方案中，pepd是修飾的。在一些實施方案中，pepd是融合蛋白的組分。在一些實施方案中，融合蛋白包含pepd和可用于純化重組產生的pepd的氨基酸序列。

所述方法包括向需要預防和/或治療erbb1陽性癌癥的個體施用包含本公開的pepd的組合物，并且還可以包括向個體施用抗凝血劑。還提供了用于鑒定需要用pepd制劑治療的個體的方法以及為這些個體生成治療方案的方法。

在一些實施方案中，本公開還提供了產品，其包含含有分離和/或純化的pepd或重組pepd的藥物制劑，并且還可以包含描述使用制劑預防和/或治療erbb1陽性癌癥的印刷材料作為指示。在一些實施方案中，產品還包含抗凝血劑。在一些非限制性實施方案中，erbb1陽性癌癥包括腦癌、乳腺癌、結腸癌、頭頸癌和肺癌。在一些實施方案中，erbb1陽性癌細胞是相對于非癌細胞過表達erbb1或相對于非癌細胞攜帶更高拷貝數的erbb1基因的癌細胞。在一些實施方案中，erbb1陽性癌細胞表達具有激活突變的erbb1。

附圖說明

圖1.數據顯示細菌產生的重組人pepd(rhpepd)或無酶活性的rhpepd^g278d特異性地結合erbb1(egfr)并交聯(lián)兩個erbb1單體。(a)將rhpepd(0.4nmol/ml)用人erbb1胞外域和人igg1的fc片段的融合蛋白(erbb1-fc)(0.04nmol/ml)、erbb1-fc(0.04nmol/ml)加牛血清白蛋白(bsa；19nmol/ml)，或fc(0.04nmol/ml)在37℃下孵育1小時，然后在4℃下孵育過夜。在另一個實驗中，在不存在或存在表皮生長因子(egf；+，5pmol/ml；++，50pmol/ml)的情況下，將rhpepd(1nmol/ml)用erbb1-fc(0.04nmol/ml)在37℃下孵育1小時，然后在4℃下孵育過夜。然后使rhpepd、fc和/或erbb1-fc的所有樣品通過蛋白a瓊脂糖凝膠珠，并且進行蛋白質印跡(westernblotting)。bsa用于排除rhpepd的非特異性結合。egf用于確認erbb1與rhbep1的特異性結合。(b)通過elisa測定hpepd與erbb1的結合。每個值為平均值±sd(n＝3)。通過非線性回歸評估kd值(graphpadprism6軟件)。(c)小鼠髓細胞32d細胞不表達任何erbb。通過基因轉染和選擇產生穩(wěn)定表達人erbb1的32d細胞。用載體、rhpepd或rhpepd^g278d(5nm)處理32d/erbb1細胞，然后用交聯(lián)劑雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯(bs3；2mm，30分鐘)處理；通過蛋白質印跡分析erbb1的細胞裂解物。

圖2.數據顯示rhpepd或rhpepd^g278d導致erbb1磷酸化和隨后的erbb1消耗。用rhpepd或rhpepd^g278d(5nm)處理32d/erbb1細胞不同時間，隨后進行erbb1和erbb1磷酸化的蛋白質印跡。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)是加載對照。

圖3.數據顯示rhpepd和rhpepd^g278d調節(jié)erbb1和erbb2并破壞erbb1-erbb2異二聚化。(a)用人erbb1轉染穩(wěn)定過表達人erbb2的cho-k1細胞24小時，然后用rhpepd(5nm)處理，接著進行erbb1、磷酸化erbb1、erbb2和磷酸化erbb2的蛋白質印跡。gapdh是加載對照。(b,c)在用或不用egf(20nm，15分鐘)預處理的情況下，用人erbb1轉染穩(wěn)定過表達人erbb2的cho-k1細胞24小時，然后用溶劑、rhpepd或rhpepd^g278d(5nm)處理1小時。使用erbb2抗體或erbb1抗體對細胞裂解物進行免疫沉淀，然后進行免疫印跡。對于b中所示的免疫印跡，將樣品加載調整為含有等量的erbb2。(d)具有和不具有erbb2加載調整的免疫印跡。用rhpepd以5nm處理穩(wěn)定過表達erbb2的cho-k1細胞1小時。將細胞裂解物用erbb2抗體孵育，并使免疫復合物通過蛋白g瓊脂糖，然后進行erbb2的免疫印跡。將樣品加載調整為含有等量的erbb2或不調整。

圖4.曲線示出了通過rhpepd和rhpepd^g278d的erbb1和erbb2調整的圖。(a)同二聚體(homodemeric)rhpepd或rhpepd^g278d結合并交聯(lián)兩個erbb1單體，這導致erbb1磷酸化和消耗，后者由內化和降解引起。(b)erbb1和/或erbb2的過表達導致異二聚化和不存在配體的情況下的受體磷酸化。rhpepd或rhpepd^g278d通過交聯(lián)兩個erbb1單體和兩個erbb2單體來破壞erbb1-erbb2異二聚體，導致由于內化和降解引起的受體消耗。值得注意的是，盡管與erbb1和erbb2兩者結合，但是rhpepd和rhpepd^g278d均不與erbb1和erbb2交聯(lián)；(c)egf誘導erbb1-erbb2異二聚化，但rhpepd和rhpepd^g278d兩者通過交聯(lián)兩個erbb2單體破壞這種二聚體，并通過內化和降解引起erbb2消耗。

圖5.數據顯示rhpepd^g278d抑制過表達erbb1或具有激活突變的erbb1的癌細胞的增殖。評估的細胞系包括穩(wěn)定地過表達人erbb1的cho-k1細胞(cho-k1erbb1細胞)、穩(wěn)定地過表達人erbb1和人erbb2的cho-k1細胞(cho-k1erbb1/erbb2細胞)、過表達人erbb1的人類表皮樣癌a431細胞，以及在erbb1酪氨酸激酶結構域(e746-a750缺失)中表達激活突變的人肺腺癌hcc827細胞。將細胞在96孔板中生長過夜，然后用溶劑或rhpepd^g278d處理24、48或72小時，然后通過mtt測定法測量細胞增殖。每個值為平均值±sd(n＝3)。通過單因素anova分析72h時間點的數據，接著進行tukey多重比較檢驗，****p<0.0001。

圖6.數據顯示rhpepd^g278d不影響不表達erbb1的細胞的增殖，而rhpepd^g278d在具有中等erbb1表達的細胞中對細胞增殖具有兩種影響(最初適度刺激，隨后顯著抑制)。(a)使cho-k1細胞(無erbb1)在96孔板中生長過夜，然后用溶劑或rhpepd^g278d處理72小時，然后通過mtt測定法測定細胞增殖。每個值為平均值±sd(n＝3)。(b)使小鼠肝癌hepa1c1c7細胞(中等水平的erbb1)在96孔板中生長過夜，然后用溶劑或rhpepd^g278d處理24、48或72小時，然后通過mtt測定法測定細胞增殖。每個值為平均值±sd(n＝3)。通過單因素anova分析24h和72h時間點的數據，然后進行tukey多重比較檢驗，*p<0.05，****p<0.0001。

圖7.數據顯示rhpepd^g278d在各種癌細胞系中沉默erbb1和erbb2(受體消耗和相應的受體酪氨酸磷酸化降低)。(a)cho-k1/erbb1細胞、cho-k1/erbb1+erbb2細胞、a431細胞、hcc827細胞、hepa1c1c7細胞和cho-k1細胞中erbb1和erbb2的表達和酪氨酸磷酸化。通過蛋白質印跡分析細胞裂解物。測量代表性磷酸化位點。(b，c)用5或25nm的溶劑或hpepd^g278d處理細胞48小時，然后制備細胞裂解物以及對erbb1、erbb2及其磷酸化進行蛋白質印跡分析。對于a431細胞，還測量了akt、p-akt、erk、p-erk、stat3和p-stat3。

圖8.數據顯示臨床使用的抗凝血劑的依諾肝素(ep)提高pepd的血漿濃度。ep是臨床使用的低分子量肝素(lmwh)。實驗中使用c57bl/6小鼠(雄性，7-8周齡)。通過elisa測量內源小鼠pepd或總pepd(內源小鼠pepd加rhpepd)的血漿水平。ep和rhpepd在pbs中給予小鼠。(a)在接受載體或rhpepd的單次腹膜內(i.p.)劑量后，1或24小時的內源小鼠pepd和總pepd的血漿濃度。誤差條是sd(n＝3)。對數據進行對數變換，通過雙因素anova分析，然后進行tukey多重比較檢驗，****p<0.0001。(b)小鼠未處理或用ep每天一次腹膜內處理，持續(xù)4天；在最后ep劑量后1小時，給予ep處理小鼠載體或rhpepd的腹膜內劑量，隨后在最后給藥后1或24小時測量小鼠pepd和總pepd的血漿水平。誤差條是sd(n＝3)。對數據進行對數變換，雙因素anova分析，然后進行tukey多重比較檢驗，****p<0.0001。(c)每天一次向小鼠腹膜內施用不同劑量的ep；在第四次ep劑量1小時后，用載體或rhpepd腹膜內注射小鼠。在給予載體或rhpepd后1和24小時測量總pepd的血漿濃度。每個條代表1個樣本(每組2只小鼠)。

圖9.數據顯示用rhpepd或rhpepd^g278d處理后腫瘤生長抑制和腫瘤組織中的分子變化。人乳腺癌bt-474細胞組成型過表達erbb2，但也表達低水平的erbb1和erbb3。將bt-474細胞接種到雌性無胸腺小鼠的乳腺脂肪墊上。腫瘤大小達到230mm³后治療小鼠。(a)用載體、ep、ep加rhpepd或ep加rhpepd^g278d治療后原位bt-474腫瘤的大小。在rhpepd或rhpepd^g278d前4天開始，每天通過腹膜內注射(i.p.)以0.5mg/kg的劑量向小鼠施用ep。間隔2天，以2mg/kg向小鼠腹膜內施用rhpepd和rhpepd^g278d兩次。在最后劑量后24小時殺死小鼠。誤差條是sem(n＝4-6)。比例尺：3cm。(b)在如a所示的每次治療的最后劑量后24小時獲得比較腫瘤標本中的主要細胞信號傳導變化的免疫印跡。每個樣品代表一個腫瘤。(c，d)在如a所示的每次治療的最后劑量后24小時獲得的腫瘤樣本中的src激酶活性和pi3k活性。誤差條為sd(n＝3)。(e)在如a所示的每次治療的最后劑量后24小時獲得比較腫瘤標本中的hif-1α信號傳導變化的免疫印跡。每個樣品代表一個腫瘤。上述結果表明，rhpepd^g278d對于腫瘤抑制優(yōu)于rhpepd。通過雙因素anova分析(a，c，d)中的數據。

圖10.數據顯示來自用rhpepd^g278d治療的小鼠的腫瘤組織中腫瘤生長抑制和erbb1信號傳導的抑制，以及rhpepd^g278d的高血漿濃度。具有皮下a431腫瘤的雄性無胸腺小鼠(5-6周齡)未治療、用ep治療或用ep加rhpepd^g278d治療。每天向小鼠腹膜內施用ep(0.5mg/kg)，共計13個劑量；每隔一天向小鼠腹膜內施用rhpepd^g278d(4mg/kg)，總共2個劑量(在ep的11次劑量后開始)或5個劑量(在ep的5次劑量后開始)。當ep和rhpepd^g278d在同一天給予相同的小鼠時，在ep后1小時給予rhpepd^g278d。從最后一次治療后24小時的小鼠或者在同時從未治療小鼠獲得血液樣品和腫瘤。通過elisa測定內源小鼠pepd和/或rhpepd^g278d的血漿濃度。誤差條表示sd(n＝3)。通過單因素anova分析數據，與載體對照相比，****p<0.0001。(a)通過elisa測定內源小鼠pepd和/或rhpepd^g278d的血漿濃度。誤差條表示sd(n＝3)。通過單因素anova分析數據，與未治療對照相比，****p<0.0001。(b)對照小鼠和用ep或ep加rhpepd^g278d治療的小鼠的腫瘤大小。每個值為平均值±sem(n＝4-10)。通過單因素anova分析數據。(c)來自對照小鼠或用ep或ep加rhpepd^g278d治療的小鼠的腫瘤中的信號分子的變化。每個泳道代表一個腫瘤。(a)治療開始和結束時的小鼠體重(平均值±sd)。

具體實施方式

除非另有規(guī)定，否則意圖是在本說明書中給出的每個最大數值限制包括每個較小數值限制，就如同這樣的較小數值限制在本文中明確書面表達。在本說明書中給出的每個最小數值限制包括每個較大數值限制，就如同這樣的較大數值限制在本文中明確書面表達。在本說明書中給出的每個數值范圍包括落在這樣更較大數值范圍內的每個較小數值范圍，就如同這樣的較小數值范圍在本文中明確書面表達。

本公開至少部分地基于我們的發(fā)現，pepd或其無酶活性的突變體與erbb1結合，抑制體外由erbb1或erbb1和erbb2驅動的癌細胞的生長，抑制小鼠模型中erbb1驅動的癌癥的生長，并導致erbb1(和erbb2)的消耗和癌細胞和癌癥組織中致癌信號傳導的抑制。特別地，關于erbb1，已經表明人pepd結合erbb1并在刺激體外表達erbb1的細胞的增殖(yang等人,journalofbiologicalchemistry,288,2365-2375,2013)。然而，與該觀察相反并且如上所述，在本公開中證明，用pepd治療癌癥細胞超過24小時導致細胞生長的顯著和時間依賴性抑制，其與erbb1消耗以及其他變化相關。pepd及其無酶活性的突變體(pepd^g278d)直接結合于erbb1的胞外域并交聯(lián)兩個erbb1單體，導致erbb1內化和降解，盡管erbb1磷酸化瞬時增加。我們的數據還顯示了pepd及其突變體破壞erbb1與erbb2的異二聚化。這表明pepd或pepd突變體可用于針對erbb1驅動的癌癥，所述癌癥對于目前的erbb1靶向治療表現出固有的(denova)或獲得性抗性?？剐詸C制包括但不限于erbb2過表達和第二位點突變(yonesaka等人,sciencetranslationalmedicine3,99ra86,2011；linandbivona,chemotherapyresearchandpractice2012,articleid817297,2012)。pepd和pepd^g278d可以通過靶向erbb1和erbb2兩者并通過使用其新靶向機制即交聯(lián)erbb1或erbb2兩種單體來克服這種抗性。值得注意的是，沒有已知的抗erbb1試劑可以交聯(lián)erbb1單體。

如上所述，通過“交聯(lián)(“cross-link”和“cross-linking”)”是指兩個erbb1單體(或兩個erbb2單體)同時與單個pepd二聚體結合，但并不意味著這種二聚體彼此共價結合。圖4a示出了作為同二聚體交聯(lián)的erbb1的代表性和非限制性的示例，圖4b和4c示出了erb1和erbb2同型二聚體。我們沒有發(fā)現pepd交聯(lián)erbb1/erbb2異二聚體的證據。

ncbi參考序列nm_005228.3和np_005219.2中提供了erbb1的mrna序列和氨基酸序列。雖然erbb1中的變體是本領域已知的，但預期本方法將適合于任何erbb1變體，條件是erbb1變體具有胞外域。胞外域是本領域已知的。本公開還包括用于預防和治療表達這些序列變體的癌細胞的組合物和方法，例如具有突變或截短的c-末端但保留胞外域(ecd)的那些序列；ecd是本領域周知的。

本公開揭示了pepd的根本不同和新的功能。pepd已知為胞質二肽酶，但是無酶活性的pepd突變體(pepd^g278d)在調節(jié)erbb1中與pepd本身一樣有效。對于腫瘤抑制，pepd^g278d可能比pepd更有效，因為如本公開證明的，rhpepd的酶功能刺激hif-1α信號傳導(圖9e)，其可能減弱pepd抗腫瘤活性。pepd^g278d也比pepd本身更吸引人是因為前者可能不干擾正常細胞中內源pepd的酶功能。此外，雖然之前的報道指出，通過elisa(yang等人,journalofbiologicalchemistry288,2365-2375,2013)測量，pepd是相對低親和力的erbb1配體(kd＝5.3μm)，但是本公開證明了更高的結合親和力(kd＝392.6nm；參見圖1b)。

pepd和pepd^g278d對erbb1的抑制作用與其他erbb配體對其受體的眾所周知的刺激性影響形成鮮明的對比。鑒于目前的erbb1靶向劑的高成本，例如西妥昔單抗，每個患者治療8周治療費用高達30,000美元，pepd的優(yōu)勢在于其可以以較低成本如下文進一步描述的大量重組生產，因此在某些實施方案中，預期是西妥昔單抗和其他目前可用的抗erbb1試劑的重要和較便宜的替代物。

預期任何pepd都適用于本發(fā)明的組合物和方法。在一些實施方案中，pepd是由原核生物或真核生物產生的pepd。在一些實施方案中，pepd是原核來源的。在一些非限制性實施方案中，pepd通過游海假交替單胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)(即，包含genbankno.aaa99824.1下的氨基酸序列的pepd)或激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)(即，包含genbankno.wp_011011876.1下的氨基酸序列的pepd)產生。許多真核pepd氨基酸序列也是本領域已知的，包括許多哺乳動物pepd氨基酸序列。在一些實施方案中，pepd具有嚙齒動物pepd(即小鼠或大鼠)或非人靈長類動物pepd(例如黑猩猩或恒河猴)的序列。小鼠氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列在genbank登錄號np_032846.2下提供；大鼠氨?；彼岫拿冈趎p_001009641.1下提供；恒河猴氨酰基脯氨酸二肽酶在afj71215.1下提供；黑猩猩氨酰基脯氨酸二肽酶在np_001267459.1下提供。seqidno:1中的人氨?；彼岫拿?pepd)的氨基酸序列是本領域已知的。seqidno:1和編碼它的cdna序列可通過genbank登錄號j04605.1獲得；氨基酸序列也在genbank登記號aaa60064下提供。在一個說明性但非限制性的實施方案中，酶活性的人pepd具有seqidno:1的序列：

maaatgpsfwlgnetlkvplalfalnrqrlcerlrknpavqagsivvlqggeetqryctdtgvlflqesffhwafgvtepgcygvidvdtgkstlfvprlpashatwmgkihskehfkekyavddvqyvdeiasvltsqkpsvlltlrgvntdsgsvcreasfdgiskfevnntilhpeivesrvfktdmelevlrytnkisseahrevmkavkvgmkeygleslfehycysrggmrhssytcicgsgensavlhyghagapndrtiqngdmclfdmggeyysvasditcsfprngkftadqkavyeavllssravmgamkpgdwwpdidrladrihleelahmgilsgsvdamvqahlgavfmphglghflgidvhdvggypegveridepglrslrtarhlqpgmvltvepgiyfidhlldealadparasflnrevlqrfrgfggvrieedvvvidsgielltcvprtveeieacmagcdkaftpfsgpk(seqidno:1)

在seqidno:1中，278位的g用陰影、粗體和斜體表示，表示使pepd無酶活性的g278d突變的位置。在一些實施方案中，突變是278位的甘氨酸突變成天冬氨酸以外的氨基酸。

在本公開中引用的genbank登錄號下提供的所有氨基酸和多核苷酸序列通過引用并入本文，因為這些序列在本申請?zhí)峤蝗湛梢酝ㄟ^genbank獲得。本公開還包括編碼pepd的所有多核苷酸及其在本文中所述或者以其他方式被本領域技術人員已知的考慮本公開益處的所有變體。

嚙齒類動物(小鼠和大鼠)pepd氨基酸序列與人類序列具有大于86％相似性，而非人類靈長類動物pped氨基酸序列(例如恒河猴)與人pepd氨基酸序列具有大于95％相似性。在一些實施方案中，pepd包含人pepd氨基酸序列或由人pepd氨基酸序列組成。在一些實施方案中，在本公開的組合物和/或方法中使用的pepd與seqidno:1的序列具有至少85.0％和99％之間(包括其之間的第一十分位的所有數字)的相似性。在一個實施方案中，pepd包含與seqidno:1的序列具有至少95％相似性的氨基酸序列。

在多個實施方案中，本公開包括使用包含野生型pepd(例如，seqidno:1的pepd)或修飾的pepd或其組合的組合物。一般來說，適用于本發(fā)明的pepd的修飾可以由本領域技術人員使用普通技術考慮本說明書的益處來確定。在一些實施方案中，修飾的pepd包含seqidno:1的修飾。本公開包括seqidno:1的所有修飾，只要pepd保持與細胞表面的erbb1結合并導致其消耗的能力。在一些實施方案中，修飾的pepd保持形成同二聚體的能力。在一些實施方案中，使erbb1陽性細胞與本公開的修飾(或野生型)pepd接觸，接著是erbb1結合和erbb1的內吞，導致erbb1消耗。維持這些功能屬性中的一些或全部的修飾的pepd可以包括氨基酸插入、缺失和取代。例如，本公開包括已經通過保守氨基酸取代修飾的pepd，所述取代通?；趓-基取代基的相對相似性。這種取代的非限制性實例包括gly或ser取代ala；lys取代arg；gln或his取代asn；glu取代asp；ser取代cys；asn取代gln；asp取代glu；ala取代gly；asn或gln取代his；leu或val取代ile；ile或val取代leu；arg取代lys；leu或tyr取代met；thr取代ser；tyr取代trp；phe取代tyr；和ile或leu取代val。因此，包含任何單一保守氨基酸取代或保守氨基酸取代的任何組合的pepd包括在本公開中，只要其至少能保持與erbb1結合，隨后從細胞表面消耗erbb1的能力。如何確定任何特定的修飾的pepd是否可以結合erbb1對于本領域技術人員是顯而易見的。在一些實施方案中，修飾的pepd可以結合erbb1胞外域，估計的kd值為392.6nm，如使用elisa測定法確定的。

野生型pepd是酶活性的。修飾的pepd是包含seqidno:1的變化的pepd，并且可以是酶活性或無酶活性的。關于這一點，本領域已知pepd的亞氨基二肽酶活性缺陷與氨酰基脯氨酸二肽酶缺陷相關，這是與膠原代謝相關的非常罕見的常染色體隱性遺傳疾病并影響結締組織。因此，已知pepd的酶活性是重要的。然而，在一些實施方案中，在本公開的組合物和方法中使用無酶活性的pepd。無酶活性的pepd被認為是與包含seqidno:1的序列或由seqidno:1的序列組成的參考蛋白質所表現的水解量相比，對于在羧基末端具有脯氨酸或羥脯氨酸的底物二肽酶表現較小水解的pepd。在一些實施方案中，與參考pepd相比，無酶活性的pepd可以具有0.0％和99.9％(包含)之間，并且包含其之間的第一十分位的所有數字的較小的二肽水解活性。在一個實施方案中，無酶活性的pepd具有參考pepd的不超過0.6％的二肽水解活性。在一個實施方案中，參考pepd包含seqidno:1的序列或由seqidno:1的序列組成。氨酰基脯氨酸二肽酶活性的一個單位可以定義為在標準測定條件下釋放1μmol脯氨酸/h的酶的量。在一個實施方案中，無酶活性的pepd不具有可檢測的pepd二肽水解活性。在一些實施方案中，本公開包括本文公開的pepd突變中的任何一種或其任何組合，因此包括條件是可從本發(fā)明排除任何單一或任何組合的這樣的突變體。

在本公開的實施方案中使用的pepd可以包括增強其期望特征的修飾，例如結合或進入腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境或增強循環(huán)時間的能力、生物利用度、穩(wěn)定性或與erbb1陽性細胞靶向殺傷或erbb1陽性細胞成像相關的用途?？捎糜诒竟_的pepd蛋白質包括包含seqidno:1的多肽或其修飾，并且在一些實施方案中還包括在較大多肽的背景中的所述pepd多肽。對seqidno:1的修飾包括消除或減少酶活性的修飾和/或不影響修飾的pepd結合erbb1的能力的變化。因此，可以通過保守氨基酸取代修飾seqidno:1的pepd，所述取代通?；趓-基取代基的相對相似性。這種取代的非限制性實例包括但不限于gly或ser取代ala；lys取代arg；gln或his取代asn；glu取代asp；ser取代cys；asn取代gln；asp取代glu；ala取代gly；asn或gln取代his；leu或val取代ile；ile或val取代leu；arg取代lys；leu或tyr取代met；thr取代ser；tyr取代trp；phe取代tyr；和ile或leu取代val。因此，包含任何單一保守氨基酸取代或保守氨基酸取代的任何組合的pepd包括在本公開中，只要它們保持其erbb1結合性質，并且可以抑制erbb1陽性細胞的生長。因此，本公開包括包含seqidno:1或其修飾的多肽序列，并且可以包括進一步的修飾，包括但不一定限于另外的氨基酸，和/或通過作為與其他物質組合物的復合物的一部分提供。因此，pepd多肽可以是較大蛋白質(例如融合蛋白)的一部分，或者其可以連接到其他部分。因此，pepd蛋白可以與預期根據預防和/或治療erbb1陽性癌癥改善其功能能力的任何期望部分共價或非共價結合。

通常，可以使用常規(guī)技術制備pepd蛋白(并且如果需要的話，其被制成單個融合蛋白的多肽序列)。例如，在一些實施方案中，可以使用原核或真核表達系統(tǒng)制備pepd蛋白/融合蛋白。因此，本公開提供了優(yōu)于其他erbb1結合配偶體的制造優(yōu)勢，例如針對erbb1的mab，其成本昂貴且耗時。對于包含本文所述的pepd或由其組成的蛋白質的重組生產，通?？梢栽诒磉_載體中提供編碼pepd的任何多核苷酸?！氨磉_載體”是指包含與pepd編碼序列有效連接的蛋白質表達控制序列的載體。表達載體可以包含用于表達的順式作用元件，包括但不限于啟動子元件、增強子元件、復制起點、可選擇標記、轉錄起始位點、編碼翻譯起始位點的序列，以及蛋白質表達所需的任何其他序列，這取決于所選擇的表達系統(tǒng)?？梢栽O計用于表達編碼pepd的任何多核苷酸序列的合適的蛋白質表達載體(pepd編碼序列中的每一種都包括在本公開中)包括本領域已知的所有表達載體，其實例包括但不限于粘粒、質粒和引入編碼pepd的重組多核苷酸的基于病毒的系統(tǒng)。用于表達本發(fā)明的重組pepd蛋白的系統(tǒng)可以是任何合適的生物體，包括但不限于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)(例如，基于桿狀病毒的系統(tǒng))、酵母表達系統(tǒng)、植物細胞表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)。在一個實施方案中，使用大腸桿菌進行pepd表達。在一個實施方案中，使用哺乳動物表達系統(tǒng)重組表達pepd嵌合蛋白，使得嵌合蛋白包含人特異性糖基化。

在一個實施方案中，pepd蛋白可以與免疫球蛋白(ig)或其片段綴合以提供嵌合的pepd/ig分子。預期這樣的構建體可用于涉及個體免疫反應的多個方面，以促進靶向殺傷erbb1+細胞。免疫球蛋白或其片段可以是任何ig型或亞型。關于這一點，以前的研究表明抗體依賴性細胞毒性(通過fc受體介導)在曲妥珠單抗靶向erbb2陽性乳腺癌中起重要作用(clynes等人,naturemed,6,443-446,2000；spiridon等人,clincancerres,10,3542-3551,2004)。本公開還包括pepd-fc嵌合蛋白和包含其的藥物組合物。制備fc嵌合蛋白的方法是本領域已知的。例如，可從invivogene購得的pfuse-fc載體可用于產生pepd-fc融合雜交體。因此，在一個實施方案中，本公開包括包含融合蛋白的組合物，其中pepd在融合蛋白的組分中，并且其中所述融合蛋白包含人ig的fc區(qū)。在多個實施方案中，fc區(qū)是來自iga、igg或ige抗體的fc區(qū)或其片段，盡管也可以使用來自其他抗體類型的fc區(qū)或合成/人工fc區(qū)。在一些實施方案中，fc區(qū)是人igg2a或人igg1或這種fc區(qū)的片段。fc區(qū)可以包含與由哺乳動物(例如人)產生的fc區(qū)相同的氨基酸序列或由其組成。在多個實施方案中，fc區(qū)與由小鼠和/或人產生的fc區(qū)可以具有80％至100％(包括其間的所有整數)的氨基酸序列相似性。fc區(qū)可以是完整的fc區(qū)，意味著整個fc區(qū)，或者可以是fc區(qū)的片段。本領域技術人員將認識到，抗體的“fc區(qū)”是指抗體的“片段可結晶”區(qū)，其包含兩個重鏈，根據抗體類別貢獻兩個或三個恒定結構域(cd)。小鼠和人免疫球蛋白的編碼fc區(qū)的核苷酸序列以及fc區(qū)的氨基酸序列是本領域熟知的。在一個實施方案中，融合蛋白的fc部分僅包含抗體重鏈。本領域技術人員將認識到，為了使用鼠動物模型證明本發(fā)明，融合蛋白的fc部分可以是igg2a或igg2bfc小鼠ig部分，而為了治療和/或預防人疾病，fc部分優(yōu)選為igg1或igg3fc部分。在某些實施方案中，本文提供的融合蛋白的fc部分不包含抗原識別部分(即融合蛋白的抗體部分不包含抗體可變區(qū))。因此，融合蛋白與包含抗原結合部分的抗體不同?？梢允褂帽绢I域技術人員熟知的任何常規(guī)技術制備編碼fc-pepd融合蛋白的dna構建體。例如，可以使用市售試劑制備fc融合蛋白編碼構建體。例如，invivogen提供了通過將編碼給定蛋白質的序列融合到免疫球蛋白(ig)的fc區(qū)域來開發(fā)的用于促進fc融合蛋白質構建的質粒的pfuse-fc家族。在該構建體中，fc區(qū)包含igg重鏈的ch2和ch3結構域和鉸鏈區(qū)。鉸鏈充當fc融合蛋白的兩部分之間的柔性間隔物，其允許融合蛋白的每個部分根據需要獨立地起作用。

如上所述，本公開包括作為融合蛋白的組分的任何pepd蛋白，所述融合蛋白可以包括期望在與pepd蛋白相同的開放閱讀框中表達的任何其他氨基酸序列，并且可以包括但不限于不限于涉及促進蛋白質分離和/或純化、用于溶解度、分泌或任何其他功能的氨基酸序列。取決于待生產的特定融合蛋白，pepd多肽可以被配置在融合的開放閱讀框的n端或c端。例如，可以向pepd蛋白質提供組氨酸標簽，例如合適的多組氨酸標簽。在一些實施方案中，組氨酸標簽在序列中包含至少六個組氨酸。在一個實施方案中，他的標簽是六組氨酸肽序列。在一個實施方案中，如果需要，可以配置pepd表達系統(tǒng)，使得可以除去組氨酸標簽，例如通過包括煙草蝕刻病毒(tev)可切除的n-末端六組氨酸標簽。

在一些非限制性實施方案中，pepd多肽可與化學治療劑或具有細胞毒活性的任何其他試劑或可用于erbb1陽性細胞/組織的檢測和/或成像的試劑組合或偶聯(lián)。例如，pepd綴合物可以包含酶活性毒素及其片段或小分子。合適的酶活性毒素和小分子包括多西紫杉醇、米托蒽醌、紫杉烷、白喉a鏈、白喉毒素非結合活性片段、外毒素a鏈(來自綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a鏈、相思豆毒蛋白a鏈、非洲蒴蓮毒蛋白(modeccin)a鏈、α-帚曲霉素(alphasarcin)、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲林毒素(mitogellin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素(enomycin)和單孢霉烯族毒素(tricothecene)、微管靶向劑或任何抗血管生成劑。

可以使用任何合適的技術制備pepd蛋白和化學治療劑(或其它試劑，例如成像劑)的綴合物和組合。在多個實施方案中，pepd蛋白可以與化學治療劑分開生產，然后與其化學偶聯(lián)，或者在蛋白質試劑的情況下，pepd蛋白可以作為pepd/蛋白質融合物產生以產生新的嵌合蛋白。對于化學偶聯(lián)，可以使用各種雙官能蛋白偶聯(lián)劑，例如n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡喃基二硫醇)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基四氫噻吩(iminothiolane)(it)、亞胺酯的雙官能衍生物(如二甲基己二酰亞胺(dimethyladipimidate)鹽酸鹽)、活性酯(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(如戊二酸)、雙疊氮化合物(如雙(對疊氮苯甲酰)己二胺))、雙重氮衍生物(如雙(對重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)可用于共價連接pepd和化學治療劑或其它試劑，例如成像劑。

在另一個實施方案中，pepd可以與放射性試劑綴合。各種放射性同位素可用于與蛋白質綴合，使得可與pepd結合的erbb1陽性細胞或組織成像或選擇性地破壞。為了選擇性破壞細胞，肽可以與高度放射性的原子結合，如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素。為了鑒定erbb1陽性細胞，pepd綴合物可以包含用于閃爍照相研究的放射性原子，例如tc99m(亞穩(wěn)態(tài)锝-99)，i123或用于核磁共振和/或磁共振成像的自旋標記，例如i123、i131、in111、f19、c13、n15、o17或釓(gadlinium)(iii)或錳(ii)。放射性標簽可以以已知方式并入pepd蛋白質中。

pepd蛋白質可以通過將其與任何合適的藥學上可接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑組合而提供在用于施用的藥物組合物中。藥學上可接受的載體、賦形劑和穩(wěn)定劑的一些合適的實例可以在remington:thescienceandpracticeofpharmacy(2005)第21版,philadelphia,pa.lippincottwilliams&wilkins中找到。此外，任何合適的遞送載體可用于本發(fā)明，例如其中pepd在一段時間內釋放的控釋遞送制劑。如果需要，藥物組合物可以包含pepd和凝血抑制劑二者。

可以使用任何合適的施用途徑來施用包含本文所述的pepd的制劑，包括但不限于胃腸外、腹膜內、肺內、口服和腫瘤內。胃腸外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內和皮下施用。

包含在組合物中和/或用于所述方法的pepd和任何其它活性劑的量可以由本領域技術人員在考慮本公開的益處的情況下確定。因此，在一個實施方案中，施用有效量的本發(fā)明的組合物。有效量可以是抑制個體中表達erbb1的細胞的生長的組合物量，或延長個體的存活，或減輕與個體中erbb1的表達相關的疾病癥狀，或抑制過表達erbb1細胞的惡性表型的量。

在一些實施方案中，施用本發(fā)明組合物的個體被懷疑具有任何erbb1陽性癌癥或具有任何erbb1陽性癌癥發(fā)展和/或復發(fā)的風險。在多個實施方案中，erbb1陽性癌可以是任何癌癥類型，包括實體腫瘤或血癌，和/或轉移性癌癥，其具體實例包括但不限于纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假粘液瘤、淋巴管內皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、頭頸癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾斯氏腫瘤(wilns'tumor)、宮頸癌癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤(oliodendroglioma)、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胸腺瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom'smacroglobulinemia)和重鏈疾病。在一些實施方案中，erbb1癌癥是腦癌、乳腺癌、結腸癌、頭頸癌和肺癌。

在一些實施方案中，施用包含如本文所公開的pepd的組合物引起個體中癌細胞中erbb1單體的交聯(lián)，隨后是erbb1單體的內化和降解。

在某些實施方案中，根據本公開內容治療的個體將具有erbb1陽性癌細胞，并且可以具有或不具有erbb2陽性癌細胞。因此，在一些實施方案中，個體可以是erbb1+/ebrb2-或erbb1+/erbb2+。在一些實施方案中，根據本公開的方法治療的個體對靶向酪氨酸激酶或特異性靶向erbb1或erbb2的一種或多種藥物具有抗性。在一些實施方案中，個體對至少一種靶向erbb1結構域ii或iii中或erbb1激酶結構域的erbb1配體結合位點的藥劑具有抗性，包括但不限于結合激酶活性構象的藥劑，或結合只有當erbb1從其無活性狀態(tài)轉移到其活性狀態(tài)時才被瞬時暴露的表位的藥劑。在一些實施方案中，個體對至少一種靶向erbb1和erbb2的藥劑具有抗性。在一些實施方案中，個體對西妥昔單抗、帕尼單抗、mab528、吉非替尼、厄洛替尼、pd153035、ag1478、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼或阿法替尼中的至少一種具有抗性。

用于治療或預防目的的合適劑量可以由本領域技術人員確定，并且將至少部分地基于個體的年齡、性別、體型大小和健康，使用的遞送系統(tǒng)的類型，疾病的階段和對本領域技術人員將是顯而易見的其它因素。在一些實施方案中，人受試者的pepd給藥可以與西妥昔單抗相似或相同，通常為每周250-400mg/m²。

本公開的組合物可以與任何常規(guī)治療方案結合施用，包括順序或同時施用化學治療劑、被動免疫療法、疫苗、佐劑等。在一些具體實施方案中，所述方法可以與旨在治療與erbb1陽性細胞相關的疾病或病癥的常規(guī)療法結合進行。例如，本文所述的組合物的施用可以與治療方式組合，所述治療方式包括但不限于可在pepd施用之前，同時或之后進行的化學療法、外科手術和放射治療?？紤]到如上所述的耐藥性的可能性，在一些實施方案中，本公開包括使用包含pepd和另一種erbb1靶向劑的組合物，例如帕尼單抗、西妥昔單抗、吉非替尼、厄洛替尼或阿法替尼。在一些實施方案中，本公開包括包含pepd和臨床使用的雙重erbb1/erbb2激酶抑制劑拉帕替尼的組合物。在一些實施方案中，本公開包括使用包含pepd和曲妥珠單抗或另一種erbb2靶向劑的組合物。

在一些實施方案中，本公開包括組合物和用于使用組合物的方法，其中除了pepd蛋白之外，所述組合物還包含抗凝血劑。在一個實施方案中，抗凝血劑是抑制體內pepd降解的試劑，從而降低患者所需的pepd劑量。在一個實施方案中，抗凝血劑抑制凝血酶原轉化為凝血酶，或抑制凝血酶參與血塊形成。在一個實施方案中，抗凝血劑干擾稱為因子x和因子ii的凝血促進蛋白的凝血相關功能。在一些實施方案中，抗凝血劑結合并激活抗凝血酶iii，并且因此抑制凝血因子xa和iia。在一個實施方案中，抗凝血劑是肝素，例如未分級肝素制劑或肝素的低分子量形式。肝素的低分子量形式是本領域已知的(即weitzji；weitz,jeffreyi.(1997).“l(fā)ow-molecular-weightheparins”.nengljmed337(10):688–98)。在一個實施方案中，低分子量肝素是依諾肝素或其藥學上可接受的鹽，例如依諾肝素鈉。在一個實施方案中，抑制劑是口服或非口服的直接xa抑制劑，包括但不限于利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)或依度沙班(edoxaban)。在一個實施方案中，抗凝血劑是華法林或香豆素。在一個實施方案中，凝血抑制劑可以是其它凝血因子的抑制劑，所述凝血因子包括但不限于因子xii、xi、ix和vii。在一些實施方案中，使用任何合適的載體和施用途徑施用低分子量肝素或其它抗凝血劑。在一些實施方案中，抗凝血劑通過皮下注射施用。在一個實施方案中，抗凝血劑經口施用?？鼓獎┑膭┝靠梢曰趥€人接受者的體重和本領域技術人員在考慮本公開的益處的情況下認可的其它參數。在一些實施方案中，抗凝血劑可以在pepd組合物之前、同時或之后給予，并且可以以與pepd相同的次數或時間施用，或者可以根據不同于pepd施用的方案施用。

在另一個實施方案中，本公開提供了用于鑒定個體是否是用包含pepd的組合物治療的候選的方法。所述方法包括從個體獲得生物樣品，并確定樣品是否包含erbb1陽性癌細胞(包括相對于對照的erbb1過表達癌細胞或具有激活突變的erbb1)，其中確定生物樣品包含erbb1-陽性癌細胞表明個體是治療的候選。因此，在一些實施方案中，本公開提供用于幫助診斷，或用于診斷需要用包含pepd的組合物治療的個體。在一些實施方案中，所述方法包括將生物樣品中存在或不存在erbb1陽性癌細胞的決定傳達給醫(yī)療服務提供者，使得在一個實施方案中，醫(yī)療服務提供者可以推薦使用包含pepd的組合物進行治療。在一些實施方案中，所述方法還包括向個體施用包含pepd的組合物。

在某些實施方案中，確定erbb1陽性癌細胞的存在包括在個體或從個體獲得的生物樣品中檢測erbb1表達陽性的，或者相對于合適的參考過表達erbb1的，或者表達包含激活突變的erbb1的癌細胞。關于這一點，認為無論癌細胞中的erbb1的酪氨酸激酶活性是否是配體依賴性的，或因為任何原因而組成型激活，pepd仍然是抑制癌細胞生長的有效藥劑。因此，在某些實施方案中，個體可以具有僅響應于配體結合而顯示酪氨酸激酶活性的erbb1，或者由于例如激活突變而可顯示出組成型激活的酪氨酸激酶活性的erbb1的癌細胞。這樣的突變可以包括種系erbb1基因突變或在癌細胞中特異性的突變，并且可以相應于靶向erbb1的化學治療和/或生物制劑而產生，因此對這樣的藥劑的具有抗性。這樣的erbb1激活突變是本領域已知的。(參見例如，afgazdar,activatingandresistancemutationsofegfrinnon-small-celllungcancer:roleinclinicalresponsetoegfrtyrosinekinaseinhibitors(review)oncogene(2009)28,s24–s3)。通常，認為體細胞激活erbb1突變位于受體酪氨酸激酶(tk)結構域的atp結合口袋中。在一些實施方案中，erbb1基因的激活突變位于tk結構域的前四個外顯子(18至21)中。實例包括但不限于外顯子19的框內缺失，其通常包括氨基酸殘基亮氨酸-747至谷氨酸-749(δlre)，占所有erbb1tk突變的約44％。主要的單點突變存在于外顯子21，其導致精氨酸取代密碼子858處的亮氨酸(l858r)。認為這種突變在erbb1tk中具有任何單點激活突變具有最高普遍性，并且也被認為占所有erbb1tk激活突變的約41％?？傊?，認為外顯子19中的缺失和l858r的點突變占所有erbb1激活突變的約90％，并且在本領域中有時被稱為“經典”激活突變。其它激活突變包括甘氨酸-719(g719)變?yōu)榻z氨酸、丙氨酸或半胱氨酸(所有erbb1tk激活突變的4％)。其它突變包括錯義突變，其被認為占erbb1突變的另外6％。外顯子20中的額外的框內重復和/或插入也是已知的，并且認為占erbb1tk激活突變的剩余5％。此外，已經以低頻描述了各種其它激活突變，包括但不一定限于外顯子20中的v765a和t783a(<1％)。

在一個實施方案中，鑒定個體是否是用包含pepd的組合物治療的候選的方法包括從個體獲得生物樣品，并且通過使樣品與可檢測標記的pepd接觸來確定樣品是否包含erbb1陽性癌細胞和/或過表達erbb1。檢測erbb1+和可檢測標記的pepd的復合物表明個體是用如本文所述包含pepd的組合物治療的候選。在一個實施方案中，在懷疑包含erbb1陽性細胞的腫瘤的活檢上檢測erbb1+和可檢測標記的pepd的復合物。在替代實施方案中，可以通過使用可檢測標記的pepd結合配偶體來檢測與erbb1陽性細胞結合的pepd。在一些實施方案中，erbb1陽性癌細胞表達比參考更多的erbb1。所述參考可以是任何合適的參考，例如匹配的對照、標準化值(即曲線下面積)和/或由樣品中相同組織類型的細胞表達的erbb1量的值，其中所述erbb1細胞不是癌細胞。通常，在某些實施方案中，使用與用于鑒定個體是其它抗erbb1藥劑(西妥昔單抗或酪氨酸激酶抑制劑)的治療的候選相同或相似的標準進行人受試者是pepd制劑治療的候選的鑒定，前者基于臨床建立的參數并且將是本領域技術人員已知的。

在一些實施方案中，本公開還提供了包含pepd藥物制劑的產品，例如制品。產品包含分離和/或純化的pepd。pepd可以是酶活性或非活性形式的pepd。制品包括包裝和/或印刷材料。在一個實施方案中，本公開包括含有pepd制劑的封閉或密封包裝。在某些實施方案中，包裝可以包括一個或多個封閉或密封的小瓶、瓶子、泡罩(泡沫)包裝或用于銷售、分配或使用pepd藥劑的任何其它合適的包裝。印刷材料可以包括印刷信息。印刷信息可以提供在標簽上或紙插入物上，或印刷在包裝材料本身上。印刷信息可以包括識別包裝中的pepd劑、其它活性和/或非活性成分的量和類型的信息，以及用于服用組合物的說明書，例如在給定時間段內施用的劑量數量，和/或指向藥劑師和/或其它醫(yī)療服務提供者(例如醫(yī)師)或患者的信息。試劑盒可以包括并且印刷的信息可以鑒定單獨提供或與pepd試劑組合提供的另外的試劑，例如凝血抑制劑。印刷材料可以包括pepd藥物組合物和/或試劑盒提供的任何其它試劑用于治療erbb1陽性癌癥的指示。產品可以作為試劑盒提供，其包含治療有效量的包裝在容器中的pepd，試劑盒還包括附著于容器或與該容器一起包裝的標簽，該標簽描述容器的內容物并提供關于使用容器內容物治療erbb1陽性癌癥的指示和/或說明。

以下實施例旨在說明而不是限制本發(fā)明。

實施例1

該實施例證明人pepd和pepd^g278d各自與人erbb1的胞外結構域結合并交聯(lián)兩個erbb1單體。

在存在或不存在47.5倍過量的牛血清白蛋白(bsa；19nmol/ml)下，將重組人pepd(rhpepd，0.4nmol/ml)與人erbb1胞外結構域和人igg1的fc片段的重組嵌合體(egfr-fc，0.04nmol/ml)一起孵育，或者將其與作為對照的人igg1的fc(0.04nmol/ml)孵育，隨后用蛋白a瓊脂糖珠和蛋白質印跡拉開。如圖1a所示，rhpepd與erbb1結合但不結合fc，并且結合不受bsa影響。在存在或不存在重組人egf(+，5pmol/ml；++，50pmol/ml)下，rhpepd(1nmol/ml)還與egfr-fc(0.04nmol/ml)一起孵育。egf是egfr/erbb1的高親和力配體。然而，低濃度的egf似乎不干擾rhpepd與egfr/erbb1的結合，在高濃度下，其顯著地阻斷rhpepd與egfr/erbb1的結合。這些結果表明rhpepd特異性地結合erbb1的胞外結構域。

在使用上述egfr-fc的elisa中，rhpepd以劑量依賴性方式和典型的受體-配體結合模式與之結合，估計kd值為392.6nm(圖1b)。

小鼠骨髓32d細胞不表達任何erbb1或任何其它erbb。通過基因轉染和克隆選擇產生穩(wěn)定表達人erbb1(32d/erbb1)的32d細胞。用載體、rhpepd或rhpepd^g278d(5nm)處理32d/erbb1細胞，然后用交聯(lián)劑bs3處理(2mm，30分鐘)；免疫印跡細胞裂解物用于erbb1。如圖1c所示，這些細胞中大多數erbb1分子以單體形式存在(單體分子量為175kd)，但也檢測到一些erbb1二聚體，后者可能是erbb1過表達的結果。rhpepd和rhpepd^g278d兩者均以同源二聚體(二聚體分子量為108kd)結合erbb1，首先形成異源三聚體(1個erbb1單體與rhpepd或rhpepd^g278d的1個二聚體連接)，然后形成異源四聚體(2個erbb1單體與rhpepd或rhpepd^g278d的1個二聚體連接)(圖1c)。還檢測到不含pepd的erbb1二聚體水平的增加，這可能是由bs3蛋白質不完全交聯(lián)引起的。

值得注意的是，盡管如圖1b所示的kd值為392.6nm，但是5nm的pepd和pepd^g278d兩者均快速地結合并交聯(lián)erbb1。這表明在無細胞系統(tǒng)體外測量的pepd或pepd^g278d對erbb2的結合親和力不能完全反映其在細胞表面的相互作用。

實施例2

該實施例證明rhpepd和rhpepd^g278d初始刺激erbb1，但后來抑制它。

用rhpepd或rhpepd^g278d以每種5nm處理過表達erbb1而不是其它erbb的32d/erbb1細胞長達24h。然后收集細胞，通過蛋白質印跡分析細胞裂解物的erbb1水平和磷酸化erbb1水平(測量酪氨酸1173處的磷酸化)。這兩種藥物最初均引起erbb1磷酸化，可能是由于其與erbb1單體的交聯(lián)，但隨后erbb1消耗，可能是由于配體結合受體的內化，隨后降解。

實施例3

該實施例表明rhpepd和rhpepd^g278d兩者均破壞erbb1-erbb2異二聚體相互作用。

對于其它erbb，erbb2是熟知優(yōu)選的異二聚體配偶體。在過表達erbb1和erbb2兩者而不表達其它erbb的細胞(cho-k1/erbb1+erbb2)中，rhpepd(5nm)引起erbb1和erbb2兩者的快速酪氨酸磷酸化，隨后erbb1和erbb2兩者下調，其中erbb2下調比erbb1下調發(fā)生得快得多(圖3a)。與erbb2下調速度相比，erbb1下調速度相對較慢可能與其內化和降解的差異有關。

接下來，用溶劑、rhpepd或rhpepd^g278d(5nm)處理cho-k1/erbb1+erbb2細胞1h，用或不用egf預處理(20nm，15分鐘)。使用erbb2抗體或erbb1抗體對細胞裂解物進行免疫沉淀，然后進行免疫印跡。即使rhpepd和rhpepd^g278d都與erbb1和erbb2結合，但是兩種藥物都會破壞erbb1-erbb2結合，不管異源二聚體是自發(fā)形成還是被egf刺激(圖3b，3c)。此外，這兩種試劑都使egf結合的erbb1與erbb2分離(圖3c)。

值得注意的是，對于圖3b所示的免疫印跡，將樣品裝載調整為含有等量的erbb2。為了對比，在圖3c中示出了進行和不進行erbb2裝載調整的免疫印跡的實例。

實施例4

本實施例說明了rhpepd或rhpepd^g278d與erbb1或erbb2的相互作用。

pepd結合并交聯(lián)erbb1，引起erbb1的二聚化、瞬時磷酸化和降解(圖4a)。erbb1和erbb2在過表達時形成磷酸化的異源二聚體。雖然pepd可以與erbb1和erbb2兩者結合，但它們不會交聯(lián)erbb1和erbb2。相反，pepd通過交聯(lián)兩個erbb1單體和兩個erbb2單體來破壞erbb1-erbb2異源二聚化，導致受體內化和降解(圖4b)。egf結合erbb1并促進erbb1-erbb2異源二聚化，但是pepd通過與復合物中的erbb2結合并迫使erbb2二聚化、內化和降解來破壞這種異源二聚化。然而，有證據表明，pepd可能無法與egf競爭而與erbb1結合。

實施例5

該實施例表明pepd^g278d抑制具有活化突變的表達erbb1、erbb1和erbb2或erbb1的多種人類癌癥細胞系的生長。

所評估的細胞系包括穩(wěn)定地過表達人erbb1的cho-k1細胞(cho-k1erbb1細胞)、穩(wěn)定地過表達人erbb1和人erbb2兩者的cho-k1細胞(cho-k1erbb1/erbb2細胞)、過表達人erbb1的人表皮樣癌a431細胞和表達erbb1酪氨酸激酶結構域中的活化突變(e746-a750缺失)的人肺腺癌hcc827細胞。將細胞在96孔板中生長過夜，然后用溶劑或rhpepd^g278d處理24、48或72小時，然后通過mtt測定法測量細胞增殖。我們以rhpepd^g278d為中心，由于如前所述的這種藥物比rhpepd作為潛在的治療劑更有吸引力。rhpepd^g278d以劑量依賴的方式抑制每種細胞系的增殖，并且在用rhpepd^g278d以250nm處理72小時后，細胞增殖抑制了85-95％(圖5)。

實施例6

該實施例表明pepd^g278d不抑制不表達erbb1的細胞，并且在表達中等水平的erbb1的細胞中，pepd^g278d對細胞增殖產生雙相作用(初始刺激，隨后抑制)。

cho-k1細胞不表達erbb1、erbb3和erbb4，而是表達微量水平的erbb2(圖7)。用rhpepd^g278d處理cho-k1細胞72小時，但沒有抑制細胞生長(圖6b)。

hepa1c1c7細胞表達中等水平的erbb1和一些erbb2(圖7)。用rhpepd^g278d處理這些細胞24、48和78小時。24小時處理后，細胞增殖增加高達21.4％，但是處理48-72小時后，細胞增殖降低至66.5％。

實施例7

該實施例表明rhpepd^g278在抑制erbb1和erbb2方面是非常有效的，不管癌癥細胞系怎樣。

cho-k1/erbb1細胞、cho-k1/erbb1+erbb2細胞、a431細胞和hcc827細胞都過表達erbb1，具有顯著的erbb1磷酸化，而hepa1c1c7細胞表達中等水平的erbb1和低erbb1磷酸化，并且cho-k1細胞不具有erbb1(圖7a)。

cho-k1/erbb1+erbb2細胞也過表達erbb2，具有顯著的erbb2磷酸化。hcc827細胞表達中等水平的erbb2，具有顯著的erbb2磷酸化。cho-k1/erbb1細胞、a431細胞、hepa1c1c7細胞和cho-k1細胞顯示erbb2和erbb2磷酸化的表達低至非常低(圖7a)。

用5和25nm的rhpepd^g278d處理包括cho-k1/erbb1細胞、cho-k1/erbb1+erbb2細胞、a431細胞、hcc827細胞和hepa1c1c7細胞的細胞24小時，引起所檢測的所有細胞系中的erbb1和erbb2兩者明顯的和劑量依賴性下調以及磷酸化的erbb1和erbb2損失(圖7b，7c)。

在a431細胞中檢查了rhpepd^g278d對erbb1下游信號分子的作用。雖然rhpepd^g278d對akt、胞外信號調節(jié)激酶(erk)或信號轉導及轉錄激活因子3(stat3)的表達水平沒有影響，但它引起了所有三種蛋白質的去磷酸化(失活)。這些改變與rhpepd^g278d對erbb1及erbb2的抑制一致。

實施例8

該實施例表明依諾肝素(ep)在體內抑制rhpepd降解，并且ep與rhpepd或rhpepd^g278d的組合明顯地提高了后者的血漿濃度。

通過腹膜內給予10mg/kg的rhpepd，可以在小鼠中實現rhpepd的治療相關血漿濃度(圖8a)。然而，以2.5mg/kg的ep腹膜內預處理，允許rhpepd劑量降低至少50倍，而不降低其血漿濃度(圖8b)。ep是臨床使用的低分子量肝素(lmwh)。ep還顯著增加小鼠內源性pepd的血漿水平(圖8b)。我們后來發(fā)現，每天0.5mg/kg的ep劑量足以提高血漿pepd水平(圖8c)。已知包括ep的lmwh通過結合和活化抗凝血酶，絲氨酸蛋白酶抑制劑而抑制幾種凝血蛋白酶，包括因子xa和iia。我們未發(fā)表的觀察結果表明，ep通過新的蛋白水解途徑抑制pepd蛋白水解，其包括血漿中的凝血蛋白酶，包括因子xii、xi、ix、x、ii和vii。因此，除了ep之外，抑制一種以上的上述凝血蛋白酶的其它抗凝劑也可以在體內阻斷rhpepd和rhpepd^g278d的降解。

實施例9

該實施例表明rhpepd和rhpepd^g278d兩者均能抑制小鼠的腫瘤生長，但是rhpepd^g278d顯示更有利的結果。

我們使用原位bt-474乳腺癌模型評估了pepd的抗腫瘤活性。將人乳腺癌bt-474細胞接種到雌性無胸腺小鼠的乳腺脂肪墊上。在腫瘤大小達到230mm³后開始治療。用載體、ep、ep加rhpepd或ep加rhpepd^g278d處理小鼠。每天給小鼠腹膜內給藥ep0.5mg/kg，持續(xù)4天之后是rhpepd或rhpepd^g278d。兩次以2mg/kg將rhpepd或rhpepd^g278d腹膜內給藥至小鼠，每次分隔2天。在每次治療的最終劑量后24小時殺死小鼠，并且在那時獲得腫瘤和血液樣品。在僅僅使用兩次劑量的rhpepd或rhpepd^g278d治療后，腫瘤分別地縮小到對照的42.2％或37.3％(圖9a)。ep不僅影響腫瘤組織中的腫瘤生長而且影響erbb信號傳導，而pepd的腫瘤抑制與erbb2和erbb1的明顯消耗和去磷酸化以及包括src、akt、胞外信號調節(jié)激酶(erk)和信號轉導及轉錄激活因子3(stat3)的關鍵下游信號的去磷酸化(失活)有關(圖9b)。bt-474腫瘤中還存在低水平的erbb3；兩種藥物都減少了erbb3酪氨酸磷酸化，但沒有減少其表達(圖9b)，這與我們發(fā)現pepd不是erbb3的配體而是破壞erbb1或erbb2的異源二聚化是一致的。盡管在結合活化的erbb1或erbb2后才活化src，但在erbb1-或erbb2-過表達的癌細胞中的磷酸肌醇3-激酶(pi3k)活化和信號傳導取決于其對erbb異源二聚體中的活化erbb3的補充。因此，兩種藥物均強烈地抑制腫瘤組織中的src激酶活性和pi3k活性(圖9c，9d)。在腫瘤組織中，每種試劑還下調了抗凋亡b細胞淋巴瘤2(bcl-2)，上調了促凋亡bcl-2相關x蛋白(bax)和活化的caspases-3/-8/-9(圖9b)。然而，在腫瘤組織中，rhpepd而非rhpepd^g278d刺激缺氧誘導因子1α(hif-1α)及其下游靶標，包括血管內皮生長因子(vegf)和葡萄糖轉運蛋白1(glut-1)。rhpepd或hif-1α，vegf和glut-1的作用可能源于rhpepd在其內化后對亞氨基二肽的新陳代謝以及代謝物對hif-1a降解的抑制(surazynski等人，internationaljournalofcancer，122，1435-1440，2008)。rhpepd和rhpepd^g278d都積聚在腫瘤組織中。

實施例10

該實施例表明rhpepd^g278d在體內強烈地抑制erbb1過表達的腫瘤。

我們進一步評估了rhpepd^g278d在過表達erbb1的頭頸癌的小鼠皮下模型中的抗腫瘤活性。將人a341癌細胞皮下接種到雄性無胸腺小鼠的側腹(每個位點2.7×10⁶個細胞)。然后將小鼠隨機分為三個實驗組：無治療、ep和ep加rhpepd^g278d。當腫瘤體積達到約40mm³時開始ep治療(每天腹膜內0.5mg/kg)。五天后，腫瘤體積達到約100mm³，并且ep治療的小鼠也開始每隔一天用溶劑或rhpepd^g278d(4mg/kg)進行治療。當腫瘤大小達到約450mm³時，用rhpepd^g278d(每隔一天4mg/kg，總共2次)治療一些ep治療的小鼠。

在用4mg/kg的rhpepd^g278d與ep組合治療的小鼠中達到高血漿濃度的rhpepd^g278d(圖10a)。

如圖10b所示，當ep對腫瘤生長沒有影響時，rhpepd^g278d對抑制腫瘤生長非常有效。當腫瘤相對較小(約100mm³)時，rhpepd^g278d在第一次給藥后完全停止了腫瘤生長，并且當腫瘤相對較大(約450mm³)時，rhpepd^g278d在第一次給藥后產生了深遠意義的腫瘤消退。此外，雖然ep對腫瘤組織中的erbb1和其它信號分子沒有影響，但是rhpepd^g278d將erbb1和erbb2兩者均下調，導致腫瘤組織中的erbb1和erbb2兩者均去磷酸化(失活)，以及akt、erk和stat3去磷酸化(圖10c)。由rhpepd^g278d誘導的腫瘤組織中的分子變化與培養(yǎng)的a431細胞中的分子變化相同(圖7c)。

小鼠沒有表現出毒性跡象，并且ep和rhpepd^g278d均對體重增加沒有任何影響(圖10d)。

實施例11

本實施例提供了用于獲得實施例1-10中描述的數據的材料和方法的說明。

試劑。如前所述(yang等人，journalofbiologicalchemistry，288，2365-2375，2013)產生rhpepd和rhpepd^g278d(標記到羧基末端的6×his)。人igg1的重組fc、重組egfr-fc(人egfr胞外結構域(met¹-ser⁶⁴⁵)和人igg1的fc片段的嵌合體)和重組egf來自于r&dsystems。ep和甲基噻唑基二苯基四唑鎓溴化物(mtt)分別購買自賽諾菲-安萬特(sanofi-aventis)和西格瑪-奧德里奇(sigma-aldrich)。

使用以下抗體：抗-pepd(abcam)、用于檢測fc的抗-人igg1(santacruz)、抗-egf(r&dsystems)、抗-erbb1(cellsignaling)、抗-p-erbb1(y1173)(cellsignaling)、抗-erbb2(cellsignaling)、抗-p-erbb2(y1221/1222)(cellsignaling)、抗-akt(cellsignaling)、抗-erbb3(santacruz)、抗-p-akt(cellsignaling)、抗-erk(cellsignaling)、抗-p-erk(cellsignaling)、抗-src(cellsignaling)、抗-p-src(cellsignaling)、抗-stat3(cellsignaling)、抗-p-stat3(cellsignaling)、抗-caspase-3(cellsignaling)、抗-切割的caspase-8(cellsignaling)、抗-切割的caspase-9(cellsignaling)、抗-bcl-2(cellsignaling)、抗-bax(cellsignaling)、抗-vegf(santacruz)、抗-glut-1(santacruz)、抗-hif-1α(santacruz)、抗-gapdh(millipore)、生物素綴合的抗-his(bethyl)、hrp綴合的鏈霉親和素(thermoscientific)和山羊抗兔igg-hrp(jacksonimmunoresearch)。

細胞系、細胞培養(yǎng)和基因轉染。由美國食品和藥物管理局的gibbesrjohnson提供具有野生型人egfr/erbb1穩(wěn)定表達的32d細胞(32d/erbb1)。將32d/erbb1細胞培養(yǎng)在補充有10％胎牛血清(fbs)、5％wehi-3b細胞調節(jié)培養(yǎng)基和0.1％的2-巰基乙醇的rpmi1640培養(yǎng)基中。將人乳腺癌mcf-7細胞(atcc)培養(yǎng)在高葡萄糖dmem加10％fbs中。將bt-474細胞(atcc)培養(yǎng)在50％高葡萄糖dmem/50％f-12k培養(yǎng)基和10％fbs中。如下所述，將過表達erbb1、erbb2或erbb1加erbb2的cho-k1細胞(atcc)以及cho-k1亞克隆培養(yǎng)在f-12k培養(yǎng)基加10％fbs中。將hcc827細胞(atcc)培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基和10％fbs中。將a-431細胞培養(yǎng)在50％dmem/50％f-12k培養(yǎng)基加10％fbs中。將所有細胞系培養(yǎng)在具有5％co2的濕潤的37℃培養(yǎng)箱中。

通過用pcdna-erbb2轉染cho-k1細胞并在g418下選擇產生穩(wěn)定過表達人erbb2的cho-k1/erbb2細胞。為了瞬時過表達人erbb1，用pcmv6-xl5-erbb1轉染cho-k1細胞或cho-k1/erbb2細胞。使用在6孔板和fugenehd(promega)中生長的細胞進行瞬時基因轉染。

蛋白質印跡分析。通過胰蛋白酶處理和離心從培養(yǎng)物中收集細胞。用pbs洗滌兩次后，在補充有2mm的苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑混合物(rocheappliedscience)的1×細胞裂解緩沖液(cellsignaling)中將細胞裂解。通過超聲處理增強細胞裂解。通過在4℃下以13,000×g離心10分鐘來清除樣品。將腫瘤組織與來自羅氏(roche)的補充有蛋白酶抑制劑混合物的ripa緩沖液(25mmtris-hcl，ph7.6，150mmnacl，1％np-40，1％脫氧膽酸鈉，0.1％sds)混合，并在dounce勻漿器中敲擊，并且通過在4℃下以13,000×g離心15分鐘來清除勻漿。通過bca測定試劑盒(pierce)測量所有試樣的蛋白質濃度。將樣品與4×裝載染料混合，在95℃加熱5分鐘，并且通過sds-page(8-10％)溶解。將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上并用特異性抗體探測，并且使用eclplus試劑盒(amersham)或supersignalwestpico試劑盒(thermoscientific)檢測蛋白質條帶。

為了檢測rhpepd或rhpepd^g278d與活細胞中的erbb1的結合，用每種試劑或溶劑處理細胞，然后用冰冷的pbs洗滌或在室溫下用2mm的交聯(lián)劑bs3(pierce)孵育30分鐘。通過加入50mmtris(最終，ph7.5)終止交聯(lián)反應，然后在室溫下孵育15分鐘。通過蛋白質印跡(3.5％sds-page)分析細胞裂解物。

免疫沉淀。為了檢測rhpepd與erbb1的直接和特異性結合，在存在或不存在bsa(19μm)或egf(5或50nm)下，在具有egfr-fc(0.04μm)或fc(0.04μm)的m-per緩沖液中在37℃下將rhpepd(0.4μm)孵育1小時，然后在4℃下過夜，隨后在室溫下與蛋白質a-瓊脂糖凝膠孵育1小時。用免疫沉淀洗滌緩沖液洗滌小珠，并進行蛋白質印跡分析。在使用細胞裂解物的實驗中，在補充有蛋白酶抑制劑混合物(rocheappliedscience)的m-per緩沖液(thermoscientific)中將細胞裂解。細胞裂解物(在0.5ml結合緩沖液中0.5mg總蛋白)與抗體在4℃下孵育過夜。由蛋白g-瓊脂糖將免疫復合物拉開(室溫下孵育1小時)。用ip洗滌緩沖液洗滌小珠，然后進行蛋白質印跡分析。

用于測量血漿pepd濃度和pepd與erbb1結合親和力的elisa。為了測量pepd濃度，將96孔elisa板在4℃下用100μl/孔稀釋的抗-pepd小鼠單克隆抗體(2.5μg/ml)包被過夜。然后將板用含有吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(pbst)洗滌三次，并用200μl/孔的封閉緩沖液封閉(室溫孵育至少2小時)。將板用pbst洗滌，然后用100μl/孔的適當稀釋的pepd標準品或樣品在室溫下孵育2小時。將板用pbst洗滌三次，然后將各孔與100μl檢測抗體(抗-pepd兔多克隆抗體)在室溫下孵育2小時。將板用pbst洗滌3次后，向各孔中加入100μl的二次試劑(山羊-抗-兔igg-hrp，1:2500稀釋)，然后在室溫下孵育1小時。再次將板用pbst洗滌三次，然后將每個孔與100μl的hrp底物溶液(來自cellsignaling的tmb底物，#7004)一起孵育。在適當的顯色后，向每個孔中加入100μl的終止溶液(cellsignaling，#7002)，用微量滴定板讀數儀記錄450nm處的吸光度。將純pepd作為標準。

為了測量與egfr結合的pepd或egf，將96孔elisa板在4℃下用100μl/孔的山羊-抗-人iggfc(10μg/ml)包被過夜。用pbst洗滌三次后，用300μl/孔的測定緩沖液(1％bsa/pbs)在室溫下孵育2小時使孔中殘留的蛋白質結合位點飽和。除去測定緩沖液后，向每個孔中加入60μl的rhpepd，然后向每個含rhpepd的孔中加入60μl的egfr-fc(1μg/ml)，并在37℃下孵育2小時。然后將板用pbst洗滌三次，向每個孔中加入100μl的生物素綴合的山羊-抗-his(1:10000稀釋液)，并在室溫下孵育2小時。用pbst洗滌另一輪后，向每個孔中加入100μl的鏈霉抗生物素蛋白綴合的hrp(1:10000稀釋液)，并在室溫下孵育45分鐘。用pbst再次洗滌孔，通過加入100μl/孔的tmb溶液作為過氧化物酶底物來檢測結合的hrp。通過加入100μl/孔的終止液終止反應，并通過微量滴定板讀數儀記錄450nm處的吸光度讀數。

pi3激酶測定。使用pi3激酶活性elisa試劑盒(echelon，k-1000s)。簡言之，使用pi3k抗體(抗pi3kp85)從全細胞裂解物(由每個樣品約1×10⁶個細胞制備)中將pi3k拉開，將免疫沉淀物與30μlkbz反應緩沖液混合，然后將其與30μl的10μmpi(4,5)p2底物混合，隨后在37℃下孵育2小時。通過向每個反應溶液中加入90μl激酶終止液終止激酶反應，并用與60μlpip3檢測劑將60μl的每種停止的激酶反應溶液一起轉移到培養(yǎng)板中的每個孔中。在室溫下孵育60分鐘后，將來自培養(yǎng)板的100μl的每種樣品轉移到檢測板的相應孔中，并在室溫下孵育60分鐘。用tbst洗滌板，然后與hrp綴合的二次檢測劑一起孵育30分鐘，然后用tbst洗滌，使用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺作為底物，通過標準比色法測定固定化的hrp。

src激酶測定。使用通用酪氨酸激酶測定試劑盒(takara，#mk410)測定細胞裂解物中的src活性。簡言之，在具有src抗體的ip之前，用蛋白a-瓊脂糖珠將裂解物(由每個樣品約1×10⁶個細胞制備)預清除。洗滌免疫沉淀物，并與150μl激酶反應溶液中的10mmβ-巰基乙醇孵育。將每個樣品(40μl)與10μl的40mmatp-2na溶液混合，將其轉移到包被有ptk底物的微量滴定板孔中，然后在37℃下孵育30分鐘。在用tbst洗滌后，向每個孔中加入hrp-綴合的抗磷酸酪氨酸(py20)溶液，并在37℃下孵育30分鐘。用tbst洗滌另一輪后，使用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺作為底物，通過標準比色法測定固定化的hrp。

mtt細胞增殖測定。細胞在96孔板(150μl培養(yǎng)基/孔)中生長過夜，然后用載體orrhpepd^g278d處理長達72小時，然后在37℃下與mtt(培養(yǎng)基中，9.2mm)一起孵育3小時。除去培養(yǎng)基后，用二甲基亞砜(150μl/孔)處理細胞，并在570nm處光譜測定由mtt形成的甲(與細胞密度成正比)。

動物研究。使用不育小鼠(harlanlaboratories)用于研究。按照羅斯維爾癌癥中心(roswellparkcancerinstitute)的實驗動物護理和使用委員會(theinstitutionalanimalcareandusecommittee)批準的方案進行所有動物實驗。以原位乳腺腫瘤模型評估了rhpepd，然而以原位乳腺腫瘤模型以及以皮下表皮腺癌模型評估了rhpepd^g278d。

為了建立原位乳腺腫瘤，我們將雌性無胸腺小鼠(6-7周齡)皮下地植入1.7mg的60天釋放的17β-雌二醇丸(innovativeresearchofamerica)，并在2天后將bt-474細胞接種到于100μl的pbs-matrigel混合物(1:1)中的每個位點2×10⁶的乳腺脂肪墊。允許腫瘤達到約230mm³。然后用載體、ep、ep加rhpepd、ep加rhpepd^g278d處理小鼠。我們腹膜內給予ep(0.5mg/kg)每天一次，持續(xù)7天，并且在ep治療的第五天和第七天，我們還腹膜內給予2mg/kg的rhpepd或rhpepd^g278d。在最終治療后24小時使小鼠死亡。在同時給予ep和rhpepd或rhpepd^g278d的天數內，ep始終比其它藥物提前1小時給予。給予在pbs中的ep、rhpepd和rhpepd^g278d(100μl/20g體重)。我們使用長×寬²/2計算腫瘤大小。使用canoneosdigitalrebelxsi攝像機拍攝腫瘤圖像。

為了建立皮下a431腫瘤，我們以每個位點100μl無血清培養(yǎng)基中的2.7×10⁶個細胞，皮下地接種a431細胞至雄性無胸腺小鼠(5周齡)的側腹。將小鼠隨機分為三組：無治療、ep或ep加rhpepd^g278d。當腫瘤體積達到約40mm³時，開始ep治療(每天腹膜內0.5mg/kg)。五天后，當腫瘤體積達到約100mm³時，繼續(xù)ep治療，同時每隔一天還用載體或rhpepd^g278d(4mg/kg)處理小鼠。當腫瘤大小達到約450mm³時，用rhpepd^g278d(4mg/kg，每次隔一天，共兩次劑量)治療一些經ep治療的小鼠。在將ep和rhpepd^g278d兩者均給予至小鼠的天數內，ep始終比另一種藥物提前1小時給予。給予在pbs中的ep和rhpepd^g278d(100μl/20g體重)。在最后一次治療后24小時的小鼠或同時從未治療的小鼠獲得血液樣品以及腫瘤。通過elisa測定內源性小鼠pepd和/或rhpepd^g278d的血漿濃度。

統(tǒng)計分析。anova用于多組比較。0.05以下的p值認為是統(tǒng)計學顯著的。

雖然已經就一個或多個特定的實施方案描述了本發(fā)明，但是應當理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進行本發(fā)明的其它實施方案。因此，認為僅由所附權利要求及其合理解釋來限制本發(fā)明。