本發(fā)明屬于食（藥）用菌菌種選育領域，具體涉及一種大別山區(qū)野生茯苓菌種的篩選和分離培養(yǎng)技術。
背景技術：
：茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕，健脾和胃，寧心安神等功效。茯苓為安徽道地特色菌類藥材，習稱“安苓”，作為國家衛(wèi)生部批準的“藥食同源”中藥材之一，常被用作保健食品，已成為餐桌上常用的中藥，在大健康產(chǎn)業(yè)中具有廣闊的應用前景，安苓產(chǎn)量占全國三分之一，主產(chǎn)區(qū)為大別山區(qū)金寨縣、岳西縣等地，安苓不僅銷往亳州、安國等全國各大中藥材交易市場，還會遠銷香港、韓國、日本以及東南亞等地?，F(xiàn)代研究表明，茯苓中的主要的活性成分為茯苓多糖以及茯苓酸，以往的茯苓栽培往往忽略了有效成分含量這一重要的質控指標，本發(fā)明采用現(xiàn)代儀器分析手段，對于野生茯苓的有效成分含量進行測定，從而篩選出有效成分含量較高的大別山區(qū)野生茯苓菌種并進行進一步的菌種分離及培養(yǎng)，從源頭上保證了茯苓菌種優(yōu)良的遺傳特性，保證了茯苓藥材的質量。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種大別山區(qū)野生茯苓菌種的篩選和分離技術，選用野生采集的茯苓作為菌種篩選和分離培養(yǎng)對象，具體通過以下步驟實現(xiàn)：茯苓樣品預處理→茯苓多糖測定→茯苓酸測定→綜合評分→菌種分離培養(yǎng)。所述的茯苓樣品預處理的方法具體為：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于40~70℃烘箱中干燥2~8h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過60~100目篩，取過篩后樣品備用。所述的茯苓多糖測定的具體方法為：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30~80mL純水，超聲10~50min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min。取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量。所述的茯苓酸測定的具體方法為：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入10~50mL甲醇，浸泡10~60min，超聲50~150min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量。所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6。所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150~200g（去皮）、蔗糖1~30g、瓊脂1~20g、尿素1~5g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入20~30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。進一步優(yōu)化的：一種大別山區(qū)野生茯苓菌種的篩選和分離技術，選用野生采集的茯苓作為菌種篩選和分離培養(yǎng)對象，具體通過以下步驟實現(xiàn)：茯苓樣品預處理→茯苓多糖測定→茯苓酸測定→綜合評分→菌種分離培養(yǎng)。所述的茯苓樣品預處理的方法具體為：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于50~65℃烘箱中干燥4~6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過60~80目篩，取過篩后樣品備用。所述的茯苓多糖測定的具體方法為：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入40~60mL純水，超聲20~40min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量。所述的茯苓酸測定的具體方法為：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入20~40mL甲醇，浸泡20~40min，超聲80~100min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析。色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm。記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量。所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6。所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種。具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150~180g（去皮）、蔗糖1~20g、瓊脂1~15g、尿素1~3g、水1000mL；將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入25~30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。最優(yōu)的：一種大別山區(qū)野生茯苓菌種的篩選和分離技術，選用野生采集的茯苓作為菌種篩選和分離培養(yǎng)對象，具體通過以下步驟實現(xiàn)：茯苓樣品預處理→茯苓多糖測定→茯苓酸測定→綜合評分→菌種分離培養(yǎng)。所述的茯苓樣品預處理的方法具體為：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用。所述的茯苓多糖測定的具體方法為：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量。所述的茯苓酸測定的具體方法為：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm。記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量。所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6。所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000m，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面。移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。本發(fā)明的優(yōu)點在于：1）本發(fā)明采用先進的儀器設備檢測和分析野生茯苓中有效成分的含量，定量準確，數(shù)據(jù)真實可靠；2）本發(fā)明采用組織培養(yǎng)的方式對于優(yōu)選出的野生菌種進行培養(yǎng)和擴繁，保證了野生菌種的遺傳特性。具體實施方式一下通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明，不以任何形式構成對本發(fā)明的限制。實施例1A產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表1-1；表1-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.25922.16932.39242.83054.18660.709（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表1-2。表1-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.69720.59830.78140.81850.77760.441（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表1-3。表1-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分10.92221.22631.42641.62352.14160.548（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品5在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基。并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例2B產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表2-1。表2-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.91821.52431.40342.38852.00762.089（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表2-2。表2-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.57320.67230.89240.58850.97360.790（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表2-3。表2-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.11121.01331.09741.30851.38761.310（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品5在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種。具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基。并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例3C產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表3-1。表3-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）12.71621.46831.77842.57352.34461.592（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表3-2。表3-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.65320.74330.82040.91750.63260.550（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表3-3。表3-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.47821.03331.20341.57951.31760.967（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品4在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例4D產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表4-1。表4-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.21722.28131.51742.78352.52161.810（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表4-2。表4-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.98720.99030.90640.62150.56660.895（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表4-3。表4-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.07921.50731.15041.48651.34861.261（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品2在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種。具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基。并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例5E產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表5-1。表5-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.84221.92832.14341.10852.60762.336（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表5-2。表5-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.82520.68730.74940.52750.78560.713（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表5-3。表5-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.23221.18331.30740.75951.51461.362（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品5在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基。并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例6F產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用。（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表6-1。表6-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）12.54322.36831.68941.86751.86062.408（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析。色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表6-2。表6-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.68720.60230.85840.96050.82960.793（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表6-3。表6-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.42921.30831.19041.32351.24161.439（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品6在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例7G產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表7-1。表7-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）12.43122.03632.45542.52051.18862.088（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表7-2。表7-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.82020.71530.99340.56150.83060.637（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表7-3。表7-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.46521.24331.57841.34550.97361.217（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品3在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種。具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例8H產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表8-1。表8-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.62621.96632.35041.55552.72861.373（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析。色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表8-2。表8-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.88520.95930.61940.83650.63060.570（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表8-3。表8-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.18221.36231.31241.12451.46960.891（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品5在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例9I產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表9-1。表9-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.33822.66332.91441.23151.08662.434（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析。色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表9-2。表9-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.92320.87730.63140.72850.85260.514（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表9-3。表9-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.08921.59231.54440.92950.94661.282（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品2在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL。將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基。并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。實施例10J產(chǎn)地不同大別山區(qū)野生茯苓菌種篩選及分離培養(yǎng)（1）茯苓樣品預處理：將野生茯苓樣品去皮后，切塊，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎機粉碎為粗粉，過80目篩，取過篩后樣品備用；（2）茯苓多糖測定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入50mL純水，超聲30min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm處測定其吸光度（A），根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，結果見表10-1。表10-1不同野生茯苓樣品中茯苓多糖的含量編號茯苓多糖含量（%）11.34222.08732.00441.49051.08662.017（3）茯苓酸測定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色譜分析方法，包括：標準曲線的繪制、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗以及加樣回收率試驗，樣品測定方法為：精密稱取過篩后的野生茯苓樣品粉末1.0g于具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超聲90min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，稀釋至1.5mL，用0.45μm過濾后，進樣分析，色譜條件為：色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱溫：30℃；進樣量20μL；流速：1.0mL/min；檢測波長：360nm，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同野生茯苓樣品中茯苓酸的百分含量，結果見表10-2。表10-2不同野生茯苓樣品中茯苓酸的含量編號茯苓酸含量（%）10.97820.63130.75740.71250.84860.717（4）所述的綜合評分具體為：綜合評分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，結果見表10-3。表10-3不同野生茯苓樣品中有效成分含量綜合評分編號綜合評分11.12321.21331.25641.02350.94361.237（5）所述的菌種分離培養(yǎng)方法為：選取野生茯苓樣品綜合評分較高的樣品3在PDA斜面培養(yǎng)基上分離菌種，作為一級母種，具體制作方法為：培養(yǎng)基配方：馬鈴薯150g（去皮）、蔗糖10g、瓊脂10g、尿素1g、水1000mL，將上述配方按常規(guī)方法制成試管斜面培養(yǎng)基，并在無菌條件下，采用組織分離法，將茯苓菌核內(nèi)一塊白色茯苓肉接入培養(yǎng)基斜面，移入30℃的室內(nèi)培養(yǎng)5~7天待菌絲布滿斜面，即成。當前第1頁1 2 3