本發(fā)明涉及生化設(shè)備領(lǐng)域，具體是一種實時熒光定量pcr儀。

背景技術(shù)：

pcr(聚合酶鏈式反應(yīng))是指利用dna在體外95℃的高溫時會變性成單鏈、低溫60℃左右時該單鏈會與引物按堿基互補配對的原則結(jié)合、在調(diào)溫度至dna聚合酶最適反應(yīng)溫度72℃左右時dna聚合酶會沿著磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互補鏈的性質(zhì)，實現(xiàn)放大擴增特定的dna片段的分子生物學技術(shù)。而pcr儀則是在變性溫度、復性溫度、延伸溫度之間實現(xiàn)很好的控制，使特定dna的擴增得以實現(xiàn)的設(shè)備。為了能夠?qū)崟r監(jiān)控反應(yīng)過程，進而及時調(diào)整溫度，需要pcr儀在溫控的同時監(jiān)測靶基因。

傳統(tǒng)的pcr檢測方法是通過將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳來判斷靶基因是否存在，但是該方法存在諸多不足：由于pcr擴增的效率很高，靶基因從極少量擴增至大量并最終達到飽和的時間較短，電泳檢測只能得到特定基因是否存在的定性結(jié)果，而無法區(qū)分上述過程，也無法對其數(shù)量或濃度定量檢測，同時，該方法操作過程復雜，檢測時間長，無法滿足實時監(jiān)控反應(yīng)過程的要求，另外，由于在操作過程中需要將檢測樣本轉(zhuǎn)移，因此樣品容易受環(huán)境的污染，進而造成檢測結(jié)果不準確。

為了解決上述問題，出現(xiàn)了實時熒光定量pcr技術(shù)，例如，中國專利文獻cn101699271a公開了一種實時熒光定量pcr激發(fā)檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于可調(diào)諧濾光片實現(xiàn)全波長熒光激發(fā)及檢測，該系統(tǒng)包括由光源、聚光裝置和第一可調(diào)濾光片組成的熒光激發(fā)模塊；由第二可調(diào)濾光片、光檢測器和光電轉(zhuǎn)換裝置組成的熒光檢測模塊；由波長調(diào)諧設(shè)備及主控計算機組成的控制單元；有反應(yīng)試管、金屬溫塊及恒溫熱蓋組成的熱循環(huán)系統(tǒng)。上述系統(tǒng)在dna擴增反應(yīng)中，通過熒光信號對pcr進行實時檢測，并經(jīng)數(shù)據(jù)處理對靶基因進行定量分析，操作簡單，能夠自動、快速的完成對靶基因的定量檢測，并且在檢測過程中不受環(huán)境污染，檢測結(jié)果較為準確。但是，上述實時熒光定量pcr激發(fā)檢測系統(tǒng)以及目前其他的實時熒光定量pcr儀均在溫度控制方面還存在缺陷：一方面，在反應(yīng)的某一階段，保持在某一特定的溫度狀態(tài)時，需要pcr儀具有良好的溫度均一性；另一方面，在實時監(jiān)控反應(yīng)過程中，需要在適當時機及時調(diào)整溫度，這進一步要求pcr儀可以迅速調(diào)整溫度，并在較短的時間內(nèi)達到溫度的均一性；上述實時熒光定量pcr激發(fā)檢測系統(tǒng)以及目前其他的實時熒光定量pcr儀的溫度均一性最優(yōu)僅能達到±0.1℃，即雖然能夠?qū)崟r檢測反應(yīng)過程，卻不能很好的實現(xiàn)溫度控制，而對于pcr來說，反應(yīng)是一個動態(tài)競爭的過程，反應(yīng)溫度和時間決定了哪個產(chǎn)物能夠勝出，因此，上述缺陷導致了其不能實現(xiàn)檢測樣品多位點突變、單核苷酸多態(tài)性-snp、基因分型等多種分析功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的實時熒光定量pcr檢測系統(tǒng)不能很好的實現(xiàn)檢測樣品多位點突變、單核苷酸多態(tài)性-snp、基因分型等多種分析功能的缺陷，本發(fā)明專利提供一種實時熒光定量pcr儀，包括基本pcr部件、熒光檢測部件和上位機，所述基本pcr部件包括電源系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)；所述電源系統(tǒng)包括電源和電源部件，所述電源提供整個實時熒光定量pcr儀的電能；所述電源部件為組合型電源轉(zhuǎn)換插頭連接器，保護電路；所述溫度控制系統(tǒng)包括加熱模塊、熱蓋部件和溫度調(diào)節(jié)模塊，所述溫度調(diào)節(jié)模塊設(shè)置于樣品基座的周邊；所述加熱模塊為制冷片te模塊，所述制冷片te模塊設(shè)置于所述樣品基座的底部，進行加熱和降溫；所述熱蓋部件設(shè)置于所述樣品基座的上方，與樣品試管口接觸，避免高溫產(chǎn)生的水蒸氣凝結(jié)在pcr管蓋上；所述樣品基座為超導材料制成；所述上位機對實時熒光變化的檢測數(shù)據(jù)進行分析處理；所述上位機電連接于所述控制單元；所述控制單元分別電連接于te溫度傳感器、熱蓋溫度傳感器和環(huán)境溫度傳感器；所述te溫度傳感器設(shè)置于所述樣品基座的底部和和制冷片te模塊之間，檢測所述制冷片te模塊的溫度；所述熱蓋溫度傳感器設(shè)置于所述熱蓋部件上，檢測所述熱蓋部件的溫度；所述環(huán)境溫度傳感器安裝于所述實時熒光定量pcr儀的腔體內(nèi)部，檢測所述實時熒光定量pcr儀的腔體溫度；所述溫度調(diào)節(jié)模塊包括輔助加熱模塊和散熱模塊，通過控制單元監(jiān)控所述te溫度傳感器、熱蓋溫度傳感器和環(huán)境溫度傳感器調(diào)整pcr反應(yīng)溫度的均一性小于±0.1℃，升降溫度平均速率大于3℃/秒，溫度精度控制在小于±0.15℃；所述熒光檢測部件包括：光電系統(tǒng)，對樣本進行實時熒光變化的檢測；所 述光電系統(tǒng)由包括激發(fā)光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)；所述激發(fā)光系統(tǒng)包括鹵素燈和光學過濾器；所述檢測系統(tǒng)包括光纖、發(fā)射濾波器、鏡頭和ccd相機；熒光信號通過所述光纖，發(fā)射濾波器和鏡頭，到達所述ccd相機。

進一步地，所述控制單元包括主控制板和副控制板；所述主控制版的端口連接有所述電源系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、光電系統(tǒng)；所述主控制板控制有所述制冷片te模塊的溫度、熱蓋部件的溫度，輔助加熱模塊的溫度以及散熱模塊對實時熒光定量pcr儀腔體的溫度；所述主控制板的端口連接有控制濾光片的第一選擇電機和第二選擇電機；所述副控制板的端口連接有控制儀器頂蓋的上下運動第一直流電機和第二直流電機，以及四組控制信號燈開關(guān)的限位開關(guān)。

進一步地，所述散熱模塊為兩個智能散熱器風扇。

進一步地，所述輔助加熱模塊和散熱模塊，通過所述上位機的應(yīng)用軟件調(diào)整pcr反應(yīng)溫度的均一性為±0.06℃。

進一步地，所述輔助加熱模塊為電加熱管或伴熱帶。

進一步地，所加熱模塊為六組獨立控制制冷片te模塊，分別與六組te溫度傳感器連接。

進一步地，所述熱蓋部件的溫度為105℃。

進一步地，所述散熱模塊為兩個智能散熱器風扇，控制所述實時熒光定量pcr儀的腔體內(nèi)部溫度在45℃以下。

進一步地，所述的激發(fā)光系統(tǒng)通過光纖96孔同時激發(fā)；所述檢測系統(tǒng)包括一套光纖、四個發(fā)射濾光片輪、一組鏡片和冷卻ccd相機；熒光檢測的波長范圍為380nm至780nm，激發(fā)波長通道數(shù)設(shè)置為1至8個，發(fā)射波長相應(yīng)的設(shè)置為1至5種。

有益效果：

本發(fā)明提供的一種熒光定量pcr儀利用控制電路在控制熱循環(huán)裝置對靶基因擴增的同時對被測反應(yīng)物的熒光信號強度進行檢測，由于熒光信號強度與靶基因的濃度是成比例關(guān)系的，因此檢測熒光強度就能知道特定基因的數(shù)量和濃度。因此大大縮短了臨床致病菌的檢測時間。另外，該熒光定量pcr通過輔助加熱模塊、散熱模塊和由超導材料制成的樣品基座使得溫度均一性快速達到和長時間保持在±0.06℃，實現(xiàn)了擴增子序列分析(asa，ampliconsequenceanalysis)功能，asa不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在pcr結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態(tài)性-snp、甲基化、hla配型等的分析。

同時，本發(fā)明將pcr熱循環(huán)、熒光檢測和裝有各種應(yīng)用分析軟件的計算機結(jié)合在一起，可以動態(tài)觀察pcr每一循環(huán)各反應(yīng)管中pcr擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況，操作簡單，反應(yīng)速度快。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為本發(fā)明一種實時熒光定量pcr儀的各部件連接關(guān)系示意圖；

圖2為本發(fā)明一種實時熒光定量pcr儀的溫度控制系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明一種實時熒光定量pcr儀的電器線路示意圖；

圖中附圖標記表示為：10-主控制板；11-熱蓋部件；12-熱蓋溫度傳感器；13-散熱模塊；14-環(huán)境溫度傳感器；15-第一選擇電機；16-第二選擇電機；20-樣品基座；21-制冷片te模塊；22-te溫度傳感器；23-伴熱帶；30-副控制板；31-第一直流電機；32-第二直流電機；33-限位開關(guān)。

具體實施方式

下面根據(jù)附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

如圖1所示，

一種實時熒光定量pcr儀，包括電源，電源部件，加熱模塊，熱蓋部件，溫度調(diào)節(jié)模塊，光電系統(tǒng)、控制單元和上位機。

上位機通過應(yīng)用軟件對實時熒光變化的檢測數(shù)據(jù)進行分析處理；控制單元對加熱模塊，熱蓋部件，溫度調(diào)節(jié)模塊和光電系統(tǒng)智能監(jiān)控。

如圖2所示，

溫度調(diào)節(jié)模塊包括輔助加熱模塊，輔助加熱模塊為伴熱帶23，為導電塑料材質(zhì)，設(shè)置于樣品基座20的周邊，提供補償溫度；加熱模塊為制冷片te模塊21，所述制冷片te模塊21的一面可以加熱，一面可以冷卻，具有加熱和冷卻的作用，設(shè)置于所述樣品基座20的底部，用于對樣品進行加熱和降溫；te溫度傳感器22設(shè)置于樣品基座20和加熱模塊為制冷片te模塊21之間；樣品基座20為超導材料。

如圖3所示，

實時熒光定量pcr儀的電器線路圖由主控制板10和副控制板30組成；主控制版的端口連接有所述電源系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、光電系統(tǒng)；主控制板10控制有所述六組制冷片te模塊21的溫度、熱蓋部件的溫度，輔助加熱模塊的溫度以及兩個智能散熱器風扇對實時熒光定量pcr儀腔體的溫度；主控制板10的端口連接有控制濾光片第一選擇電機15和第二選擇電機16；副控制板30的端口連接有控制儀器頂蓋的上下運動第一直流電機31和第二直流電機32，以及四組控制信號燈開關(guān)的限位開關(guān)33。

本實施例所述的一種實時熒光定量pcr儀的使用方法如下：

如圖1-3所示，

一種實時熒光定量pcr儀包括基本pcr部件、熒光檢測部件和上位機?；緋cr部件是該儀器的基礎(chǔ)，包括電源、加熱模塊、溫度采集與處理等部分，它必須具有精確控溫、快速升降溫、溫度場均一等pcr儀的基本要求，保證pcr過程的順利完成。熒光檢測部件包括光源、光電倍增管、信號采集與處理等部分。上位機包括數(shù)據(jù)采集和系統(tǒng)分析軟件，主要負責從下位機采集數(shù)據(jù)，形成實時圖形，并進行數(shù)據(jù)處理和圖形分析，得到目標dna片段的含量和其它檢測報告信息等。工作時，主計算機首先投入運行，同時工作人員把所測樣品放入pcr反映腔體的樣品架上，工作人員根據(jù)所測樣品的pcr反應(yīng)條件設(shè)置相應(yīng)的溫度參數(shù)、控溫時間以及循環(huán)次數(shù)等，接著工作人員點擊相應(yīng)的按鈕控件，系統(tǒng)就進入快速升溫、恒溫、快速降溫、恒溫等pcr循環(huán)過程，直至所有的循環(huán)結(jié)柬，同時在每一循環(huán)的低溫段恒溫結(jié)柬前系統(tǒng)進行樣品的熒光信號實時采集，主計算機根據(jù)采集到的信號形成實時圖形，并進行數(shù)據(jù)處理和圖形分析，得到目標dna片段的含量和其它檢測報告信息等。

本發(fā)明的應(yīng)用軟件已安裝在上位機，在windows操作系統(tǒng)下運行，實現(xiàn)實驗設(shè)置、數(shù)據(jù)管理和其他功能。應(yīng)用軟件的自檢將會檢查溫度控制系統(tǒng)和光電系統(tǒng)，主控制板10通過te溫度傳感器22、熱蓋溫度傳感器12和環(huán)境溫度傳感器14分別對制冷片te模塊21、熱蓋部件11和實時熒光定量pcr儀腔體的溫度進行監(jiān)控。

主控制板10可以控制加熱模塊、輔助加熱模塊的加熱及冷卻，主控制板10接收te溫度傳感器22、熱蓋溫度傳感器12和環(huán)境溫度傳感器14檢測到的溫度信號，由于所述te溫度傳感器22設(shè)置于所述樣品基座的底部和和制冷片te模塊21之間，可以檢測所述制冷片te模塊21的溫度；所述熱蓋溫度傳感器12設(shè)置于所述熱蓋部件11上，檢測所述熱蓋部件11的溫度；所述環(huán)境溫度傳感器14安裝于所述實時熒光定量pcr儀的腔體內(nèi)部，檢測所述實時熒光定量pcr儀的腔體溫度。這樣，主控制板10就可以獲得制冷片te模塊21的溫度、熱蓋部件11的溫度、pcr儀的腔體溫度，根據(jù)檢測到的當前溫度和需要達到的溫度進行比較，對加熱模塊、輔助加熱模塊進行控制

主控制板10與te溫度傳感器22連接，調(diào)整實時熒光定量pcr儀的在變性階段、復性階段和延伸階段等各個階段的溫度轉(zhuǎn)換，加快升降溫。

在變性階段，制冷片te模塊21和伴熱帶23對樣品機座20進行加熱。由于，樣品基座20為超導材料，能夠迅速將熱能傳遞給樣品試管，使其迅速至95℃左右，從而達到快速升溫的效果。待溫度過高或過低時，te溫度傳感器22將信號傳遞給主控制板10，從而調(diào)整制冷片te模塊21和伴熱帶23加熱或降溫。

在復性階段，需要退火至50～60℃，制冷片te模塊21和伴熱帶23停止加熱，同時，散熱模塊13的兩個智能散熱器風扇開始工作；待溫度至規(guī)定溫度后，te溫度傳感器22將信號傳遞給主控制板10，控制制冷片te模塊21和伴熱帶23保持相同溫度，停止兩個智能散熱器風扇工作。

在延伸階段，需要加熱至75℃，制冷片te模塊21和伴熱帶23對樣品機座20進行加熱，待溫度過高或過低時，te溫度傳感器22將信號傳遞給主控制板10，從而調(diào)整制冷片te模塊21和伴熱帶23加熱或降溫。

所以在各個階段特定溫度反應(yīng)時，通過伴熱帶23的補償加熱，使得反應(yīng)溫度的均一性長時間保持在±0.06℃，升降溫度平均速率為3℃/秒。

另外，主控制板10通過熱蓋溫度傳感器12控制熱蓋部件11的溫度為105℃，在溫度變化時，能夠及時通過電信號進行校正。以及通過環(huán)境溫度傳感器14控制實時熒光定量pcr儀的腔體溫度保持在35℃。同時，主控制板10端口連接控制濾光片第一選擇電機15和第二選擇電機16來選擇不同濾光片。

熒光檢測部件所用的光源為鹵素燈，通過光纖96孔同時激發(fā)；檢測系統(tǒng)包括一套光纖、四個發(fā)射濾光片輪、一組鏡片和冷卻ccd相機；熒光檢測的波長范圍為380nm至780nm，激發(fā)波長通道數(shù)為8個，發(fā)射波長5種。

副控制板30端口連接有控制儀器頂蓋的上下運動第一直流電機31和第二直流電機32，以及四組控制信號燈開關(guān)的限位開關(guān)33，從而實現(xiàn)該儀器的外在物理運動和各功能開關(guān)控制。

以上所述僅為說明本發(fā)明的實施方式，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。