本申請要求于2014年5月9日提交的美國臨時專利申請No.61/991,423和于2014年5月12日提交的美國臨時專利申請No.61/992,152的優(yōu)先權(quán)，所述臨時專利申請的全部內(nèi)容以引用的方式納入本文。

基金信息

本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院所授予的基金No.CA034196、HLO77642和DK057199的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本文總體上記載了用于鑒定改變iRhom多肽活性的化合物的方法及其用途。根據(jù)具體的方面，本文公開了用于鑒定調(diào)節(jié)iRhom多肽的蛋白水解活性(例如，增大、刺激、降低、抑制或消除iRhom多肽的蛋白水解活性)的化合物的方法，以及其用途。

背景技術(shù)：

菱形蛋白酶(rhomboid protease)是幾乎存在于所有物種中的酶家族。菱形蛋白酶是膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶，菱形蛋白酶的蛋白水解裂解作用對細胞調(diào)控是重要的。膜內(nèi)蛋白酶的活性位點埋在細胞膜的脂雙層中，并且它們在其他跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)裂解這些跨膜蛋白。

無活性的菱形蛋白酶(iRhom)是高度保守的膜內(nèi)蛋白。在本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)之前，人們認為iRhom由于在推定的活性位點缺少絲氨酸殘基而無蛋白水解活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：iRhom是短壽命蛋白，但是顯性突變增加它們的蛋白穩(wěn)定性并刺激不依賴于金屬蛋白酶活性的特定的EGF家族配體雙調(diào)蛋白的分泌。另一方面，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：哺乳動物iRhom在調(diào)節(jié)EGFR信號傳導(dǎo)事件中發(fā)揮作用，所述EGFR信號傳導(dǎo)事件促進傷口加速愈合并引發(fā)腫瘤發(fā)生。另一方面，本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：iRhom能夠與金屬蛋白酶并行調(diào)節(jié)EGFR信號傳導(dǎo)，并且在受損的傷口愈合和癌癥中可用作治療靶標。

一方面，本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物激活iRhom多肽對底物的蛋白水解活性，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；以及b)測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加表明所述化合物激活了iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。

另一方面，本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物能夠在受試者中加速傷口愈合或組織修復(fù)，所述方法包括：使表達iRhom多肽和EGFR配體的細胞與測試化合物接觸；b)測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加；以及c)測定細胞分泌的EGFR配體相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加和細胞分泌的EGFR配體的增加表明所述化合物能夠加速傷口愈合。

另一方面，本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；b)測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加表明所述化合物抑制iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

在一個實施方案中，所述方法還提供了通過分析暴露于所述化合物后iRhom多肽的半衰期來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。

在一些實施方案中，所述底物是EGFR配體或EGF樣底物。

在另一個實施方案中，通過檢測EGFR配體分泌的增加來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。在另一個實施方案中，通過檢測可溶性EGFR配體水平的增加來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。在一些實施方案中，所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

在另一個實施方案中，通過檢測EGFR信號傳導(dǎo)活性的增加來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的化合物抑制iRhom多肽和蛋白酶體之間的相互作用。

在另一個實施方案中，所述化合物使iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域失活。在一些實施方案中，所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的失活是短暫的。

在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物使iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域裂解和/或缺失，以使所述多肽具有蛋白水解活性或改變的生物活性。在一些實施方案中，小鼠iRhom2在第1至268位氨基酸殘基之間被裂解，或人iRhom2在第1至298位氨基酸殘基之間被裂解。在其他實施方案中，小鼠iRhom1在第1至272位氨基酸殘基之間被裂解，或人iRhom1在第1至316位氨基酸殘基之間被裂解。在另一個實施方案中，所述化合物激活iRhom多肽的肽酶域。

在一個實施方案中，所述iRhom多肽是iRhom1或iRhom2。在另一個實施方案中，所述iRhom多肽是人或小鼠iRhom多肽。

在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物選自小分子、肽或多肽誘餌(decoy)。在另一個實施方案中，所述化合物連接至細胞穿透肽。在另一個實施方案中，所述化合物是細胞可透過性的。在另一個實施方案中，所述化合物是泛素蛋白酶抑制劑。

在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物加速角化細胞的遷移。在另一個實施方案中，所述化合物加速成纖維細胞的增殖。

一方面，本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；以及b)測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少，或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。

另一方面，本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物能夠在受試者中降低腫瘤生長和/或進展或治療癌癥，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；以及b)測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少，或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物能夠在受試者中降低腫瘤生長和/或進展或治療癌癥。

另一方面，本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物能夠在受試者中促進毛發(fā)生長，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；以及b)測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少，或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物能夠在受試者中促進毛發(fā)生長。

在一個實施方案中，所述腫瘤是實體瘤。在一些實施方案中，所述癌癥是上皮癌。在其他實施方案中，所述癌癥是食管癌、肺癌、腦癌、結(jié)腸癌、腎癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴腺癌或膀胱癌。

在一個實施方案中，所述底物是EGFR配體或EGF樣底物。

在另一個實施方案中，通過檢測iRhom多肽的生理靶標分泌的減少來測定對iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。在一些實施方案中，所述iRhom多肽的生理靶標是EGFR配體。在一個實施方案中，通過檢測可溶性EGFR配體水平的下降來測定對iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。在其他實施方案中，所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

在一個實施方案中，通過檢測EGFR活性的降低來測定對iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。

在另一個實施方案中，所述化合物抑制iRhom多肽的肽酶域。

在另一個實施方案中，所述化合物通過使iRhom多肽肽酶域的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基失活來影響iRhom多肽的活性。在一個實施方案中，所述iRhom多肽是小鼠iRhom2，并且所述化合物使小鼠iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基失活，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第635位組氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位組氨酸。在其他實施方案中，所述iRhom多肽是人iRhom2，并且所述化合物使人iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基失活，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第664位組氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位組氨酸。

在一個實施方案中，iRhom家族成員是iRhom1或iRhom2。在其他實施方案中，iRhom家族成員是人或小鼠iRhom家族成員。

在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物選自小分子、多肽誘餌、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、反義分子、特異性針對Rhbdf2的核酶；或編碼miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA的多聚核苷酸；或其各自的生物等價物。在其他實施方案中，所述化合物連接至細胞穿透肽。在一些實施方案中，所述化合物是細胞可透過性的。

一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含變體iRhom多肽。

另一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含缺失細胞溶質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)域的人iRhom2。

另一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含缺失細胞溶質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)域的小鼠iRhom2。

另一方面，本發(fā)明提供了分離的小鼠iRhom2多肽，其在小鼠iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基處包含突變，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第635位組氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位組氨酸。

另一方面，本發(fā)明提供了分離的人iRhom2多肽，其在人iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基處包含突變，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第664位組氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位組氨酸。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼上述多肽中任一種的分離的核酸分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含上述核酸分子的載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了表達上述載體的宿主細胞。

附圖說明

圖1A是示出了使用本文所述的增殖測定對MEF進行定量的圖；以X軸所示的數(shù)目接種細胞并孵育細胞24h，熒光程度與總細胞DNA的量成比例；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖1B是示出了使用本文所述的劃痕(scratch-wound)試驗對cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub MEF的遷移進行定量的圖；在時間點0時測量劃痕傷口的寬度(100％開口)，以初始寬度的百分數(shù)計算在各時間點傷口閉合的增加；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖1C是示出了對cub/cub mcub/mcub或+/+mcub/mcub MEF的EGFR信號傳導(dǎo)的多個標記物的免疫印跡分析的圖像，其中一式兩份地測定(run)細胞裂解物，使用肌動蛋白充當內(nèi)參照(loading control)；

圖1D示出了在受傷后第0、7、14、21和28天，6-40周齡雌性cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub小鼠(每組n＝3)中再生耳組織的代表性圖像。

圖1E是示出了對圖1D中所示的耳孔閉合的定量的圖；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖1F示出了在受傷后第0、7和14天，cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub小鼠的耳橫截面的圖像，用蘇木精/曙紅進行染色(原始放大率，×10)；注意cub/cub mcub/mcub小鼠的耳中未分化且增厚的表皮(E)(10-12個有核層)以及廣泛程度的增殖(M)；虛線表示切開的部位；

圖2A是示出了cub突變?yōu)樾∈驲hbdf2基因中12681bp缺失的圖，其中所述缺失開始于外顯子1和2的中間并且包含外顯子2-6，在外顯子6之后隨即結(jié)束；

圖2B示出了使用外顯子2、5、12和19的引物對+/+mcub/mcub、+/cub mcub/mcub和cub/cub mcub/mcub小鼠的MEF進行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR的結(jié)果圖；ntc代表無模板對照；

圖2C示出了使用針對所示外顯子邊界的TaqMan基因表達測定，對從皮膚組織提取的cDNA進行qPCR的結(jié)果圖，使用肌動蛋白充當內(nèi)參照(endogenous control)；將數(shù)據(jù)標準化為+/+mcub/mcub肌動蛋白水平，使用4種生物復(fù)制品，一式三份地測定樣品；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖2D示出了使用常規(guī)TaqMan基因表達測定檢測具有外顯子1-外顯子7邊界的轉(zhuǎn)錄物的qPCR結(jié)果圖；使用3種生物復(fù)制品，一式三份地測定樣品(各柱代表單獨的小鼠)；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖2E是瞬時表達Flag標記的HuWt(人全長RHBDF2cDNA)和HuCub(人類版本的cub cDNA)的HEK293細胞的抗Flag免疫印跡的圖像，使用肌動蛋白作為內(nèi)參照；

圖2F示出了使用Flag特異性抗體染色的表達Flag標記的HuWt和HuCub的B6原代MEF的代表性圖像，DAPI用于對細胞核進行復(fù)染色；箭頭代表全長蛋白和突變蛋白的細胞質(zhì)表達；

圖3A是示出了KOMP Rhbdf2敲除小鼠中野生型產(chǎn)物的PCR結(jié)果的圖像，預(yù)期產(chǎn)物長度為2181bp；L代表從New England Biolabs獲得的1kb DNA梯狀標記物(ladder)，ntc代表無模板對照；

圖3B示出了對Rhbdf2表達的報告基因的分析的圖像；全胚胎(whole-mount)X-gal染色的E18.5Rhbdf2^-/-胚胎示出了表皮中β-gal的強表達(箭簇)(原始放大率，×2.5)，X-gal染色的兩周齡雌性Rhbdf2^-/-皮膚示出了毛囊內(nèi)鞘層和外鞘層中的β-gal陽性(箭頭)(原始放大率，×5)；毛干中未觀察到染色；比例尺，1mm；

圖3C是示出了具有Rhbdf2無效突變的小鼠缺少再生表型的圖，如與Rhbdf2^cub/cub小鼠相比，6至8周齡雌性Rhbdf2^-/-小鼠的耳中顯著延緩的傷口閉合所顯示的；

圖3D示出了證明了具有Rhbdf2無效突變的小鼠具有正常的皮膚和毛發(fā)形態(tài)的圖像；在所示的創(chuàng)傷后時間點獲取的來自Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠的成年皮膚的H&E染色切片，其中成年Rhbdf2^cub/cub皮膚顯示出薄的皮下脂肪層(F)、異常的毛囊(H)、厚的表皮(E)、增大的皮脂腺(SG)、致密的交織排列的膠原纖維束(C)，以及毛囊和毛球的不完全分化(HF)；成年Rhbdf2^-/-皮膚顯示出正常表皮和毛囊；比例尺，100μm；原始放大率，×10和×40；

圖3E是示出了Rhbdf2^-/-小鼠發(fā)育出正常的毛皮(箭簇)，而復(fù)合突變的Rhbdf2^-/cub小鼠表現(xiàn)出稀疏的毛皮(箭頭)的圖像；

圖4A是示出了Mcub是T至G點突變的圖，所述點突變破壞了Areg基因中的正常供體剪接位點(外顯子1)，導(dǎo)致使用可變的下游剪接位點；

圖4B是示出了在28天中6-8周齡雌性Rhbdf2^+/+Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠中耳孔的愈合(每組n＝3只小鼠)的圖；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖4C示出了蘇木精/曙紅染色的切片圖，其示出了Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠耳孔切開后的愈合，其中虛線表示切開部位；原始放大率，×10；E代表表皮，M代表增殖；與圖1F進行比較；

圖4D是示出了同齡的Rhbdf2^+/+Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^cub/cubAreg^Mcub/Mcub雌性小鼠中血清AREG水平的圖，其中在Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠的血清中未檢測到AREG(n.d.)；數(shù)據(jù)以三次獨立實驗的平均值±s.d.表示；***p<0.001；

圖 4E是對從Rhbdf2^+/+Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠中分離的培養(yǎng)的小鼠表皮角化細胞(MEK)的上清液中AREG水平的ELISA定量的圖，其中在Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠的MEK中未檢測到AREG(n.d.)；數(shù)據(jù)以三次獨立實驗的平均值±s.d.表示；***p<0.001；

圖4F是示出了從EGFR配體的qPCR獲得的結(jié)果：使用TaqMan基因表達測定，從Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^+/+Areg^+/+的皮膚組織提取cDNA，使用肌動蛋白充當內(nèi)參照；將數(shù)據(jù)標準化為Rhbdf2^+/+Areg^+/+肌動蛋白水平，數(shù)據(jù)以三次獨立實驗的平均值±s.d.表示；*p<0.05；

圖5A是示出了全長人RHBDF2(Hu Wt)基因和模擬小鼠Rhbdf2^cub基因的人構(gòu)建體(HuCub)的示意圖；

圖5B是示出了在293T細胞中共表達Hu Wt或HuCub與AREG基因后，對經(jīng)裂解的AREG的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用DMSO或10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析AREG水平，重復(fù)進行轉(zhuǎn)染并將條件培養(yǎng)基稀釋5倍。

圖5C是示出了對所示基因型的8-12周齡雌性小鼠進行LPS注射后3h，通過ELISA對血清TNFα水平進行定量的圖，其中在沒有進行LPS注射的Rhbdf2^+/+小鼠的血清中未檢測到TNFα(n.d.)；*p<0.05；

圖5D是示出了共表達人RHBDL2(HuRHBDL2)基因與AREG或HB-EGF或EGF基因后，對經(jīng)裂解的AREG/HB-EGF/EGF的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析AREG/HB-EGF/EGF水平，其中不稀釋HB-EGF和EGF條件培養(yǎng)基，而將AREG培養(yǎng)基稀釋5倍；數(shù)據(jù)以三次獨立實驗的平均值±s.d.表示；***p<0.001；

圖5E是示出了在293T細胞中共表達Hu Wt或HuCub與HB-EGF基因后，對經(jīng)裂解的HB-EGF的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析HB-EGF水平；***p<0.001；

圖5F是示出了在293T細胞中共表達Hu Wt或HuCub與EGF基因后，對經(jīng)裂解的EGF的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用DMSO或10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析EGF水平；**p<0.01；

圖5G是示出了在293T細胞中共表達HuCub或無肽酶域的HuCub(HuCubΔPD)與AREG基因后，對經(jīng)裂解的AREG的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析AREG水平；***p<0.001；

圖5H是示出了在293T細胞中共表達HuCub或具有單個丙氨酸突變的HuCub與AREG基因后，對經(jīng)裂解的AREG的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析AREG水平；***p<0.001；

圖5I是示出了在293T細胞中共表達HuCub或具有單個丙氨酸突變的HuCub與EGF基因后，對經(jīng)裂解的EGF的ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h，并在條件培養(yǎng)基中分析EGF水平；**p<0.001；

圖5J是示出了Rhbdf2^cub的膜拓撲結(jié)構(gòu)的圖，其中所示氨基酸對于Rhbdf2^cub調(diào)控EGFR配體產(chǎn)生是關(guān)鍵的；

圖6A是示出了在10μM馬立馬司他(MM)的存在下，通過ELISA對來自用AREG與人RHBDF2p.I186T突變體、HuWt或HuCub轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的條件培養(yǎng)基的經(jīng)裂解的AREG進行定量的圖；**p<0.01；

圖6B是示出了HEK293細胞的蛋白質(zhì)印跡的圖像，所述HEK293細胞用AREG與HuCub、HuWt或p.I186T共轉(zhuǎn)染，用DMSO或MM孵育，并且對HA-AREG進行免疫印跡，表明即使在10μM MM的存在下，與AREG/Hu Wt或單獨的AREG的表達相比，AREG與HuCub或p.I186T的共表達顯著降低了AREG前體的胞內(nèi)水平，；

圖6C是示出了表達各RHBDF2P.I186T點突變體并用AREG基因或空載體共轉(zhuǎn)染的細胞中的AREG水平的圖；各殘基被突變?yōu)楸彼?；?0μM MM孵育細胞24h并在條件培養(yǎng)基中測定AREG水平；

圖6D是X-gal染色的2周齡雌性Rhbdf2^-/-的腸的圖像，其顯示了報告基因β-gal在中部和上部絨毛區(qū)的表達；原始放大率，×2.5；

圖6E是示出了Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠(n＝28)和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub(n＝23)小鼠的Kaplan-Meier存活曲線的圖，其中Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠的中值存活期為172天，與之相比，Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠的中值存活期為135天；

圖6F示出了三月齡時所示基因型小鼠的腸組織的蘇木精-曙紅染色的切片的圖像；原始放大率，×2.5；

圖6G是示出了三月齡時所示基因型小鼠的息肉大小/每只小鼠的圖；對于Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠，平均腫瘤大小分別為1.8mm²和3.7mm²；

圖6H是示出了三月齡時所示基因型小鼠的息肉數(shù)目/每只小鼠的圖；對于Apcs^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠和ApcMin^/+Rhbdf2^+/cub小鼠，平均息肉數(shù)目分別為12和21；

圖7A是人iRhom2-AREG復(fù)合體的免疫共沉淀圖，其中用Flag標記的HuWt或Flag標記的HuCub或Flag標記的p.I186T共轉(zhuǎn)染來自COS7細胞的裂解物，對HA標記的AREG用抗Flag磁珠進行免疫沉淀并用抗Flag抗體和抗HA抗體進行探測；

圖7B示出了用所示的Flag標記的基因轉(zhuǎn)染并使用Flag特異性PE標記的抗體進行免疫標記的293T或COS7(圖14)細胞的流式細胞術(shù)結(jié)果，其中在轉(zhuǎn)染后48h對所述細胞進行免疫標記；

圖7C是示出了對圖7B中獲得的數(shù)據(jù)的定量的圖；

圖7D示出了在所示時間用150μg/ml蛋白合成抑制劑環(huán)己酰胺對瞬時轉(zhuǎn)染的COS7細胞進行追蹤，并使用Flag特異性PE標記的抗體來評估蛋白表達的測試結(jié)果；數(shù)據(jù)代表總共三次實驗中的一次；

圖7E是示出了對圖7D中獲得的數(shù)據(jù)的定量的圖；

圖7F是示出了用10μM細胞可透過性的蛋白酶抑制劑MG-132預(yù)孵育瞬時轉(zhuǎn)染的COS7細胞4h，然后在所示時間在MG-132存在下用150μg/ml環(huán)己酰胺追蹤的測試結(jié)果的圖；如圖7D所述測定蛋白表達；***p<0.001；

圖8示出了野生型iRhom2是短壽命蛋白，其N末端缺失或N-末端結(jié)構(gòu)域中的突變(包括那些引起上皮癌的突變)增加了其蛋白穩(wěn)定性，進而增加了選擇性EGF家族配體(包括AREG)的分泌；抑制ADAM17對AREG分泌沒有影響，而iRhom2的肽酶域中氨基酸H366、Q426、C432和H475的缺失終止了AREG分泌；相反，AREG分泌增加導(dǎo)致EGFR信號傳導(dǎo)的過度激活，從而增加了細胞增殖和遷移；

圖9A是示出了cub/cub mcub/mcub(箭簇)和cub/cub Mcub/mcub(箭頭)小鼠的圖像；

圖9B是示出了+/cub mcub/mcub小鼠的傷口愈合似乎介于cub/cub mcub/mcub小鼠和+/+小鼠之間的圖；在創(chuàng)傷(2mm通孔)后0、7、14和21天，在6至40周齡雌性+/+mcub/mcub、+/cub mcub/mcub和cub/cub mcub/mcub小鼠(每組n＝3)中對耳孔閉合率進行定量；數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示；

圖10A示出了B6原代MEF中Flag標記的全長(HuWt)和cub(HuCub)Rhbdf2克隆的體外表達，然后用Flag特異性抗體和細胞核的DAPI復(fù)染色進行蛋白表達的免疫化學評估，表明全長和突變蛋白都與ER標記物鈣聯(lián)蛋白共定位；

圖10B示出了B6原代MEF中Flag標記的全長(HuWt)和cub(HuCub)Rhbdf2克隆的體外表達，然后用Flag特異性抗體和細胞核的DAPI復(fù)染色進行蛋白表達的免疫化學評估，表明全長和突變蛋白都不與高爾基體標記物巨蛋白(giantin)共定位；

圖11是示出了T至G點突變破壞了原始剪接位點(外顯子1)而導(dǎo)致可變剪接位點的圖，所述可變剪接位點在Areg轉(zhuǎn)錄物上添加了22個額外的核苷酸并在蛋白質(zhì)上添加了16個錯誤的氨基酸，引入了提前終止密碼子；

圖12A是對cub/cub Mcub/Mcub或cub/cub mcub/mcub MEF的所示標記物的免疫印跡分析圖，其中一式兩份地測定細胞裂解物，使用肌動蛋白充當內(nèi)參照；

圖12B是示出了對在scramble shRNA或小鼠Areg shRNA慢病毒感染的Rhbdf2^+/+或Rhbdf2^cub/cub MEF中Areg表達的定量RT-PCR測定的圖；

圖12C是示出了用scramble shRNA或小鼠Areg shRNA感染之后，使用本文所述的增殖測定對Rhbdf2^+/+MEF進行定量的圖，其中以X軸所示的數(shù)目接種細胞并孵育細胞24h，熒光程度與總細胞DNA的量成比例；

圖12D是示出了用scramble shRNA或小鼠Areg shRNA感染之后，使用本文所述的增殖測定對Rhbdf2^cub/cub MEF進行定量的圖，其中以X軸所示的數(shù)目接種細胞并孵育細胞24h，熒光程度與總細胞DNA的量成比例；

圖13A是示出了對來自在10μM馬立馬司他(MM)存在下用小鼠Rhbdf1或N-末端截短的小鼠Rhbdf1(ΔN-iRhom1)或ΔN-iRhom1突變體以及AREG基因轉(zhuǎn)染的HEK 293T細胞的條件培養(yǎng)基的分泌的AREG進行ELISA定量的圖；***p<0.001；

圖13B是示出了對來自在10μM馬立馬司他(MM)存在下用小鼠Rhbdf1或N-末端截短的小鼠Rhbdf1(ΔN-iRhom1)以及EGF基因轉(zhuǎn)染的HEK 293T細胞的條件培養(yǎng)基的經(jīng)裂解的EGF進行ELISA定量的圖；***p<0.001；

圖13C是對人iRhom2和RHBDL2，以及人和小鼠iRhom的肽酶域序列的氨基酸進行比對的圖像；

圖13D是示出了在293T細胞中共表達HuCub或具有單個丙氨酸突變的HuCub與AREG基因后，對分泌的AREG進行ELISA定量的圖；轉(zhuǎn)染后24h時，用10μM馬立馬司他(MM)孵育細胞24h并在條件培養(yǎng)基中分析AREG水平；數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗的平均值±s.d.；

圖13E是示出了對iRHOM1和iRHOM2、活性菱形RHBDL2、秀麗線蟲(C.elegans)無活性菱形ROM3和ROM4，以及果蠅屬(Drosophila)iRhom的肽酶域的氨基酸的序列比對的圖，其中星號代表對iRHOM2調(diào)控EGFR配體而言至關(guān)重要的保守氨基酸；以及

圖14示出了用所示的Flag標記的基因轉(zhuǎn)染并使用Flag特異性PE標記的抗體進行免疫標記的COS7細胞的流式細胞術(shù)結(jié)果的圖像，其中在轉(zhuǎn)染后48h對所述細胞進行免疫標記。

具體實施方式

本文使用的科技術(shù)語旨在具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。發(fā)現(xiàn)這些術(shù)語在多篇標準參考文獻的上下文中被定義和使用，所述參考文獻示例性地包括J.Sambrook和D.W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；第3版,2001；F.M.Ausubel Ed.,Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols；第5版,2002；B.Alberts等人,Molecular Biology of the Cell,第4版,Garland,2002；D.L.Nelson and M.M.Cox,Lehninger Principles of Biochemistry,第4版,W.H.Freeman&Company,2004；Engelke,D.R.,RNA Interference(RNAi):Nuts and Bolts of RNAi Technology,DNA Press LLC,Eagleville,PA,2003；Herdewij n,P.(Ed.),Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2004；A.Nagy,M.Gertsenstein,K.Vintersten,R.Behringer,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002年12月15日,ISBN-10:0879695919；Kursad Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols in Methods Mol Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology,ISBN:9780470151808；Chu,E.和Devita,V.T.,Eds.,Physicians’Cancer Chemotherapy Drug Manual,Jones&Bartlett Publishers,2005；J.M.Kirkwood等人，Eds.,Current Cancer Therapeutics,第4版,Current Medicine Group,2001；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,第21版,2005；L.V.Allen,Jr.等人,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第8版,Philadelphia,PA:Lippincott,Williams&Wilkins,2004；以及L.Brunton等人,Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill Professional,第12版,2011。

除非另外明確說明或上下文中另外清楚說明，單數(shù)術(shù)語“一”、“一個”和“所述”不意為限制性的，且包括復(fù)數(shù)指代物。

無活性菱形蛋白酶(iRhom)是高度保守的膜內(nèi)蛋白，其之前被認為不具有蛋白水解活性。iRhom的特征在于長的細胞溶質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)域，保守的富含半胱氨酸的無活性菱形蛋白酶同源結(jié)構(gòu)域(IRHD)，在肽酶域內(nèi)缺少活性位點絲氨酸殘基的休眠的(dormant)蛋白水解位點。

在許多物種中，iRhom參與多種功能，包括在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)、人鱗狀上皮癌細胞的存活、在哺乳動物細胞系中從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜清除錯誤折疊的蛋白、誘導(dǎo)原代小鼠角化細胞的遷移、在小鼠中分泌可溶性TNFα、以及在小鼠胚胎成纖維細胞中調(diào)節(jié)受激的ADAM17介導(dǎo)的金屬蛋白酶脫落(shedding)的底物選擇性。EGF樣配體可作為iRhom家族成員的底物發(fā)揮作用。

Rhbdf2基因編碼無活性的菱形蛋白酶iRhom2——包含長細胞溶質(zhì)的N-末端和之前功能未知的休眠的肽酶域的酶家族之一。本發(fā)明提供了iRhom2可通過EGFR信號傳導(dǎo)的組成型激活在上皮再生和癌生長中發(fā)揮作用。

本發(fā)明的方面至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：Rhbdf2突變通過增加雙調(diào)蛋白的分泌來提高iRhom2蛋白穩(wěn)定性并驅(qū)使EGFR過度激活。

本發(fā)明的方面至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：iRhom2是短壽命蛋白，其穩(wěn)定性可通過在N-末端結(jié)構(gòu)域的選擇性突變來提高。進而，這些穩(wěn)定的變體增加EGF家族配體(包括雙調(diào)蛋白)的分泌，此過程不依賴于金屬蛋白酶ADAM17活性。在體內(nèi)，N-末端iRhom2突變誘導(dǎo)傷口加速愈合以及腫瘤生成加速，但是不驅(qū)使自發(fā)性腫瘤發(fā)展。因此，本發(fā)明還至少部分基于iRhom2在調(diào)控創(chuàng)傷愈合和腫瘤生長中涉及的EGFR信號傳導(dǎo)事件的生理作用，以及iRhom2關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的功能。

表皮生長因子受體(EGFR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在哺乳動物細胞的生長、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。典型的EGFR配體(包括EGF、AREG和HB-EGF)作為在細胞表面表達的前體蛋白而存在，為了結(jié)合EGFR，所述EGFR配體必須被排放(shed)至胞外區(qū)室。在不同的發(fā)育階段，不同類別的蛋白酶使與膜相連的EGFR前配體裂解以調(diào)節(jié)多種生物活性。

一方面，本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：小鼠中Rhbdf2基因中的自發(fā)性缺失是卷曲裸露(cub)突變的原因，在所述突變中iRhom2的細胞溶質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致隨后對毛囊發(fā)育、創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生的影響。此外，cub的修飾因子(Mcub)治愈或矯正了變禿和/或促進毛發(fā)生長(實施例1)。另一方面，本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：iRhom2是短壽命蛋白，但是N-末端的功能獲得性突變(胼胝癥(tylosis))或N-末端缺失(cub突變)提高了突變蛋白穩(wěn)定性，導(dǎo)致不依賴于金屬蛋白酶的EGFR配體雙調(diào)蛋白(AREG)的分泌。Cub表型的遺傳修飾因子(Mcub)用于證明AREG是iRhom2的生理靶標。另一方面，本發(fā)明至少部分基于對AREG分泌所必需的iRhom2肽酶域中的關(guān)鍵氨基酸的鑒定，表明該假酶的肽酶域盡管在推定的活性位點缺少絲氨酸殘基，仍可能是功能性的。本發(fā)明因此提供了iRhom關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的功能并建立了框架，用于理解iRhom、EGFR信號傳導(dǎo)、以及創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生中涉及的生物過程之間的關(guān)系。

iRhom家族成員

iRhom1和iRhom2

菱形蛋白酶是存在于幾乎所有物種中的酶家族。菱形蛋白酶是膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶，菱形蛋白酶的蛋白質(zhì)水解裂解作用對細胞調(diào)控而言非常重要。膜內(nèi)蛋白酶的活性位點埋在細胞膜的脂雙層中，并且它們在其他跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)裂解這些蛋白。

iRhom或“無活性的菱形蛋白酶”是菱形蛋白酶的一個亞家族，在本發(fā)明之前，其被認為缺乏蛋白水解活性。iRhom是高度保守的膜內(nèi)蛋白，其特征在于，長的細胞溶質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)域，保守的富含半胱氨酸的無活性菱形蛋白酶同源結(jié)構(gòu)域(IRHD)，在肽酶域內(nèi)缺少活性位點絲氨酸殘基的休眠的蛋白水解位點。適用于本發(fā)明的iRhom家族成員包括iRhom1(RHBDF1)和iRhom2(RHBDF2)。用于本發(fā)明的iRhom1和/或iRhom2可以是真核的、原核的或哺乳動物的。此外，用于本發(fā)明的iRhom1和/或iRhom2可來自人、靈長類動物、嚙齒類動物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、牛、馬、驢、兔、山羊、綿羊、狗、雞、豬、果蠅、秀麗線蟲或大腸桿菌(E.coli)。

在本文中舉例說明的野生型iRhom為小鼠iRhom2(SEQ ID No:1)、小鼠iRhom1(SEQ ID No:3)、人iRhom2(SEQ ID No:5)和人iRhom1(SEQ ID No:7)。在本文中舉例說明的分離的iRhom突變序列為SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于認識到編碼本文所示的iRhom多肽的核酸序列為SEQ ID NO:1-8。應(yīng)理解，由于遺傳密碼的簡并性，多于一個的核酸序列編碼具體的iRhom多肽或變體，并且所述核酸序列可被表達以產(chǎn)生所需的iRhom。

通常，iRhom1和iRhom2變體與本申請中所示的野生型iRhom1和iRhom2的序列的序列同一性為至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。

一方面，與相應(yīng)的野生型iRhom1或iRhom2相比，本發(fā)明的iRhom變體中改變(例如，置換、插入或缺失)的數(shù)目為1-20，例如1-10和1-5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個改變。

作用機制

在許多物種中，iRhom參與多種功能，包括在黑腹果蠅中調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)、人鱗狀上皮癌細胞的存活、在哺乳動物細胞系中從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜清除錯誤折疊的蛋白、誘導(dǎo)原代小鼠角化細胞的遷移、在小鼠中分泌可溶性TNFα、以及在小鼠胚胎成纖維細胞中調(diào)節(jié)受激的ADAM17介導(dǎo)的金屬蛋白酶脫落的底物選擇性。

在一個實施方案中，本發(fā)明證明了小鼠中Rhbdf2基因內(nèi)的自發(fā)性缺失是卷曲裸露(cub)突變的原因，在所述突變中iRhom2的細胞溶質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致隨后對毛囊發(fā)育、創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生的影響。在另一個實施方案中，本發(fā)明證明了iRhom2是短壽命蛋白，但是N-末端的功能獲得性突變或N-末端缺失提高了突變蛋白穩(wěn)定性，導(dǎo)致不依賴于金屬蛋白酶的EGFR配體雙調(diào)蛋白(AREG)的分泌。使用cub表型的遺傳修飾因子(Mcub)，本發(fā)明證明了AREG是iRhom2的生理靶標。在另一個實施方案中，鑒定了AREG分泌所必需的iRhom2的肽酶域中的關(guān)鍵氨基酸(H、C、Q、H)，表明該假酶的肽酶域盡管在推定的活性位點中缺少絲氨酸殘基，但仍可能是功能性的。

iRhom家族成員的突變形式

本發(fā)明還涉及iRhom家族成員的突變形式。在一個實施方案中，iRhom1或iRhom2的細胞溶質(zhì)的N-末端被缺失。所述細胞溶質(zhì)的N-末端的缺失激活了iRhom多肽的肽酶域中的休眠的蛋白水解位點。在一個實施方案中，iRhom1或iRhom2的細胞溶質(zhì)末端被裂解，以使跨膜結(jié)構(gòu)域具有蛋白水解活性。在一個實施方案中，小鼠iRhom1在第1至272位殘基之間被裂解，和/或人iRhom1在第1至316位殘基之間被裂解，以使跨膜結(jié)構(gòu)域具有蛋白水解活性。在另一個實施方案中，小鼠iRhom2在第1至268位殘基之間被裂解，和/或人iRhom2在第1至298位殘基之間被裂解，以使跨膜結(jié)構(gòu)域具有蛋白水解活性。

所述iRhom多肽也可在跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白水解位點中包含突變。在一個實施方案中，小鼠iRhom2多肽在跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白水解位點(肽酶域)中包含一個或多個關(guān)鍵氨基酸的突變，所述突變選自TM螺旋2上的第635位組氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、跨膜螺旋4上的第701位半胱氨酸和第744位組氨酸，以使跨膜結(jié)構(gòu)域具有蛋白水解活性。在另一個實施方案中，人iRhom2多肽在跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白水解位點中包含一個或多個突變，所述突變選自TM螺旋2上的第664位組氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、跨膜螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位組氨酸，從而使跨膜結(jié)構(gòu)域具有蛋白水解活性。

篩選測定

本發(fā)明提供了鑒定改變iRhom多肽(例如，iRhom1或iRhom2)活性的化合物的方法。所述iRhom多肽可以是突變的iRhom多肽。例如，所述iRhom多肽可在其N-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含缺失。所述iRhom多肽可在跨膜肽酶域中包含突變。此外，所述iRhom多肽可在其N-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含缺失，以及在跨膜肽酶域中包含突變。

一方面，本發(fā)明的方法通常包括鑒定化合物，所述化合物激活iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。在一個實施方案中，所述方法包括使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸并測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加表明所述化合物激活了iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。在一個實施方案中，所述底物可以是EGFR配體或EGF樣底物。

另一方面，本發(fā)明的方法通常包括鑒定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。在一個實施方案中，所述方法包括使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸并測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。在一個實施方案中，所述底物可以是EGFR配體或EGF樣底物。

人們認為，表皮生長因子受體(EGFR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在哺乳動物細胞的生長、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明提供了iRhom是短壽命蛋白，但是顯性突變提高其蛋白穩(wěn)定性并刺激不依賴于金屬蛋白酶活性的特定的EGF家族配體雙調(diào)蛋白的分泌。本發(fā)明證明了哺乳動物iRhom在調(diào)節(jié)促進創(chuàng)傷加速愈合并引發(fā)腫瘤形成的EGFR信號傳導(dǎo)事件中的重要性。本發(fā)明還提供了iRhom可與金屬蛋白酶并行調(diào)節(jié)EGFR信號傳導(dǎo)。因此，本發(fā)明提供了使用iRhom作為受損的傷口愈合和癌癥中的新型治療靶標的新策略。

本發(fā)明的多方面涉及篩選和測定方法及手段，以及由此鑒定的物質(zhì)，例如，用于激活或抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性的化合物的測定。所述底物可以是EGFR配體或EGF樣底物。

其他測定用于與iRhom多肽相互作用或結(jié)合并且調(diào)節(jié)(即提高、刺激、降低、抑制或消除)iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物或物質(zhì)。

對照是本領(lǐng)域熟知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于識別出合適對照并且能夠僅借助常規(guī)實驗確定用于本發(fā)明方法的合適對照。

根據(jù)鑒定調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明方面的iRhom多肽活性的化合物的方法——其包括使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸并測定所述測試化合物對iRhom多肽的活性的影響——的方面，當在相同或相似的條件下，表達iRhom多肽的細胞不與所述測試化合物接觸時，用合適對照測定iRhom多肽的活性。

合適對照可以是變量的參照水平，例如iRhom多肽的活性、iRhom多肽的穩(wěn)定性水平、iRhom多肽的生理靶標的分泌水平、相對于合適對照的EGFR活性水平和/或可溶性EGFR配體的水平，其被事先測定并存儲在印刷品中或電子介質(zhì)中，用于調(diào)用(recall)并與根據(jù)鑒定調(diào)節(jié)本發(fā)明的iRhom多肽活性的化合物的方法的方面而測定的測試化合物對iRhom多肽活性的影響進行比較。

鑒定iRhom多肽的調(diào)節(jié)劑的測定方法可包括使本文所述的iRhom多肽與測試化合物接觸，確定所述測試化合物與iRhom多肽的結(jié)合，并在存在和不存在結(jié)合iRhom多肽的測試化合物的情況下測定iRhom多肽的蛋白水解活性?？赏ㄟ^下文所述的測定底物的裂解來測定蛋白水解活性。所述iRhom多肽可以是分離的或包含于脂質(zhì)體或細胞中。

篩選和/或獲得調(diào)節(jié)iRhom多肽活性的物質(zhì)/化合物的方法可包括在合適的反應(yīng)培養(yǎng)基中使一種或多種測試物質(zhì)或化合物與iRhom多肽接觸，測定經(jīng)處理的多肽的活性，并將所述活性與在未用所述一種或多種測試物質(zhì)處理的相當?shù)姆磻?yīng)培養(yǎng)基中所述多肽的活性進行比較。所述iRhom多肽可以以分離的形式存在于反應(yīng)培養(yǎng)基中或可包含于脂質(zhì)體或細胞中。

經(jīng)處理和未經(jīng)處理的iRhom多肽之間的活性差異指示相關(guān)的一種或多種測試物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，例如，抑制或增強作用。

可通過測定經(jīng)蛋白水解而裂解的底物的產(chǎn)生來測定iRhom多肽的活性。例如，所述iRhom多肽可作用于與膜結(jié)合的底物以產(chǎn)生被檢測的可溶性產(chǎn)物。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定和/或獲得iRhom多肽的調(diào)節(jié)劑的測定方法，所述方法包括：(a)在存在多肽底物的情況下使iRhom多肽與測試化合物接觸；和(b)測定所述多肽底物的蛋白水解裂解。

可在存在和不存在測試化合物的情況下測定對底物的裂解。存在測試化合物的情況相對于不存在測試化合物的情況下裂解的差異指示所述測試化合物是iRhom蛋白酶活性的調(diào)節(jié)劑。

任何被iRhom多肽經(jīng)蛋白水解而裂解的多肽底物均可用于本文所述的測定方法。使用標準技術(shù)可容易地鑒定所述底物。所述多肽底物可以為EGFR配體，例如AREG或HB-EGF。

合適的底物可包括可檢測的標記，例如綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶或堿性磷酸酶。這允許便利地檢測可溶性裂解產(chǎn)物，并且特別適用于自動化測定。

適用于本測定的EGFR配體在本領(lǐng)域被很好的表征，并且可具有包含一個或多個表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域和單一跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，合適的EGFR配體與脊椎動物EGFR配體具有大于50％的同源性，大于60％的同源性，大于70％的同源性，大于80％的同源性，大于90％的同源性或大于95％的同源性。

在本文所述的方法中，嵌合配體可具有改進的特性，例如它可更有效地被iRhom多肽裂解，具有改進的分泌特性或更易于被檢測。

本發(fā)明的另一方面提供了嵌合的EGFR配體，其包含來自兩種或更多種EGFR配體的序列，例如嵌合配體可包含第一EGFR配體的跨膜結(jié)構(gòu)域以及第二EGFR配體的胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域。嵌合底物還可包含可檢測的標簽，例如熒光素酶、GFP或堿性磷酸酶。

本發(fā)明的獲得或鑒定iRhom活性調(diào)節(jié)劑的測定方法或其他方法可以是基于細胞的體內(nèi)測定或不基于細胞的體外測定。

可在巴馬司他(Batimastat)存在下進行所述方法以抑制非菱形蛋白酶或非iRhom依賴的底物脫落，從而減少背景。

在體外測定中，所述iRhom多肽可以是分離的或包含于脂質(zhì)體中?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法進行基于脂質(zhì)體的試驗。

用于體外測定的適合的細胞類型包括哺乳動物細胞，例如小鼠胚胎成纖維細胞、角化細胞、HEK293、CHO、HeLa和COS細胞。

對于本發(fā)明的體外或體內(nèi)測定，不必使用完整的全長蛋白?？梢员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法產(chǎn)生并使用保留全長蛋白活性的如本文所述的多肽片段。產(chǎn)生片段的合適的方法包括但不限于，來自編碼DNA的片段的重組表達?？赏ㄟ^取編碼DNA、鑒定待表達的部分任一側(cè)的合適的限制性酶識別位點、以及從DNA切下所述部分來產(chǎn)生所述片段。然后可在標準的市售可得的表達系統(tǒng)中將所述部分與合適的啟動子可操作地連接。另一種重組方法是使用合適的PCR引物來擴增DNA的相關(guān)部分。也可采用本領(lǐng)域熟知的肽合成法來產(chǎn)生小片段(例如，最多達約20或30個氨基酸)。

本發(fā)明的測定的準確形式可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)和知識而改變。例如，可通過用可檢測的標記來標記一種多肽并使其與已固定在固體載體上的另一種多肽接觸，在體外研究所述多肽之間的相互作用。合適的可檢測的標記包括35S-甲硫氨酸，其可被摻入到通過重組產(chǎn)生的肽和多肽中。通過重組產(chǎn)生的肽和多肽也可被表達為融合蛋白，其包含可用抗體進行標記的表位。

可產(chǎn)生融合蛋白，其在所述重組蛋白的N-末端或C-末端納入6個組氨酸殘基。所述組氨酸標簽可用于使用市售可得的包含金屬離子(鎳或鈷)的柱來進行的蛋白純化。這些標簽也可用于檢測蛋白，所述檢測使用市售可得的針對所述6個組氨酸殘基的單克隆抗體來進行。

本發(fā)明的測定可采用體外測定的形式?？稍诩毎?例如酵母菌株、昆蟲細胞系或哺乳動物細胞系)中進行體外測定，在所述細胞系中從被引入到細胞中的一個或多個載體表達相關(guān)的多肽或肽。

在所述實施方案的測定方法或其他方法中，在存在底物(例如EGFR配體)的情況下使iRhom多肽與測試化合物接觸。在所述方法中，所述iRhom多肽和底物可存在于細胞中。例如，這可通過從已通過轉(zhuǎn)化被引入到細胞中的一個或多個表達載體表達所述多肽而實現(xiàn)。

用于鑒定和/或獲得iRhom蛋白水解活性的調(diào)節(jié)劑的測定方法因此可包括：(a)在存在EGFR配體多肽的情況下使iRhom多肽與測試化合物接觸；和(b)測定EGFR配體的裂解。

可在存活和不存在測試化合物的情況下測定裂解。存在測試化合物的情況相對于不存在測試化合物的情況下裂解的差異指示所述化合物是iRhom活性的調(diào)節(jié)劑(即增強劑或抑制劑)。

可將編碼上文所述的iRhom多肽和/或多肽底物的核酸提供為可復(fù)制載體(特別是可在合適條件下從其表達編碼多肽的任何表達載體)和宿主細胞(其包含任何所述載體或核酸)的一部分。在本上下文中表達載體是包括編碼目的多肽和合適調(diào)控序列的核酸的核酸分子，用于在體外表達系統(tǒng)(例如網(wǎng)織紅細胞裂解物)或體內(nèi)(例如，在真核細胞如HEK、COS或CHO細胞中或原核細胞如大腸桿菌中)表達所述多肽。這將在下文中進一步討論。

組合文庫技術(shù)提供了測試潛在的大量不同物質(zhì)調(diào)節(jié)多肽活性的能力的有效方法。在活性調(diào)節(jié)的篩選之前或同時，可篩選測試物質(zhì)與多肽相互作用的能力，例如在酵母雙雜交系統(tǒng)(其需要多肽和測試物質(zhì)都能夠在酵母中由編碼核酸表達)中進行篩選。這可用作測試物質(zhì)調(diào)節(jié)多肽活性的真實能力之前的粗篩。

通常根據(jù)所使用的化合物的類型通過反復(fù)試驗(trial and error)來確定可添加到本發(fā)明測定中的測試物質(zhì)或化合物的量。通常，可使用約0.01至100nM濃度的推定抑制劑或激活劑化合物，例如0.1至10nM。當采用基于細胞的測定時，所述試驗物質(zhì)或化合物需要是膜可透過性的，以接近iRhom多肽。

測試化合物可以是用于藥物篩選程序的天然或合成化合物。也可使用包含若干被表征或未被表征的組分的植物提取物。另一類推定的抑制劑或激活劑化合物可獲得自iRhom多肽和/或結(jié)合其的配體。可測試5至40個氨基酸(例如6至10個氨基酸)的膜可透過性的的肽片段破壞所述相互作用或活性的能力。

在一個實施方案中，調(diào)節(jié)(例如提高或降低)iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物可以為小分子化合物。在另一個實施方案中，所述化合物細胞可透過性的。例如，所述化合物可以為泛素蛋白酶抑制劑。在另一個實施方案中，所述化合物連接至細胞穿透肽。所述細胞穿透肽可包含富含賴氨酸或精氨酸的序列。例如，所述細胞穿透肽可以是tat。

其他測試化合物可基于多肽或肽片段的三維結(jié)構(gòu)的建模并且使用合理的藥物設(shè)計以提供具有特定分子形狀、大小和電荷特征的潛在的抑制劑化合物。

在鑒定調(diào)節(jié)或影響多肽活性的物質(zhì)之后，可進一步研究所述物質(zhì)。此外，可制備所述物質(zhì)和/或?qū)⑵溆糜谥苽?即制備或配制)組合物(例如藥劑、藥物組合物或藥物)?？蓪⑺鼈兘o予個體。

本發(fā)明的另一方面提供了本文所述的iRhom多肽在獲得或鑒定iRhom蛋白水解活性的調(diào)節(jié)劑(例如抑制劑)的方法中的用途。也提供了iRhom多肽用于多肽底物的跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白水解裂解的方法和用途。

iRhom活性調(diào)節(jié)劑(特別是抑制劑)可用于治療癌癥，例如食管癌、肺癌、腦癌、結(jié)腸癌、腎癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、淋巴腺癌或膀胱癌。

iRhom活性調(diào)節(jié)劑(特別是激活劑)可用于加速組織(例如，皮膚、肝臟、心臟、肌肉或腎)中受損的傷口愈合。

iRhom活性調(diào)節(jié)劑也可用于治療炎癥病癥或疾病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫性疾病。

因此，本發(fā)明在多個方面不僅擴展至根據(jù)本文公開的內(nèi)容被鑒定為iRhom活性調(diào)節(jié)劑的物質(zhì)，還擴展至包含所述物質(zhì)的藥物組合物、藥劑、藥物或其他組合物；包括將所述組合物給予患者(例如用于治療(其可包括預(yù)防性治療)病原體感染或與異常ErbB或EGF受體活性相關(guān)的病癥(例如癌癥、冠狀動脈粥樣硬化、銀屑病、傷口愈合、毛發(fā)生長)、治愈和/或矯正變禿)的方法；所述物質(zhì)用于制備組合物的用途，所述組合物用于給予，例如用于治療病原體感染或與異常ErbB或EGF受體活性相關(guān)的病癥(例如癌癥、冠狀動脈粥樣硬化、銀屑病、傷口愈合、毛發(fā)生長)、治愈和/或矯正變禿；以及制備藥物組合物的方法，包括將所述物質(zhì)與可藥用賦形劑、媒介物或載體以及任選的其他成分混合。

被使用本文所述的測定鑒定為多肽或啟動子功能的調(diào)節(jié)劑的物質(zhì)本質(zhì)上可以為肽或非肽。對于許多體內(nèi)藥物用途而言，通常優(yōu)選非肽“小分子”。因此，可針對藥物用途設(shè)計所述物質(zhì)(特別是如果是肽)的類似物或模擬物。

已知的藥物活性化合物的類似物的設(shè)計是基于“先導(dǎo)(lead)”化合物開發(fā)藥物的已知方法。當活性化合物難以合成或合成費用高時，或活性化合物不適合特定的給藥方法時，可能需要設(shè)計其類似物。

類似物設(shè)計、合成和測試可用于避免針對靶標特性隨機篩選大量分子。

iRhom家族多肽的必要催化殘基對應(yīng)于小鼠iRhom2多肽的TM螺旋2上的第635位組氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位組氨酸。iRhom家族多肽的必要催化殘基也對應(yīng)于人iRhom2多肽的TM螺旋2上的第664位組氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位組氨酸。

本發(fā)明的能夠調(diào)節(jié)多肽活性的化合物、多肽、肽或物質(zhì)可在試劑盒中提供，例如密封于適合的容器中，所述容器保護其內(nèi)容物免受外部環(huán)境影響。這類試劑盒可包括使用說明書。

無論待給予個體的是本發(fā)明的多肽、抗體、肽、核酸分子、小分子或其他藥學上有用的化合物，優(yōu)選以“預(yù)防有效量”或“治療有效量”(視情況而定，盡管預(yù)防可被認為是治療)給予，這足以對個體顯示出益處。實際給予的量、以及給予的速率和時間過程取決于被治療的病癥的性質(zhì)和嚴重性。治療處方(例如對劑量等的決定)在全科醫(yī)師和其他醫(yī)生的責任范圍內(nèi)。

根據(jù)待治療的病癥，可單獨給予組合物或結(jié)合其他治療同時或依次給予組合物。

本發(fā)明的化合物

改變iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物

本發(fā)明的化合物或測試化合物可改變iRhom多肽的蛋白水解活性。在一個實施方案中，所述化合物包括iRhom多肽的蛋白水解活性的激活劑或抑制劑。

在一個實施方案中，所述化合物是結(jié)合iRhom多肽的小分子。在另一個實施方案中，所述化合物是抑制iRhom多肽活性的小分子。在另一個實施方案中，所述化合物是激活iRhom多肽活性的小分子。這些小分子可包括，例如，肽、類肽物(peptidomimetics)、有機化合物等。在一個實施方案中，所述小分子化合物能夠轉(zhuǎn)運通過質(zhì)膜并與iRhom多肽相互作用。在一些實施方案中，所述小分子化合物與iRhom多肽的細胞質(zhì)尾相互作用。在其他實施方案中，所述小分子化合物與iRhom多肽的蛋白水解結(jié)構(gòu)域相互作用。

在一些實施方案中，所述化合物是泛素酶抑制劑。

在另一個實施方案中，改變iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物可包括，例如，針對iRhom DNA或mRNA的miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA或反義RNA，或編碼所述miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA或反義RNA的多聚核苷酸，包含所述多聚核苷酸的載體。在另一個實施方案中，改變iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物包括，例如，抗體、抗體片段、肽或多肽誘餌。通過篩選可從組合化學抑制劑文庫鑒定其他化合物，然后通過化學改變進一步優(yōu)化這些化合物。

在另一個實施方案中，所述化合物還包括細胞穿透肽。一方面，所述細胞穿透肽包括HIV-TAT肽。

藥物組合物

可使用藥物組合物給予改變iRhom多肽的蛋白水解活性的本發(fā)明的化合物。合適的藥物組合物包括本文所述化合物(或其可藥用的鹽或酯)的任一種，以及任選地包括可藥用載體。在某些實施方案中，這些組合物任選地還包括一種或多種額外的治療劑。

可接受的“藥物載體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且可包括但不限于任一種標準藥物載體，例如磷酸鹽緩沖液、水和乳劑(例如油/水乳劑)和各種類型的濕潤劑。

本文使用的術(shù)語“可藥用的鹽”是指在合理的醫(yī)學判斷的范圍內(nèi)，適用于與人和低等動物的組織接觸而不導(dǎo)致明顯的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)等，并且與合理的受益/風險比率相稱的那些鹽類。胺、羧酸和其他類型化合物的可藥用的鹽是本領(lǐng)域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)(以引用的方式納入本文)中詳細記載了可藥用的鹽。可在本發(fā)明化合物的最終分離和純化過程中原位制備鹽，或通過游離堿或游離酸官能團與合適試劑反應(yīng)而單獨地制備鹽，如下文所概述的。

例如，游離堿官能團可與合適的酸反應(yīng)。此外，當本發(fā)明的化合物攜帶酸性基團時，其適合的可藥用的鹽可包括金屬鹽，例如堿金屬鹽類，例如鈉鹽或鉀鹽；以及堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽?？伤幱玫臒o毒的酸加成鹽的實例為氨基與無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的鹽、或通過使用本領(lǐng)域中使用的其他方法如離子交換而形成的氨基鹽。其他可藥用的鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate)、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。其他可藥用的鹽包括，如果適合，使用抗衡離子(例如鹵化物、氫氧化物、羧酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、低烷基磺酸鹽和芳基磺酸鹽)形成的無毒的銨、季銨和胺陽離子的鹽。

本文使用的術(shù)語“可藥用的酯”是指在體內(nèi)水解的酯且包括易于在人體中分解以離開母體化合物或其鹽的那些酯。合適的酯基團包括，例如，來自可藥用的脂肪族羧酸(特別是烷酸、烯酸、環(huán)烷酸和烷二酸)的那些，其中各烷基或烯基有利地具有不多于6個碳原子。具體的酯的實例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基丁二酸酯。

如上所述，所述藥物組合物可額外地包括可藥用的載體。所述載體包括任何或所有溶劑、稀釋劑或其他液體載體、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等，其適合于所需的特定劑型。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公開了用于配制藥物組合物的各種載體以及已知的制備它們的技術(shù)。除了與所述化合物不相容(例如通過產(chǎn)生任何不想要的生物效應(yīng)或以有害方式與所述藥物組合物的任何其他組分相互作用)的任何常規(guī)載體介質(zhì)外，預(yù)期常規(guī)載體介質(zhì)的使用落在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？勺鳛榭伤幱幂d體的物質(zhì)的一些實例包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；黃芪膠粉；麥芽；明膠；滑石；賦形劑例如可可脂和栓劑蠟；油類，例如花生油、棉花籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，例如丙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原的水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇和磷酸鹽緩沖液，以及其他無毒的相容的潤滑劑如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、涂層劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑，防腐劑和抗氧化劑也可存在于所述組合物中，這依據(jù)調(diào)制人員的判斷。

可將用于本發(fā)明的組合物配制成具有任意濃度的所需化合物。在一些實施方案中，配制所述組合物以使其包含至少治療有效量的改變iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物。治療有效量是在給藥條件下足以實現(xiàn)所需治療效果的量，例如足以治療癌癥、加速傷口愈合或治療炎性病癥的量。在一些實施方案中，配制所述組合物以使其包含不會導(dǎo)致一種或多種不想要的副作用的量。在某些實施方案中，配制所述組合物以使所述化合物以約1mg/mL至約20mg/mL、約1mg/mL至約15mg/mL、約1mg/mL至約10mg/mL、約2mg/mL至約9mg/mL、約3mg/mL至約8mg/mL、約4mg/mL至約7mg/mL、約4mg/mL至約6mg/mL的濃度存在。在某些實施方案中，配制所述組合物以使所述化合物以約5mg/mL的濃度存在。

試劑盒

本發(fā)明還提供了組合物和試劑盒，用于預(yù)測改變iRhom多肽活性的化合物在受試者中加速傷口愈合、治療癌癥或治療炎性疾病的能力，或用于確定受試者中的癌癥是否對所述化合物的治療敏感。這些試劑盒包括以下的一種或多種：獲得和/或制備樣品(例如，皮膚活檢、腫瘤活檢或血液樣品)的試劑；確定樣品是否表現(xiàn)出iRhom蛋白水解活性的試劑；確定樣品是否表現(xiàn)出基因(例如，Rhbdf1或Rhbdf2基因)突變的探針和試劑；確定樣品是否表現(xiàn)出野生型基因(例如，Rhbdf1或Rhbdf2基因)序列的探針和試劑；確定樣品中iRhom多肽的半衰期的試劑；確定樣品分泌EGFR配體的試劑；以及使用說明書。

本發(fā)明的試劑盒可任選地包括其他可用于實施本發(fā)明方法的組分。例如，所述試劑盒可包括適于使互補核酸退火或適于使抗體與其特異性結(jié)合的蛋白相結(jié)合的液體(例如，SSC緩沖液)、一個或多個樣品室、描述本發(fā)明方法的實施的指導(dǎo)材料、正常細胞的樣品、癌細胞的樣品、創(chuàng)傷細胞的樣品、炎癥細胞的樣品等。

適應(yīng)癥

傷口愈合

傷口愈合是一個過程，皮膚或另一器官組織在受傷后借助此過程自我修復(fù)。在一個實施方案中，本發(fā)明可用于鑒定在受試者中激活iRhom多肽的蛋白水解位點，從而加速傷口愈合的化合物。

本發(fā)明的方法可用于鑒定在受試者中加速傷口愈合的化合物。在一個實施方案中，所述化合物加速傷口愈合，以實現(xiàn)傷口閉合。在一個實施方案中，所述傷口可以是開放的皮膚傷口，例如燒傷、化學(例如堿)燒傷引起的傷口、物理創(chuàng)傷的傷口、神經(jīng)性潰瘍、壓瘡、靜脈淤滯性潰瘍和糖尿病性潰瘍。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了激活iRhom多肽的蛋白水解位點以在受試者中加速、促進或增強傷口愈合的化合物或藥物組合物。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供了上文所述或本文他處所述的化合物的任一種激活iRhom多肽的蛋白水解位點以在傷口周圍或傷口附近加速傷口愈合或調(diào)節(jié)一種或多種細胞特性的用途。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了上文所述的組合物在傷口周圍或傷口附近增強傷口愈合或調(diào)節(jié)一種或多種細胞特性的用途。

癌癥

本發(fā)明的化合物可用于在受試者中治療癌癥。本發(fā)明的化合物也可用于在受試者中降低腫瘤生長和/或進展。

在一個實施方案中，本發(fā)明可用于鑒定能夠在受試者中降低腫瘤生長和/或進展或治療癌癥的化合物。在一個實施方案中，所述化合物抑制iRhom多肽的蛋白水解位點，從而減少iRhom多肽的生理靶標的分泌和/或降低EGFR活性，從而降低腫瘤生長和/或進展。在另一個實施方案中，所述化合物抑制iRhom多肽的蛋白水解位點，從而減少iRhom多肽的生理靶標的分泌和/或降低EGFR活性，從而可用于治療癌癥。

在一些實施方案中，編碼iRhom2的基因RHBDF2的錯義突變(p.I186T；p.P189L；p.D188N)可導(dǎo)致胼胝癥及人食管癌，其特征在于掌跖和口的過度角化。

本發(fā)明的化合物也可用于治療各種癌癥。在一個實施方案中，所述癌癥為上皮癌。在另一個實施方案中，所述癌癥為食管癌、肺癌、腦癌、結(jié)腸癌、腎癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴腺癌或膀胱癌。

本發(fā)明的化合物也可用于治療各種腫瘤。在一個實施方案中，所述腫瘤是實體瘤。

炎癥

本發(fā)明的化合物可用于在受試者中減輕炎癥。本發(fā)明的化合物可用于治療炎性疾病和/或病癥。炎性疾病和/或病癥包括，例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、冷球蛋白血癥、脈管炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征(Sjoegren’s syndrome)、葡萄膜炎、脊椎關(guān)節(jié)炎、流產(chǎn)、先兆子癇、尋常痤瘡、哮喘、自身免疫性疾病、乳糜瀉、慢性前列腺炎、腎小球性腎炎、超敏反應(yīng)、炎性腸疾病(包括潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性腸炎(Crohn’s disease))、盆腔炎性疾病、再灌注損傷、類風濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、移植排斥、脈管炎、間質(zhì)性膀胱炎、動脈粥樣硬化、過敏反應(yīng)、肌病、白細胞缺陷、銀屑病、多發(fā)性硬化癥和癌癥。

在一個實施方案中，本發(fā)明可用于鑒定能夠在受試者中減輕炎癥或治療炎性疾病的化合物。在一個實施方案中，所述化合物降低iRhom多肽的蛋白水解結(jié)構(gòu)域的活性，以使iRhom多肽的生理靶標的分泌減少和/或TNFα分泌減少，從而使炎癥減輕。在另一個實施方案中，所述化合物降低iRhom多肽的蛋白水解結(jié)構(gòu)域的活性，以使iRhom多肽的生理靶標的分泌減少和/或TNFα分泌減少，所述化合物因此可用于于治療炎性病癥或疾病。在另一個實施方案中，本發(fā)明的化合物通過靶向細胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域或跨膜肽酶域而減少TNFα分泌，從而可用于在受試者中減輕炎癥。

可利用各種測試測定化合物治療炎性病癥的功效。

毛發(fā)生長

本發(fā)明的化合物可用于在受試者中治療禿頂和/或促進毛發(fā)生長。毛發(fā)脫落或禿頂(例如，脫發(fā)癥(alopecia))是毛發(fā)從頭部或身體脫落。禿頂可以指一般的毛發(fā)脫落、男性模式的禿頂或女性毛發(fā)脫落。一些類型的禿頂可由斑禿(alopecia areata)——一種自身免疫性疾病——引起。斑禿的極端形式為全禿(alopecia totalis)，其包括全部頭發(fā)的脫落，以及普禿(alopecia universalis)，其包括頭部和身體的全部毛發(fā)脫落。

在一個實施方案中，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：cub突變導(dǎo)致變禿。在另一個實施方案中，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：cub(Mcub)的修飾因子促進毛發(fā)生長、治愈變禿、矯正變禿或減輕變禿(實施例1)。

在一個實施方案中，本發(fā)明可用于鑒定能夠在受試者中促進毛發(fā)生長的化合物，其包括：使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；并測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少，或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低指示所述化合物能夠在受試者中促進毛發(fā)生長。

在另一個實施方案中，本發(fā)明可用于鑒定能夠在受試者中治愈和/或矯正禿頂?shù)幕衔?，其包括：使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；并測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少，或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低指示所述化合物能夠在受試者中治愈和/或矯正禿頂。

通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行舉例說明，所述實施例不應(yīng)解釋為限制性的。本申請通篇引用的所有文獻、專利和公開的專利申請的全部內(nèi)容由此以引用的方式納入本文。

實施例

實施例1：cub突變導(dǎo)致EGFR信號傳導(dǎo)通路的過度激活

被命名為卷曲-裸露(cub)的隱性小鼠突變的特征為無毛表型。顯性Mcub等位基因的單拷貝與cub/cub基因型的組合產(chǎn)生豐滿、卷曲的毛皮而非cub/cub mcub/mcub小鼠的無毛毛皮。我們研究了cub/cub mcub/mcub基因型是否可能與改變的EGFR信號傳導(dǎo)方面(例如，細胞增殖和細胞遷移)有關(guān)。

我們對從cub/cub mcub/mcub小鼠和對照(+/+mcub/mcub)小鼠分離的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)進行增殖、細胞遷移(劃痕-傷口愈合)和免疫印跡測定。圖1A-1F示出了cub突變加速EGFR相關(guān)的細胞增殖和遷移以及皮膚愈合。

cub/cub mcub/mcub MEF相對于對照MEF具有顯著更高的增殖率和遷移率(圖1A和1B)。這些改變與EGFR通路的典型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(包括Akt、S6、mTOR和p38)的磷酸化的顯著增加有關(guān)(圖1C)。此外，我們觀察到cub/cub mcub/mcub MEF中細胞表面EGFR水平的顯著下降(圖1C)，表明EGFR信號傳導(dǎo)的內(nèi)化和組成型激活。

為了測試EGFR信號傳導(dǎo)的增加是否對應(yīng)于上皮增殖的變化，我們進行了傷口-愈合測定，在測定中我們在6-40周齡cub小鼠的耳中穿出2mm通孔并在隨后的多天監(jiān)測閉合率(圖1D-1E)。在14天中，與對照+/+mcub/mcub同窩幼仔相比，cub/cub mcub/mcub小鼠顯示出加速閉合。相對于對照小鼠，+/cub mcub/mcub小鼠(其具有正常皮毛)還在受傷后14天顯示出更快的愈合，參見圖9A和9B，表明單一突變的cub等位基因能夠引起EGFR信號傳導(dǎo)的增加，盡管增加的水平不足以阻斷毛囊誘導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)表明，cub/cub mcub/mcub基因型產(chǎn)生了活性過高的EGFR表型。

實施例2：cub是編碼iRhom2的Rhbdf2基因的突變

接下來，我們檢驗了作為cub突變的候選物的iRhom2基因Rhbdf2。cub/cub小鼠的DNA測序鑒定出Rhbdf2基因中12,681堿基對(bp)缺失，這導(dǎo)致外顯子2-6的缺失(圖2A)。為了測試所述缺失是否產(chǎn)生異常的Rhbdf2轉(zhuǎn)錄物，我們使用被設(shè)計以擴增外顯子2、5、12和19的引物對來自野生型和cub/cub mcub/mcub MEF的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)。cub轉(zhuǎn)錄物含有外顯子12和19，但是缺少外顯子2和5(圖2B)。另外，對來自cub/cub mcub/mcub和+/+mcub/mcub皮膚的RNA進行的定量RT-PCR(qPCR)擴增出cub轉(zhuǎn)錄物，其中外顯子2-6被缺失但是其余外顯子被表達，表明在cub小鼠中cub基因的其余部分被轉(zhuǎn)錄(圖2C)。為了測試cub轉(zhuǎn)錄物是否導(dǎo)致外顯子1至7的剪接，我們使用專門被設(shè)計以僅擴增包含剪接至外顯子7的外顯子1的轉(zhuǎn)錄物的探針進行qPCR。使用該探針，我們在cub/cub mcub/mcub小鼠中檢測到PCR產(chǎn)物，但是未在+/+mcub/mcub小鼠中檢測到(圖2D)。這些發(fā)現(xiàn)確認了cub是Rhbdf2基因的突變，并將在下文中被稱為Rhbdf2^cub。

考慮到Rhbdf2^cub轉(zhuǎn)錄物中外顯子3中的正常翻譯起始位點是缺失的，我們接下來測試這些突變轉(zhuǎn)錄物是否會產(chǎn)生突變的iRhom2蛋白。對Rhbdf2^cub DNA的序列分析表明下一個框內(nèi)翻譯起始位點(ATG)在外顯子8中，其將產(chǎn)生約63.5kDa的蛋白。由于我們?nèi)鄙賗Rhom2的抗體，我們通過將全長野生型人RHBDF2cDNA(Hu Wt)以及模擬突變Rhbdf2^cub轉(zhuǎn)錄物的版本(HuCub)同時克隆到C-末端Flag標記的表達載體中，測試了Rhbdf2^cub轉(zhuǎn)錄物是否能夠在體外產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物。首先，使用免疫印跡法，我們確定Hu Wt克隆產(chǎn)生約100kDa的蛋白產(chǎn)物，而HuCub突變體構(gòu)建體產(chǎn)生約67kDa的產(chǎn)物，這與預(yù)期的標記蛋白的分子量一致(圖2E)。此外，Hu Wt克隆中沒有任何縮短的蛋白產(chǎn)物的證據(jù)。第二，我們使用免疫染色法檢驗了用Hu Wt或HuCub克隆轉(zhuǎn)染B6MEF之后兩種蛋白形式的定位模式(圖2F以及圖10A和10B)。這兩種形式都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達，并且在高爾基體或細胞核中未觀察到染色(圖10A和10B)，表明所述突變未導(dǎo)致蛋白定位改變。

實施例3：遺傳非互補證實cub是Rhbdf2基因的突變等位基因，并且是功能獲得性突變

為了測試Rhbdf2^cub是否是功能獲得性突變而非無效突變，我們使用來自敲除小鼠項目(KOMP)庫的ES細胞產(chǎn)生了Rhbdf2敲除(Rhbdf2^-/-)小鼠，其中l(wèi)acZ表達是在內(nèi)源Rhbdf2啟動子的控制下(圖3A)。主要在皮膚的表皮和毛囊的內(nèi)鞘層和外鞘層中觀察到Rhbdf2啟動子驅(qū)動的lacZ表達(圖3B)。但是，在Rhbdf2^cub/cub小鼠中觀察到的傷口愈合(圖3C)和毛發(fā)脫落(圖3D)表型未見于Rhbdf2^-/-小鼠中，其在其他方面看起來是正常的。Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠的等位基因測試交配產(chǎn)生了具有稀疏毛皮的復(fù)合突變(Rhbdf2^-/cub)小鼠，表明遺傳非互補，并且證實cub是Rhbdf2基因的突變等位基因。另外，Rhbdf2^-/cub復(fù)合突變小鼠的毛發(fā)生長水平介于Rhbdf2^cub/cub小鼠和Rhbdf2^+/+或Rhbdf2^-/-小鼠之間，證實突變Rhbdf2^cub蛋白產(chǎn)物的表達而非Rhbdf2缺乏導(dǎo)致Rhbdf2^cub/cub表型。

實施例4：Rhbdf2^cub表型的遺傳修飾因子(Mcub)是Areg基因的功能喪失性突變

接下來我們試圖定位引起Rhbdf2^cub修飾基因(Mcub)的突變。我們檢驗了4個作為Mcub突變的候選基因座的編碼EGFR配體的基因(Epng、Ereg、Areg和Btc)。通過對Mcub/Mcub Rhbdf2^cub/cub小鼠中各基因的外顯子和側(cè)翼區(qū)進行測序(參見表II)，我們發(fā)現(xiàn)Mcub是Areg(編碼自分泌角化細胞生長因子雙調(diào)蛋白(本文中稱為AREG)的基因)中的功能喪失性突變(圖4A)。

Mcub是T至G的點突變，所述突變破壞外顯子1的典型供體剪接位點并導(dǎo)致排他使用可變的下游剪接位點，其向Areg轉(zhuǎn)錄物添加22個額外的核苷酸；這破壞了編碼框并引入提前終止密碼子(圖11)。該突變將在下文中被稱為Areg^Mcub。值得注意的是，當存在單拷貝的顯性Areg^Mcub等位基因時，Rhbdf2^cub/cub小鼠的活性過高的EGFR信號傳導(dǎo)(圖12A)和快速的傷口閉合的能力顯著降低(圖4B和4C)，并阻止了毛發(fā)缺失表型的出現(xiàn)。顯性Areg^Mcub突變并不賦予Rhbdf2^cub/cub小鼠正常毛皮，而是賦予卷曲毛發(fā)表型，表明EGFR途徑中的其余異常情況。

我們接下來測量了Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub和Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠中AREG的血清水平。我們發(fā)現(xiàn)Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub小鼠的血清中無可檢測的AREG，但是與Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠相比在Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+小鼠中觀察到血清AREG水平的顯著升高(圖4D)。

對來自Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+、Rhbdf2^cub/cub Areg^Mcub/Mcub和Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠的經(jīng)培養(yǎng)的小鼠表皮角化細胞(MEK)的上清液AREG水平進行的測量產(chǎn)生了相似的結(jié)果(圖4E)。AREG在正常皮膚中大量表達；因此，我們接下來對來自Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+和Rhbdf2^+/+Areg^+/+小鼠的皮膚樣品進行qPCR以測量Areg以及6種其他已知編碼EGFR配體的基因(Egf、Tgfα、Btc、Epgn、Ereg和Hbegf)的轉(zhuǎn)錄物水平。與對照相比，我們在Rhbdf2^cub/cub Areg^+/+小鼠中觀察到Areg的4倍增加，以及Epgn和Hbegf mRNA的微小但統(tǒng)計學上顯著的增加。此外，Btc和Egf轉(zhuǎn)錄物水平出現(xiàn)統(tǒng)計學上顯著的降低(圖4F)。

最后，為了檢驗AREG是否介導(dǎo)活性過高的EGFR表型，我們使用慢病毒shRNA使Rhbdf2^+/+和Rhbdf2^cub/cub MEF中的Areg表達沉默(圖12B)并進行了增殖測定。Areg沉默對Rhbdf2^+/+MEF的增殖具有微小的影響(圖12C)，而Rhbdf2^cub/cub MEF的增殖率顯著降低(圖12D)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明提高的AREG水平通過增加EGFR信號傳導(dǎo)來介導(dǎo)Rhbdf2^cub/cub小鼠的突變表型。此外，我們的數(shù)據(jù)表明Rhbdf2^cub表型由Areg^Mcub表達修飾。

實施例5：N-末端截短的iRhom2(Rhbdf2^cub)的肽酶域誘導(dǎo)不依賴于ADAM17的EGFR配體的底物特異性分泌

為了測試Rhbdf2^cub是否能夠——通過其短的N-末端結(jié)構(gòu)域——誘導(dǎo)不依賴于金屬蛋白酶活性的AREG分泌，我們在馬立馬司他(MM)——一種能夠同時阻止ADAM17和ADAM10依賴性底物脫落的強效廣譜金屬蛋白酶抑制劑——存在或不存在的情況下進行了體外裂解測定。由于小鼠和人RHBDF2基因之間的顯著同源性，我們單獨使用人AREG或使用人AREG與人野生型(Hu Wt)或人Cub(HuCub)RHBDF2基因轉(zhuǎn)染293T細胞(圖5A)，并在條件培養(yǎng)基中測量AREG水平。在不存在MM時，我們觀察到表達AREG的細胞和共表達AREG/HuCub的細胞之間的AREG水平?jīng)]有差異，而Hu Wt和AREG的共表達使AREG水平降低約60％(圖5B)。在存在MM時，與用Hu Wt和AREG轉(zhuǎn)染或單獨用AREG轉(zhuǎn)染的細胞相比，HuCub/AREG共轉(zhuǎn)染的細胞中AREG水平約高出兩倍(圖5B)。這些數(shù)據(jù)表明，N-末端截短的iRhom2能夠增強AREG分泌，該分泌僅在金屬蛋白酶活性減小時變得明顯。

可通過在用細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)刺激之后檢查腫瘤壞死因子α(TNFα)分泌來測量小鼠中的ADAM17活性。我們使用該方法，通過將LPS注射到Rhbdf2^cub/cub、Rhbdf2^-/-和Rhbdf2^+/+小鼠中并測量血清TNFα水平以測試Rhbdf2^cub小鼠中ADAM17活性的變化。我們發(fā)現(xiàn)相對于注射LPS的Rhbdf2^+/+小鼠，注射LPS的Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠均具有顯著更低的TNFα誘導(dǎo)(圖5C)。這些結(jié)果表明在Rhbdf2^cub/cub和Rhbdf2^-/-小鼠中ADAM17活性顯著減弱，也顯示了iRhom2的N-末端結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)ADAM17依賴性TNFα釋放中的作用。值得注意的是，LPS刺激的Rhbdf2^cub/cub小鼠中血清TNFα水平并未完全消除，表明ADAM17活性減弱但并未消失。觀察到的Rhbdf2^cub/cub小鼠中的ADAM17活性減弱解釋了與Adam17^-/-小鼠相比或與過表達雙調(diào)蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠相比Rhbdf2^-/-和Rhbdf2^cub/cub小鼠中的非致死性或非炎性皮膚表型。

接下來，評估了活性菱形蛋白酶對其他EGF樣底物的蛋白酶選擇性，以及這些是否與HuCub有區(qū)別。我們發(fā)現(xiàn)，與空載體轉(zhuǎn)染的對照相比，RHBDL2選擇性地增加EGF的分泌但不增加AREG或HB-EGF的分泌(圖5D)。相比之下，與空載體轉(zhuǎn)染的細胞相比，HuCub選擇性地增加AREG和HB-EGF的分泌但不增加EGF的分泌(圖5E-5G)。這些結(jié)果表明，菱形蛋白酶肽酶域賦予底物選擇性。N-末端截短的iRhom1能夠誘導(dǎo)AREG分泌但不能誘導(dǎo)EGF分泌與該論斷一致(圖13A和13B)。

為了確定iRhom2肽酶域如何有助于調(diào)節(jié)EGF樣底物的分泌，我們首先比對了人和小鼠iRhom的肽酶域的氨基酸序列。我們發(fā)現(xiàn)人iRhom2和RHBDL2的肽酶域之間的蛋白序列同源性具有顯著差異(圖13C)。相比之下，iRhom1和2的肽酶域顯示出96％的同源性。這共同表明有活性和無活性的菱形蛋白酶之間形成活性位點或在底物識別中發(fā)揮作用的殘基顯著不同。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與天然HuCub相比，HuCub肽酶域的缺失顯著減少了AREG分泌(圖5G)，表明所述肽酶域?qū)τ贓GF樣底物的分泌是必需的。為了鑒定關(guān)鍵殘基，我們進行了定點誘變，以使HuCub肽酶域中的關(guān)鍵殘基突變?yōu)楸彼?。我們發(fā)現(xiàn)第4跨膜結(jié)構(gòu)域中的第426位谷氨酰胺和第432位半胱氨酸以及分別在第2和6跨膜結(jié)構(gòu)域中的第336位和第475位組氨酸不僅對于介導(dǎo)AREG/HB-EGF的分泌增加是關(guān)鍵的，而且對于EGF的抑制也是關(guān)鍵的(圖5H、I)。但是，絲氨酸突變S362A、402A和425A，谷氨酸突變E436A，以及谷氨酰胺突變Q439A不改變AREG分泌(圖13D)。這些結(jié)果共同表明N-末端截短的iRhom的肽酶域中的關(guān)鍵殘基(圖5J和圖13E)調(diào)節(jié)不依賴于金屬蛋白酶活性的EGF樣底物的分泌。

實施例6：N-末端截短的iRhom2(Rhbdf2^cub)增強對上皮癌的易感性

RHBDF2的錯義突變(p.I186T、p.P189L和p.D188N)可以是家族性胼胝癥以及食管癌綜合征(TOC)的起因。為了測試由于RHBDF2中的顯性N-末端突變而增加的AREG分泌是否可能通過在293T細胞中共表達AREG與含有人錯義突變(RHBDF2p.I186T)的HuWt克隆、HuCub或Hu Wt在體外驅(qū)動這些人類病理變化。與Hu Wt相比，RHBDF2p.I186T或HuCub的表達導(dǎo)致AREG在條件培養(yǎng)基中的更高水平和更低的細胞內(nèi)水平(圖6A和6B)。此外，RHBDF2p.I186T產(chǎn)生的AREG水平與HuCub所產(chǎn)生的那些相當，表明iRhom2N-末端的缺失或顯性突變導(dǎo)致AREG分泌增加。另外，我們發(fā)現(xiàn)，RHBDF2p.I186T突變體的肽酶域中的4個關(guān)鍵殘基(H、C、Q和H)中的至少一個的缺失導(dǎo)致AREG分泌顯著減少(圖6C)。

為了確定Rhbdf2^cub等位基因是否增強腫瘤易感性，我們研究了在Apc^Min/+小鼠(人家族性腺瘤性息肉病的小鼠模型)中其表達如何影響腺瘤形成。在Apc^Min/+小鼠中，一個野生型Apc等位基因的自發(fā)缺失誘導(dǎo)腸內(nèi)上皮腺瘤形成，以及在169天的中值年齡時的過早死亡。值得注意的是，在小腸中觀察到Rhbdf2(圖6D)和Areg表達，表明可能的功能性關(guān)系。我們產(chǎn)生并觀察了Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub和Apc^Min/+Rhbdf2^+/+小鼠，但是由于致死率增加我們無法產(chǎn)生足夠的Apc^Min/+Rhbdf2^cub/cub小鼠用于有意義的比較。盡管如此，我們確實觀察到Apc^Min/+Rhbdf2^+/+(172天)和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub(135天)小鼠的中值生存期的顯著差異(圖6E)。對3月齡的Apc^Min/+Rhbdf2^+/+和Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠的尸檢揭示Apc^Min/+小鼠中單一Rhbdf2^cub等位基因的存在顯著增加了息肉的數(shù)目(圖6F和6G)和腺瘤大小(圖6F和6H)，表明cub突變使上皮腫瘤生長增加。但是，在最長達2年齡的Rhbdf2^cub/cub小鼠中沒有自發(fā)的癌癥發(fā)生，表明Rhbdf2^cub突變產(chǎn)生了有利于腫瘤發(fā)展的環(huán)境，但是并不單獨地驅(qū)使腫瘤發(fā)展。

實施例7：RHBDF2基因的細胞溶質(zhì)N-末端的缺失或N-末端中的顯性突變增加了其蛋白穩(wěn)定性

iRhom2通過促進EGF樣配體經(jīng)蛋白酶體通路降解而負調(diào)控EGFR信號傳導(dǎo)。我們確定，當缺少細胞溶質(zhì)N-末端時，iRhom誘導(dǎo)AREG/HB-EGF的分泌(圖5)。為了測試iRhom2的氨基端的功能獲得性突變是否干擾蛋白酶體加工并由此增加其穩(wěn)定性，我們檢驗了胼胝RHBDF2突變體p.I186T是否能夠與AREG相互作用。我們發(fā)現(xiàn)，類似于Hu Wt和HuCub，p.I186T與AREG形成物理復(fù)合體(圖7A)。我們之后通過免疫細胞化學和流式細胞術(shù)比較了293T和COS7細胞中Hu Wt、HuCub和p.I186T的蛋白表達水平。我們觀察到，與HuCub和p.I186T相比，HuWt蛋白表達水平顯著更低(圖7B、C)。此外，當我們對COS7細胞進行所示時間的環(huán)己酰胺(一種蛋白合成抑制劑)追蹤時，在1小時內(nèi)我們觀察到與HuCub或p.I186T相比Hu Wt的免疫反應(yīng)性約下降50％(圖7D、E)。

為了測試iRhom2是否是蛋白酶體降解的靶標，我們測定了在強效蛋白酶體抑制劑MG-132的存在下Hu Wt和HuCub的蛋白半衰期。意料之中的，Hu Wt的蛋白半衰期顯著增大，但是HuCub的并沒有(圖7F)，表明iRhom2的蛋白酶體降解可能影響其蛋白穩(wěn)定性。我們得出結(jié)論，類似于Rhbdf2^cub突變，iRhom2的氨基端的錯義突變增加了其穩(wěn)定性并有助于增加不依賴于金屬蛋白酶活性的AREG的分泌。

實施例8

此處，我們報道了iRhom2(被熟知作為果蠅屬中EGFR信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)子的菱形蛋白酶家族的成員)在皮膚愈合和腫瘤發(fā)展中能夠調(diào)節(jié)EGFR信號傳導(dǎo)。我們證明了iRhom2是短壽命蛋白，其穩(wěn)定性可通過N-末端結(jié)構(gòu)域的選擇突變而增加。這些穩(wěn)定的變體進而發(fā)揮增加不依賴于金屬蛋白酶活性的AREG分泌的作用。我們鑒定了iRhom在EGFR依賴性細胞增殖和創(chuàng)傷愈合中的重要作用，并證明了在適當?shù)那闆r下增加EGFR信號傳導(dǎo)的iRhom2突變?nèi)绾文軌虼龠M腫瘤發(fā)展。

N-末端結(jié)構(gòu)域和肽酶域在調(diào)節(jié)EGFR信號傳導(dǎo)中具有獨立的功能

iRhom是復(fù)合多結(jié)構(gòu)域酶，其包含長的細胞溶質(zhì)N-末端、休眠的肽酶域和保守的iRhom同源結(jié)構(gòu)域(IRHD)；這些結(jié)構(gòu)域的功能仍然是未知的。在正常情況下，iRhom通過促進EGF樣底物的降解而負調(diào)控EGFR信號傳導(dǎo)。但是，Rhbdf2^cub突變不可能只是功能喪失性突變。Rhbdf2^-/-小鼠無法重現(xiàn)(recapitulate)Rhbdf2^cub表型。此外，我們證明，與Rhbdf2^cub突變類似，iRhom2的N-末端的顯性錯義突變以由肽酶域的跨膜螺旋2、4和6中的關(guān)鍵氨基酸介導(dǎo)的方式誘導(dǎo)AREG和HB-EGF的分泌。因此，我們的結(jié)果表明，iRhom2的細胞溶質(zhì)N-末端通過抑制肽酶域而負調(diào)控EGFR信號傳導(dǎo)，從而負調(diào)控AREG/HB-EGF的分泌(圖8)。我們的發(fā)現(xiàn)還揭示出iRhom2的更精細的調(diào)控功能，其在N-末端突變(例如Rhbdf2^cub)中被揭示出。

Rhbdf2^cub可被認為是功能獲得性突變。該結(jié)論由若干證據(jù)支持。首先，iRhom2的負調(diào)控作用似乎是最小的，因為除非與Rhbdf2^cub突變結(jié)合，Rhbdf2^-/-小鼠并不表現(xiàn)出明顯的“EGFR活性過高”的表型。第二，與Hu Wt和AREG的轉(zhuǎn)染或單獨的AREG轉(zhuǎn)染相比，HuCub和AREG的共轉(zhuǎn)染使AREG水平約高出2-3倍。第三，HuCub的表達誘導(dǎo)不依賴于金屬蛋白酶活性的膜錨定的AREG和HB-EGF的分泌。第四，突變的iRhom2等位基因在不存在肽酶域的情況下無法誘導(dǎo)AREG/HB-EGF的分泌。與這些觀察一致的是，N-末端截短的RHBDF1而非全長RHBDF1的轉(zhuǎn)基因表達在果蠅屬中誘導(dǎo)強EGFR信號傳導(dǎo)相關(guān)的翅表型。另外，被截短的RHBDF1與HB-EGF的共表達在果蠅屬中強化了改變的翅表型，表明被截短的iRhom1可能誘導(dǎo)HB-EGF的分泌，從而激活EGFR信號傳導(dǎo)。這些結(jié)果驗證了以下觀點：細胞溶質(zhì)N-末端有助于iRhom引起的EGF家族配體的泛素加工，而iRhom肽酶域在不被N-末端抑制時刺激EGFR信號傳導(dǎo)。

我們發(fā)現(xiàn)在飽和濃度的馬立馬司他(一種強效、廣譜的金屬蛋白酶抑制劑)存在下，突變的iRhom2等位基因誘導(dǎo)AREG和HB-EGF的分泌。ADAM家族其他成員的成熟不受這兩種iRhom的缺乏的影響。此外，我們證明了在Rhbdf2^cub小鼠中ADAM17活性減弱。因此，我們得出結(jié)論，Rhbdf2^cub和胼胝突變選擇性地誘導(dǎo)不依賴于金屬蛋白酶活性的AREG和HB-EGF分泌，并且跨膜肽酶域?qū)υ摴δ苁潜匦璧摹?/p>

在Rhbdf2^cub小鼠中活性過高的EGFR通路是皮膚加速愈合的原因

傷口愈合的生物學是復(fù)雜的。在人類中，成年人的傷口易受到非功能性纖維組織形成的影響，而胎兒期的傷口能實現(xiàn)完全再生，類似于脊椎動物(例如美西螈)和真渦蟲中的無傷疤愈合。

組織再生和重塑領(lǐng)域仍處于初級階段。在人角化細胞系中進行的體外傷口愈合測定表明，與未受傷的對照相比，受傷后RHBDL2的表達顯著上調(diào)。

Rhbdf2^cub小鼠能夠快速使傷口愈合而不形成明顯傷疤的原因可能是以下二者的結(jié)合：由于ADAM17活性減弱而使TNFα分泌減少，以及增加的AREG產(chǎn)生/EGFR過度激活所引起的快速上皮再生。我們提出，在Rhbdf2^cub小鼠中盡管TNFα減少有助于使炎癥程度更低，但AREG產(chǎn)生增加促進增殖加速和角化細胞遷移到傷口處。此外，iRhom2主要在皮膚中表達，使其成為受損的皮膚傷口愈合中潛在的新治療靶標。

在一些上皮癌中iRhom2-AREG-EGFR通路具有組成型活性

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)N-末端截短的iRhom2促進不依賴于ADAM17活性的AREG產(chǎn)生的增加，從而誘導(dǎo)EGFR激活。特別地，Apc^Min/+Rhbdf2^+/cub小鼠的表型重現(xiàn)了在具有顯性RHBDF2突變的患者中所見的對上皮癌的增強的易感性。但是，Rhbdf2^cub/cub小鼠并未自發(fā)地發(fā)展腫瘤，表明Rhbdf2^cub突變可能并不驅(qū)使癌癥發(fā)展，而是可能通過產(chǎn)生有利環(huán)境而促進腫瘤生長和進展。

材料和方法

在Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)在改良的屏障(barrier)條件下獲得、飼養(yǎng)并維持小鼠。將所有基因型(包括cub和Mcub)維持在C57BL/6J(B6)遺傳背景上。為了產(chǎn)生Rhbdf2^-/-小鼠，將從敲除小鼠項目(KOMP)庫獲得的ES細胞克隆(EPD0208_1_A09)注射到B6-Tyr^c(B6白化病)胚泡中。使表現(xiàn)出>50％嵌合性的雄性與B6白化病雌性交配；通過PCR對黑色后代進行基因分型。使雜合體相互交配以產(chǎn)生純合體，或使雜合體與Rhbdf2^cub/cub小鼠交配以產(chǎn)生Rhbdf2^-/cub小鼠。Jackson實驗室的動物保護與使用委員會批準了全部實驗操作。

細胞培養(yǎng)和試劑——如之前所述我們分離了MEF。根據(jù)制造商的說明書(CELLnTEC/Zenbio，Research Triangle Park，NC)分離小鼠表皮角化細胞(MEK)。使細胞生長在37℃、含有5％CO₂的增濕室中。分別從Fisher Scientific(Boston，MA)和Zen-Bio(Research Triangle Park，NC)購買MEF試劑[(磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、HyClone Dulbeccos Modified Eagles培養(yǎng)基、高葡萄糖(DMEM)、青霉素-鏈霉素和HyClone胎牛血清)]和MEK試劑(祖細胞靶向培養(yǎng)基CnT-07、抗生素/抗真菌溶液ABM和蛋白酶Dispase)。從Life technologies(Chicago，IL)獲得TrypLETM Select。使293T和COS7細胞分別生長在DMEM和RPMI培養(yǎng)基中。

組織學——如之前所述制備用于組織學檢查的組織。

耳孔閉合：使用外科手術(shù)用的耳打孔裝置Napox KN-292B使小鼠受傷以在左耳中央制造2mm通孔，并在28天期間分析閉合率。在所示的時間點，使小鼠安樂死并使用4×物鏡(Olympus BX41顯微鏡)捕獲耳孔及周圍組織的圖像。ImageJ軟件分析受傷區(qū)域。在室溫下將耳固定在10％中性緩沖福爾馬林(NBF)中24h并進行石蠟包埋和切片處理。在第0天測量物理創(chuàng)傷面積并將在所有隨后時間點的測量值計算為初始面積的百分數(shù)。

增殖和劃痕測定：使用MEF進行這兩組測定。對于增殖測定，在37℃使所示數(shù)目的細胞生長在膠原包被的96孔板中。孵育24h之后，移除生長培養(yǎng)基并在-80℃冷凍平板直至使用。使用細胞增殖試劑盒測定相對細胞數(shù)目(Life technologies)。使用Victor³多標記孔板讀數(shù)儀(PerkinElmer，Boston，MA)測量熒光強度。對于劃痕測定，使MEF在膠原包被的6孔板中生長至匯合，并通過將無菌p200吸管端拉過孔從匯合的單層除去一條細胞。使用Zeiss Observer相差顯微鏡上的5×物鏡和Axio Vision 4.6.3軟件在0、3、6、9和12h時獲取劃痕圖像。使用GRID插件，我們在每個圖像上覆蓋了網(wǎng)格。所述網(wǎng)格大小使至少10條線等分劃痕圖像。匯集各劃痕的寬度并計算平均值。用ImageJ軟件分析來自0、3、6、9和12h時間序列的捕獲圖像。

人AREG、HB-EGF和EGF ELISA：在被接種于24孔板的293T細胞中進行瞬時轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體LTX以及Plus試劑，將16.5fmol HuWt或HuCub與25ng AREG或50ng HB-EGF或200ng EGF共轉(zhuǎn)染。使每個孔中轉(zhuǎn)染的DNA總量與pCMV6-AC-HA載體等量。24h之后，用溶于1ml新鮮培養(yǎng)基的DMSO或10μM MM替換舊培養(yǎng)基。24h之后，將100μl上清液不稀釋(HB-EGF和EGF)或稀釋5倍(AREG)，并根據(jù)制造商的說明書進行ELISA(DY262、DY259和DY236)。

從OriGene(Rockville，MD)獲得包含編碼人AREG(RC203150)、人HB-EGF(SC108485)、人EGF(SC127840)、人RHBDF2(RC203923)、小鼠Rhbdf1(MC205414)和人RHBDL2(RC219882)的cDNA的表達質(zhì)粒。根據(jù)制造商的說明書使用QuikChange II XL誘變試劑盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)在全長RHBDF2或小鼠Rhbdf1中引入突變(缺失或插入)，并通過DNA測序來驗證。使用引物設(shè)計程序( Primer Design，Agilent Technologies)產(chǎn)生用于定向誘變的引物。

免疫化學：使鋪在BD BioCoat^TM膠原I 2-孔培養(yǎng)載片中的MEF生長至約60％匯合，并根據(jù)制造商的說明書用Lipofectamine^TM LTX(Life technologies)瞬時轉(zhuǎn)染。48h之后，將MEF固定在丙酮中并進行免疫細胞化學。簡言之，在-20℃將于1X冰冷的PBS中沖洗的細胞固定在丙酮中10min，然后在PBS中再沖洗3次。用3％H₂O₂阻斷內(nèi)源過氧化酶活性，然后在阻斷緩沖液(PBST，10％山羊血清和1％BSA)中孵育1h，并在4℃下在DDK特異性抗體(Origene)中過夜孵育。第二天，將細胞在PBST中沖洗25min，并在室溫下在HRP綴合的二級抗體中孵育30min。在PBST中沖洗三次之后，將細胞在DAPI溶液(IHC World，Woodstock，MD)中孵育10min，然后覆蓋蓋玻片并密封載玻片。從Abcam(Cambridge，MA)獲得鈣聯(lián)蛋白和giatin抗體。從Life technologies獲得二級抗體。

免疫沉淀：根據(jù)制造商的說明書(Life technologies)進行293T和COS7細胞轉(zhuǎn)染。用400μl包含完全小蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的細胞裂解緩沖液(Cell Signaling，Danvers，MA)處理鋪在6孔板中的細胞，將細胞在冰上孵育10min并在冷室中以14,000g離心10min。在冷室中，在振蕩平臺上將細胞上清液和20μl與抗DDK抗體(Origene)綴合的磁珠孵育過夜。過夜孵育之后，將磁珠/漿體用TBS-T沖洗三次，使用2X SDS-PAGE上樣緩沖液收集蛋白質(zhì)。

SDS-PAGE和免疫印跡：將細胞用冰冷的PBS沖洗一次并用包含完全小蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的RIPA緩沖液(Cell Signaling，Danvers，MA)在冰上孵育10min。在4℃將細胞裂解物以14,000g離心10min。收集上清液并貯存于-80℃直至進一步使用。使用Qubit熒光計(Life technologies)對蛋白總量進行定量，并將10μg蛋白上樣到4-12％預(yù)制凝膠(Lonza，Allendale，NJ)上，在140V下運行直至低分子量Precision plus蛋白標準品(Bio-Rad)到達凝膠底部。使用iBLOT(Life technologies)將已分開的蛋白質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后在室溫下在溶于TBST(20mM Tris、137mM氯化鈉和0.1％Tween-20)的5％BSA(Cell Signaling Technology)中封閉1h。然后在4℃將膜在一級抗體(1:1000)中孵育過夜，然后在TBST中沖洗三次(每次15min)，然后在室溫下在二級抗體(1:2000)中孵育1h。在TBST中再沖洗90min之后，將膜暴露于SuperSignal West Femto Substrate(Fisher Scientific)5min以檢測辣根過氧化物酶產(chǎn)生的信號。用肌動蛋白特異性抗體對膜進行預(yù)探測。所有的抗體購自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。DDK抗體購自O(shè)rigene(Rockville，MD)。

原代MEF中的雙調(diào)蛋白沉默：鼠Areg shRNA克隆TRCN0000089050(在慢病毒載體pLKO.1中)和pLKO.1中的scramble對照shRNA(質(zhì)粒#1864)分別獲得自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)和Addgene(Cambridge，MA)。使用質(zhì)粒pMDLg/pRRE、pRSV-rev和pMD2.g(Addgene)在293T/17細胞(ATCC)中產(chǎn)生慢病毒粒子。在48h和60h時收集慢病毒上清液，合并上清液并通過0.45μm PVDF過濾器過濾。在5μg/ml聚凝胺的存在下，連續(xù)兩天用慢病毒上清液感染MEF兩次，然后用嘌呤霉素(2μg/ml)選擇72小時，之后用于下游實驗。

息肉計數(shù)和腫瘤面積——對從12周齡的被安樂死的小鼠中摘除的腸道進行沖洗并將其固定于10％中性緩沖福爾馬林中至少24h，進行息肉計數(shù)或組織學檢查。使用數(shù)字掃描儀NanoZoomer 2.0HT(Hamamatsu，Japan)掃描H&E染色的載片。在解剖顯微鏡下對息肉直接計數(shù)或從掃描的數(shù)字圖像進行計數(shù)。值得注意的是，所述兩種方法之間息肉計數(shù)無顯著差異。還使用NanoZoomer 2.0HT軟件從掃描的數(shù)字圖像測量腫瘤面積。

定量實時PCR(qPCR)——使用 Plus RNA純化試劑盒(Life Technologies，Chicago，IL)，根據(jù)制造商的說明書從皮膚分離純化的RNA。用Agilent 2100生物分析儀測定純化的RNA的質(zhì)量。之前已公開了qPCR循環(huán)條件。我們從Life Technologies(Chicago，IL)獲得以下預(yù)設(shè)計的TaqMan基因表達測定的列表，表I。

小鼠TNFα和AREG ELISA——對于小鼠TNFαELISA，對8-12周齡的所示基因型的雌性小鼠靜脈注射70μg來自大腸桿菌O111:B4的脂多糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。3h之后收集血清并冷凍于-80℃。對于AREG ELISA，將從所有基因型采集的血清立即使用或在-20℃貯存不超過24h。根據(jù)制造商的說明書，使用DuoSet ELISA Developmental試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)對樣品進行測定(DY989和DY410)。

流式細胞術(shù)——使用Lipofectamine^TM LTX試劑，用600ng HuWt或HuCub或Hu Wt p.I186T cDNA瞬時轉(zhuǎn)染鋪于6孔板中的293T和COS7細胞。40h之后，在150μg/ml環(huán)己酰胺中孵育細胞0、0.5、1、2和4h。之后，在室溫下將細胞固定于150μl新鮮制備的冰冷的4％PFA中40min。用2ml PBST沖洗細胞一次并在室溫下在黑暗中將細胞重懸于150μl PBST中。再次沖洗后，將細胞重懸于在冰上的包含藻紅蛋白標記的抗DDK一級抗體(1:50)的125μl PBST中30min。最后一次沖洗之后，將細胞重懸于FACS緩沖液并進行流式細胞術(shù)分析(BD FACSCalibur)。

逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)——根據(jù)制造商的方案使用

RNAqueousTM-4PCR(Ambion)從MEF中提取RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，Promega)從1μg RNA合成cDNA。使用特異性引物以及HotMaster TAQ(5-Prime Inc.)擴增cDNA。

統(tǒng)計學分析——使用GraphPad Prism v4(GraphPad Software，San Diego，CA)產(chǎn)生Kaplan-Meier存活曲線并計算蛋白質(zhì)半衰期(單相指數(shù)衰減方程)。用單因素ANOVA和t-檢驗測定統(tǒng)計學上的差異。小于0.05P值的被認為是統(tǒng)計學上顯著的。

項

1.一種鑒定化合物的方法，所述化合物激活iRhom多肽對底物的蛋白水解活性，所述方法包括：

a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；以及

b)測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加表明所述化合物激活iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。

2.第1項的方法，其中通過分析暴露于所述化合物之后iRhom多肽的半衰期來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。

3.第1項的方法，其中所述底物是EGFR配體或EGF樣底物。

4.第1項的方法，其中通過檢測EGFR配體分泌的增加來測定所述iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。

5.第4項的方法，其中所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

6.第1項的方法，其中通過檢測可溶性EGFR配體水平的提高來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。

7.第6項的方法，其中所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

8.第1項的方法，其中通過檢測EGFR信號傳導(dǎo)活性來測定iRhom多肽穩(wěn)定性的增加。

9.第1項的方法，其中所述化合物抑制iRhom多肽和蛋白酶體之間的相互作用。

10.第1項的方法，其中所述化合物使iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域失活。

11.第10項的方法，其中所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的失活是短暫的。

12.第1項的方法，其中所述化合物使iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域裂解和/或缺失，以使所述多肽具有蛋白水解活性或改變的生物活性。

13.第12項的方法，其中小鼠iRhom2在第1和268位氨基酸殘基之間被裂解，或人iRhom2在第1和298位氨基酸殘基之間被裂解。

14.第12項的方法，其中小鼠iRhom1在第1和272位氨基酸殘基之間被裂解，或人iRhom1在第1和316位氨基酸殘基之間被裂解。

15.第1項的方法，其中所述化合物激活iRhom多肽的肽酶域。

16.第1-15項中任一項的方法，其中所述iRhom多肽是iRhom1或iRhom2。

17.第15項的方法，其中所述iRhom多肽是人或小鼠iRhom多肽。

18.第1項的方法，其中所述化合物選自小分子、肽或多肽誘餌。

19.第18項的方法，其中所述化合物連接至細胞穿透肽。

20.第1項的方法，其中所述化合物加速角化細胞的遷移。

21.第1項的方法，其中所述化合物加速成纖維細胞的增殖。

22.第1項的方法，其中所述化合物是細胞可透過性的。

23.第1項的方法，其中所述化合物是泛素蛋白酶抑制劑。

24.一種鑒定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性，所述方法包括：

a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；和

b)測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少，或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物抑制iRhom多肽對底物的蛋白水解活性。

25.第25項的方法，其中所述底物是EGFR配體或EGF樣底物。

26.第24項的方法，其中通過檢測iRhom多肽的生理靶標分泌的減少來測定對iRhom多肽蛋白水解活性的抑制。

27.第26項的方法，其中所述iRhom多肽的生理靶標是EGFR配體。

28.第27項的方法，其中所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

29.第24項的方法，其中通過檢測可溶性EGFR配體水平的降低來測定對iRhom多肽蛋白水解活性的抑制。

30.第29項的方法，其中所述EGFR配體選自AREG、HB-EGF、TGFα和EPGN。

31.第24項的方法，其中通過檢測EGFR活性的降低來測定對iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。

32.第24項的方法，其中所述化合物抑制iRhom多肽的肽酶域。

33.第24項的方法，其中所述化合物通過使iRhom多肽肽酶域的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基失活來影響iRhom多肽的活性。

34.第33項的方法，其中所述iRhom多肽是小鼠iRhom2并且所述化合物使小鼠iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基失活，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第635位組氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、跨膜螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位組氨酸。

35.第33項的方法，其中所述iRhom多肽是人iRhom2并且所述化合物使人iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基失活，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第664位組氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、跨膜螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位組氨酸。

36.第24-33項中任一項的方法，其中所述iRhom家族成員為iRhom1或iRhom2。

37.第33項的方法，其中所述iRhom家族成員是人或小鼠iRhom家族成員。

38.第24項的方法，其中所述化合物選自小分子、肽或多肽誘餌。

39.第38項的方法，其中所述化合物連接至細胞穿透肽。

40.第24項的方法，其中所述化合物是細胞可透過性的。

41.一種鑒定化合物的方法，所述化合物能夠在受試者中加速傷口愈合或組織修復(fù)，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽和EGFR配體的細胞與測試化合物接觸；b)測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加；和c)測定細胞分泌的EGFR配體相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加和細胞分泌的EGFR配體的增加表明所述化合物能夠加速傷口愈合。

42.第41項的方法，其中所述iRhom家族成員是iRhom1或iRhom2。

43.第41項的方法，其中所述iRhom家族成員是人或小鼠iRhom家族成員。

44.一種鑒定化合物的方法，所述化合物能夠在受試者中降低腫瘤生長和/或進展或治療癌癥，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；和b)測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物能夠在受試者中降低腫瘤生長和/或進展或治療癌癥。

45.第44項的方法，其中所述腫瘤是實體瘤。

46.第44項的方法，其中所述癌癥是上皮癌。

47.第44項的方法，其中所述癌癥是食管癌、肺癌、腦癌、結(jié)腸癌、腎癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴腺癌或膀胱癌。

48.一種鑒定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；b)測定iRhom多肽穩(wěn)定性相對于合適對照的增加，其中iRhom多肽穩(wěn)定性的增加表明所述化合物抑制iRhom多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

49.第44-48項中任一項的方法，其中所述iRhom家族成員是iRhom1或iRhom2。

50.第44-48項中任一項的方法，其中所述iRhom家族成員是人或小鼠iRhom家族成員。

51.第41項的方法，其中所述化合物選自小分子、多肽誘餌、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、反義分子、特異性針對Rhbdf2的核酶；或編碼miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA的多聚核苷酸；或其各自的生物等價物。

52.一種分離的多肽，其包含變體iRhom多肽。

53.一種分離的多肽，其包含細胞溶質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)域缺失的人iRhom2。

54.一種分離的多肽，其包含細胞溶質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)域缺失的小鼠iRhom2。

55.一種分離的小鼠iRhom2多肽，其在小鼠iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基處包含突變，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第635位組氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位組氨酸。

56.一種分離的人iRhom2多肽，其在人iRhom2的蛋白水解位點中的一個或多個氨基酸殘基處包含突變，所述氨基酸殘基選自TM螺旋2上的第664位組氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位組氨酸。

57.一種分離的核酸分子，其編碼第52-56項中任一項的多肽。

58.一種載體，其包含第57項的核酸分子。

59.一種宿主細胞，其表達第58項的載體。

60.一種鑒定化合物的方法，所述化合物能夠在受試者中促進毛發(fā)生長，所述方法包括：a)使表達iRhom多肽的細胞與測試化合物接觸；和b)測定iRhom多肽的生理靶標的分泌相對于合適對照的減少或EGFR活性相對于合適對照的降低，其中iRhom多肽的生理靶標分泌的減少或EGFR活性的降低表明所述化合物能夠在受試者中促進毛發(fā)生長。

序列

小鼠iRhom2蛋白序列全長SEQ ID NO：1

MASADKNGSNLPSVSGSRLQSRKPPNLSITIPPPESQAPGEQDSMLPERRKNPAYLKSVSLQEPRGRWQEGAEKRPGFRRQASLSQSIRKSTAQWFGVSGDWEGKRQNWHRRSLHHCSVHYGRLKASCQRELELPSQEVPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPDEVDRPHAAHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRISVAHMSFQAAAALLKGRSVLDATGQRCRHVKRSFAYPSFLEEDAVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWQLLERPWKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

Rhbdf2^cub小鼠突變SEQ ID NO：2

MSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWQLLERPWKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

小鼠iRhom1蛋白序列全長SEQ ID NO：3

MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPAAVPPAAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETARVPSPHHEPRRLVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVIRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRMADDTADGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFNRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALVKGRSIRDGTLRRGQRRSFTPASFLEEDMVDFPDELDTSFFAREGVLHEEMSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVWVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

小鼠iRhom1 N-末端截短的蛋白序列(等價于Rhbdf2^cub突變——無細胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域但保留跨膜肽酶域)SEQ ID NO：4

MSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVWVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

人iRhom2蛋白序列全長SEQ ID NO：5

MASADKNGGSVSSVSSSRLQSRKPPNLSITIPPPEKETQAPGEQDSMLPEGFQNRRLKKSQPRTWAAHTTACPPSFLPKRKNPAYLKSVSLQEPRSRWQESSEKRPGFRRQASLSQSIRKGAAQWFGVSGDWEGQRQQWQRRSLHHCSMRYGRLKASCQRDLELPSQEAPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPEEMDRPHAPHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRMSVAHMSLQAAAALLKGRSVLDATGQRCRVVKRSFAFPSFLEEDVVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWPLLERPWKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLWLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

人截短的iRhom2(等價于Rhbdf2^cub突變——無細胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域但保留跨膜肽酶域)SEQ ID NO：6

MSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWPLLERPWKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLWLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH

人iRhom1蛋白序列全長SEQ ID NO：7

MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPSAVPLTAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETAHISSPHHELRRPVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVLRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRVADDTAEGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFHRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALMKGRSVRDGTFRRAQRRSFTPASFLEEDTTDFPDELDTSFFAREGILHEELSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPEQAD

LTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

人iRhom1 N-末端截短的蛋白序列(等價于Rhbdf2^cub突變——無細胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域但保留跨膜肽酶域)SEQ ID NO：8

MLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH

本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解或僅使用常規(guī)實驗即能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等同方案。這樣的等同方案意欲包含于以下權(quán)利要求中。

序列表

<110> The Jackson Laboratory

<120> 鑒定改變iRhom多肽活性的化合物的方法及其用途

<130> JLA-11352/47

<150> 61/991,423

<151> 2014-05-09

<150> 61/992,152

<151> 2014-05-12

<160> 90

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 827

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 1

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Ser Asn Leu Pro Ser Val Ser Gly

1 5 10 15

Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro

20 25 30

Pro Pro Glu Ser Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu Pro Glu

35 40 45

Arg Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser Leu Gln Glu Pro

50 55 60

Arg Gly Arg Trp Gln Glu Gly Ala Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg Arg

65 70 75 80

Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Ser Thr Ala Gln Trp Phe

85 90 95

Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Lys Arg Gln Asn Trp His Arg Arg

100 105 110

Ser Leu His His Cys Ser Val His Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser Cys

115 120 125

Gln Arg Glu Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Val Pro Ser Phe Gln Gly

130 135 140

Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile Val Asp Pro Leu

145 150 155 160

Ala Arg Gly Arg Ala Phe Arg His Pro Asp Glu Val Asp Arg Pro His

165 170 175

Ala Ala His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser Leu Thr Ser Phe

180 185 190

Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg Ile

195 200 205

Ser Val Ala His Met Ser Phe Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gly

210 215 220

Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg His Val Lys Arg

225 230 235 240

Ser Phe Ala Tyr Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Ala Val Asp Gly Ala

245 250 255

Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser Met

260 265 270

Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe Arg

275 280 285

Gly Val Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val His Ile

290 295 300

Pro Leu Lys Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Ala Leu Gly Pro Gly Thr Gln

305 310 315 320

Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg

325 330 335

Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg

340 345 350

Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser

355 360 365

Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His

370 375 380

Ile Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val

385 390 395 400

Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Lys Asn Arg Gly

405 410 415

Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly

420 425 430

Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys

435 440 445

Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ile Glu Gln Leu Val Arg Arg Glu Arg Asp

450 455 460

Ile Glu Arg Thr Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp Arg Ser Gly Cys

465 470 475 480

Ile Gln Thr Leu Lys Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val

485 490 495

Lys Trp Gln Asn Asp Thr Gly Pro Ser Asp Lys Ser Asp Leu Ser Gln

500 505 510

Lys Gln Pro Ser Ala Val Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu

515 520 525

Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys

530 535 540

Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Gln Ser Asn His Thr Gly Leu Leu

545 550 555 560

His Ile Asp Cys Lys Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys

565 570 575

Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly

580 585 590

Tyr Phe His Glu Asp Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp

595 600 605

Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln

610 615 620

Phe Tyr Arg Ile Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Val His

625 630 635 640

Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu

645 650 655

Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ser Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly

660 665 670

Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu

675 680 685

Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val

690 695 700

Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe

705 710 715 720

Phe Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu

725 730 735

Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Met

740 745 750

Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp

755 760 765

Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Val Phe Ala

770 775 780

Gly Leu Phe Ala Ser Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn

785 790 795 800

Trp Pro Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Ser Arg Phe

805 810 815

Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

820 825

<210> 2

<211> 559

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Met Ser Ser Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ser Tyr Phe Arg Gly Val Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp

20 25 30

Gly Val His Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Ala Leu Gly

35 40 45

Pro Gly Thr Gln Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe

50 55 60

Ala Phe Asp Arg Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn

65 70 75 80

Trp Leu Asn Arg Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg

85 90 95

Gln Leu Glu Ser Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu

100 105 110

Thr Phe Val His Ile Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly

115 120 125

Ile Ala Pro Val Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu

130 135 140

Lys Asn Arg Gly Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn

145 150 155 160

Phe Trp Ile Gly Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys

165 170 175

Phe Ser Pro Cys Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ile Glu Gln Leu Val Arg

180 185 190

Arg Glu Arg Asp Ile Glu Arg Thr Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp

195 200 205

Arg Ser Gly Cys Ile Gln Thr Leu Lys Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu

210 215 220

Ala Thr Phe Val Lys Trp Gln Asn Asp Thr Gly Pro Ser Asp Lys Ser

225 230 235 240

Asp Leu Ser Gln Lys Gln Pro Ser Ala Val Val Cys His Gln Asp Pro

245 250 255

Arg Thr Cys Glu Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp

260 265 270

Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Gln Ser Asn His

275 280 285

Thr Gly Leu Leu His Ile Asp Cys Lys Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys

290 295 300

Ile Gly Thr Lys Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu

305 310 315 320

Phe Met His Gly Tyr Phe His Glu Asp Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val

325 330 335

His Cys Leu Asp Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu

340 345 350

Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Ile Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala

355 360 365

Gly Ile Val His Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu

370 375 380

Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ser Ile Ile Phe

385 390 395 400

Ile Leu Ser Gly Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro

405 410 415

Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala

420 425 430

Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Leu Leu Glu Arg Pro

435 440 445

Trp Lys Ala Phe Phe Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile

450 455 460

Cys Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe

465 470 475 480

Leu Ser Gly Met Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe

485 490 495

Gly Thr Ser Asp Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu

500 505 510

Leu Val Phe Ala Gly Leu Phe Ala Ser Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile

515 520 525

Tyr Pro Ile Asn Trp Pro Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Cys Phe Pro Phe

530 535 540

Thr Ser Arg Phe Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

545 550 555

<210> 3

<211> 856

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Met Ser Glu Ala Arg Arg Asp Ser Thr Ser Ser Leu Gln Arg Lys Lys

1 5 10 15

Pro Pro Trp Leu Lys Leu Asp Ile Pro Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala

20 25 30

Glu Glu Pro Ser Phe Leu Gln Pro Leu Arg Arg Gln Ala Phe Leu Arg

35 40 45

Ser Val Ser Met Pro Ala Glu Thr Ala Arg Val Pro Ser Pro His His

50 55 60

Glu Pro Arg Arg Leu Val Leu Gln Arg Gln Thr Ser Ile Thr Gln Thr

65 70 75 80

Ile Arg Arg Gly Thr Ala Asp Trp Phe Gly Val Ser Lys Asp Ser Asp

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Ser Thr Gln Lys Trp Gln Arg Lys Ser Ile Arg His Cys Ser Gln Arg

100 105 110

Tyr Gly Lys Leu Lys Pro Gln Val Ile Arg Glu Leu Asp Leu Pro Ser

115 120 125

Gln Asp Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr Glu Thr Pro Pro Pro Leu Tyr

130 135 140

Val Gly Pro Cys Gln Leu Gly Met Gln Lys Ile Ile Asp Pro Leu Ala

145 150 155 160

Arg Gly Arg Ala Phe Arg Met Ala Asp Asp Thr Ala Asp Gly Leu Ser

165 170 175

Ala Pro His Thr Pro Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Cys Ser Phe

180 185 190

Ser Ser Ser Arg Ser Gly Phe Asn Arg Leu Pro Arg Arg Arg Lys Arg

195 200 205

Glu Ser Val Ala Lys Met Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ala Leu Val Lys

210 215 220

Gly Arg Ser Ile Arg Asp Gly Thr Leu Arg Arg Gly Gln Arg Arg Ser

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Met Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala

275 280 285

Leu Lys Asp Trp Glu Lys Ala Pro Asp Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly

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Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu

305 310 315 320

Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Gly Pro Leu Ala Pro Gln

325 330 335

Pro Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Ala Ala Gly Pro Arg

340 345 350

Arg Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu

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Lys Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr

370 375 380

Tyr Arg Lys Arg Ile Asp Ser Tyr Val Lys Arg Gln Ile Glu Asp Met

385 390 395 400

Asp Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser

405 410 415

Leu Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly

420 425 430

Phe Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Lys Arg Gly Val

435 440 445

Tyr Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro

450 455 460

Ser Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met

465 470 475 480

Arg Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Leu Ala Ala Arg Glu Arg

485 490 495

Glu Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val

500 505 510

Gln Thr Ser Lys Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys

515 520 525

Trp Pro Val His Pro Ser Ala Pro Asp Leu Ala Gly Asn Lys Arg Gln

530 535 540

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545 550 555 560

Ser Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile

565 570 575

Cys Thr Lys Ser Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp

580 585 590

Cys Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys

595 600 605

Glu Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His

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Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys

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Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg

645 650 655

Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val

660 665 670

Ser Val Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala

675 680 685

Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Ile Thr Gly

690 695 700

Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro

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Ala Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe

725 730 735

Gln Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu

740 745 750

Leu Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Ala Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile

755 760 765

Asp Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Val Ser Gly Leu Phe Leu Ser

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Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg

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Cys Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys

835 840 845

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850 855

<210> 4

<211> 584

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

Met Ser Thr Tyr Pro Asp Glu Val Phe Glu Ser Pro Ser Glu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Lys Asp Trp Glu Lys Ala Pro Asp Gln Ala Asp Leu Thr Gly Gly

20 25 30

Ala Leu Asp Arg Ser Glu Leu Glu Arg Ser His Leu Met Leu Pro Leu

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Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Gly Pro Leu Ala Pro Gln

50 55 60

Pro Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Ala Ala Gly Pro Arg

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Arg Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe Ala Arg Glu

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Lys Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr Asn Arg Thr

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Asp Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Ser

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Leu Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly

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Tyr Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly Pro

180 185 190

Ser Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Met

195 200 205

Arg Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Leu Ala Ala Arg Glu Arg

210 215 220

Glu Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser Gly Cys Val

225 230 235 240

Gln Thr Ser Lys Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val Trp Val Lys

245 250 255

Trp Pro Val His Pro Ser Ala Pro Asp Leu Ala Gly Asn Lys Arg Gln

260 265 270

Phe Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp Glu Pro Ser

275 280 285

Ser Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys Trp Pro Ile

290 295 300

Cys Thr Lys Ser Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro His Met Asp

305 310 315 320

Cys Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys Gly Arg Cys

325 330 335

Glu Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly Tyr Phe His

340 345 350

Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp Asp Val Cys

355 360 365

Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln Phe Tyr Arg

370 375 380

Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His Cys Leu Val

385 390 395 400

Ser Val Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu Lys Leu Ala

405 410 415

Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly Ile Thr Gly

420 425 430

Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Val Gly Pro

435 440 445

Ala Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val Glu Leu Phe

450 455 460

Gln Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe Phe Lys Leu

465 470 475 480

Leu Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Ala Phe Gly Leu Leu Pro Trp Ile

485 490 495

Asp Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Val Ser Gly Leu Phe Leu Ser

500 505 510

Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp Leu Tyr Arg

515 520 525

Lys Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu Gly Leu Leu

530 535 540

Ala Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Cys Glu Trp

545 550 555 560

Cys Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe Cys Glu Lys

565 570 575

Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Leu His

580

<210> 5

<211> 856

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ser Val Ser Ser

1 5 10 15

Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro

20 25 30

Pro Pro Glu Lys Glu Thr Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu

35 40 45

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aagtgccaag ggaccaatc 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 40

taccccaagg ttcttgcatc 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 41

gaaaacaggc gttttagata ttgg 24

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 42

cacggagtgg atctactgga c 21

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 43

cactatactg agaaccaaag caacc 25

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 44

aagtgctgtt tatgctcccc 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 45

caaatttgtc acgtttggtt c 21

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 46

ccgacactac tttcaagccc 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 47

tccagcgggt ctataaaagc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 48

gacgtttggg gaatgtcaag 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 49

tgtctacaca gcaatgctca c 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 50

ctttgcagag gtaaaacccg 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 51

aaaagagaac gtgggcagtc 20

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 52

ccttggttta cacactggaa aag 23

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 53

gtatgtttga gatgcagaaa acc 23

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 54

tgacagtaga gtctgatagg aatactg 27

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 55

gtcacaggag gaaagtcccc 20

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 56

cttcttttgc cttgagataa gtg 23

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 57

tggtggtttt ctataagaat atttagc 27

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 58

aagcccttgt aaatgattgt cc 22

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 59

aaggttcaca ggactccagc 20

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 60

aagtggtgtg cctctccg 18

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 61

aaaaggatta agcatttggg g 21

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 62

tgggtcatga cactaaaagg ac 22

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 63

tttccaatgc tgtcaaaccc 20

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 64

gaatcaatga ataaaacggg g 21

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 65

tgggaagagg agaaaagcaa g 21

<210> 66

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 66

gaaaacagtg ctaattactt ccaaag 26

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 67

attagacatg gtgaagcccc 20

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 68

tttgcatact gacaggaact cac 23

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 69

tgctgagcag acagtcacg 19

<210> 70

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 70

ttgggctcat gtgcgag 17

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 71

tgctttggtc agtcaaccag 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 72

ttttcccact cttgtggtcc 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 73

ttcccattgg ctgctgtaag 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 74

ccaactgaac cacactttgc 20

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 75

tccatgaagt caatcctgaa g 21

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 76

gaggcaggca aatctctgtg 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 77

tggttggttg gttggttagg 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 78

tgaagcacaa aagccaactc 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 79

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 80

ctcaccctcc tagcatgagc 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 81

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 82

gtcgtagtcc cctgtggaga 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 83

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 84

ttgcctccct ttttcttcct 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 85

cggtggaacc aatgagaact 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 86

ccacaccgtt caccaaagta 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 87

gttgctgcag agaccgagac 20

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 88

gtcgtagtcc cctgtggaga 20

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 89

ctggcagtga actctccaca 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 90

ccacaccgtt caccaaagta 20