本發(fā)明涉及通式(I)取代苯并噻唑二芳基脲類化合物作為用于炎癥性和腫瘤性藥物的用途。
背景技術(shù)：
絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的一種，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶系列，能夠作為細(xì)胞內(nèi)眾多活化反應(yīng)和功能反應(yīng)的調(diào)節(jié)介質(zhì)，參與基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和死亡等眾多的功能性過程。p38 MAPK信號通路是MAPK家族的重要組成成員，它的活化是眾多前炎性因子和壓力因素作用的結(jié)果，不僅在眾多包括炎性細(xì)胞增殖分化和擴(kuò)增的細(xì)胞內(nèi)信號反饋過程中發(fā)揮著非常重要的作用，而且參與應(yīng)激反應(yīng)的過程。有許多相關(guān)的文獻(xiàn)描述了p38 MAPK相關(guān)的性質(zhì)和在疾病研究中的應(yīng)用以及前景。
p38 MAPK原先被認(rèn)為是通過細(xì)胞因子發(fā)揮抑制作用的抗炎藥物的結(jié)合蛋白(CSBP)，首先在1993年由Han等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，1994年由Han等首先在小鼠肝臟細(xì)胞中克隆了p38 MAPK的基因，它是編碼由360個氨基酸組成的38KD的蛋白，在炎性細(xì)胞因子的生物合成過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
目前發(fā)現(xiàn)的p38 MAPK家族包含著四種類型：p38α，p38β，p38γ and p38δ。不同p38 MAPK亞型在組織分布、上游激酶調(diào)節(jié)、下游作用底物以及對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)都各有不同，不同亞型的p38 MAPK在結(jié)構(gòu)上也有著不同程度的相似性。p38α和p38β在各種體內(nèi)組織中都有著廣泛的表達(dá)，同時(shí)它們包含了74％相同的氨基酸序列，并且它們都是特異性表達(dá)的，p38γ與p38α有著64％的氨 基酸同源性，p38γ則主要在骨骼肌中表達(dá)，而p38δ則在小腸、肺組織、腎上腺、前列腺等處比較常見。由于p38α和β在身體各部位的分布比較廣泛，因而針對p38 MAPK的抑制劑主要是針對p38α和β的抑制。許多證據(jù)表明p38 MAPK途徑在炎癥疾病和癌癥中表現(xiàn)出重要的作用。對p38 MAPK在這些相關(guān)疾病中的作用進(jìn)行了總結(jié)，同時(shí)也表明了p38 MAPK的抑制劑具有作為治療手段的潛在價(jià)值。
我們創(chuàng)造性發(fā)明了全新的二芳基脲類化合物用作P38 MAPK抑制劑的研究，通過高通量篩選評價(jià)了這類化合物在體外對P38 MAPK通路的抑制作用。發(fā)現(xiàn)幾乎所有實(shí)施例化合物細(xì)胞活性與P38α酶活性都優(yōu)于文獻(xiàn)公認(rèn)的P38抑制劑SB203580，其中化合物實(shí)施例11和文獻(xiàn)報(bào)道的陽性對照藥SB203580比較，TNF-α抑制活性增強(qiáng)25倍，P38α酶抑制活性增強(qiáng)10倍。
本發(fā)明報(bào)道的具有高活性的P38 MAPK小分子抑制劑，用以克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病及腫瘤疾病的難題，特別是窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病，為這類疾病的臨床治療提供新的醫(yī)學(xué)策略。
本發(fā)明目的在于提供一類新型的二芳基脲類化合物作為用于炎癥性和腫瘤性藥物的用途。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
1.本發(fā)明涉及通式(I)化合物或其異構(gòu)體的內(nèi)容
其中：
R1獨(dú)立的為C1-C10飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，鹵素，硝基，羥基，氨基，羧基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基取代；
R2獨(dú)立的為H或鹵素原子取代；
R3獨(dú)立的為C1-C10飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，苯環(huán)或取代苯環(huán)取代，烷氧羰基取代，芳氧羰基取代，烷氨羰基取代，芳胺羰基取代；
另一方面，本發(fā)明提供包含化合物通式(I)化合物藥物的藥用組合物，其含有至少一種通式(I)化合物或其可藥用鹽、溶劑化物，一級一種或多種藥用載體或賦形劑。
另一方面，本發(fā)明還涉及制備通式(I)化合物或者其藥用鹽或溶劑化物的方法。
再一方面，本發(fā)明涉及通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病的藥用用途。
在又一方面，本發(fā)明提供通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險(xiǎn)因子或病癥的方法，包括給予有此需要的對象治療或是預(yù)防有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明中所述的細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險(xiǎn)因子或病癥包括下列疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性肺阻塞，窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，萊特爾氏綜合征，痛風(fēng)，骨關(guān)節(jié)炎，外傷性關(guān)節(jié)炎，急性滑膜炎，類風(fēng)濕性脊柱炎，痛風(fēng)性疾病和其他關(guān)節(jié)疾病，敗血癥，膿毒性休克，骨髓增生異常綜合征，中毒性休 克，腦性瘧，腦膜炎，局部出血性中風(fēng)，骨質(zhì)疏松，充血性心力衰竭，冠狀動脈旁路搭橋術(shù)，腎小球性腎炎，慢性腎衰竭，糖尿病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，肌肉退化，濕疹，接觸性皮炎，牛皮癬，結(jié)膜炎，癌癥的輔助治療等。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽或溶劑化物，
其中：
R1獨(dú)立的為C1-C10飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，鹵素，硝基；
R2獨(dú)立的為H或鹵素原子取代；
R3獨(dú)立的為C1-C10飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，苯環(huán)或取代苯環(huán)取代，烷氧羰基取代，芳氧羰基取代，烷氨羰基取代，芳胺羰基取代；
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽或溶劑化物，
其中：
R1獨(dú)立的為甲基，硝基，H原子取代；
R2獨(dú)立的為H或F原子取代；
R3獨(dú)立的為H，甲氧羰基，乙胺羰基，環(huán)丙基胺羰基，環(huán)戊基胺羰基，環(huán)己基胺羰基，氯乙基胺羰基，異丙基胺羰基取代；
本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括：
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{{2-[3-(叔丁基)脲基]苯并噻唑-6-基}氧基}芐基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-乙基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}芐基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{{2-[3-(2-氯乙基)脲基]苯并噻唑-6-基}氧基}芐基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-環(huán)己基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}芐基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-乙基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}-5-氟芐基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-環(huán)己基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}-5-氟芐基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{{2-[3-(叔丁基)脲基]苯并噻唑-6-基}氧基}-5-氟芐基}脲
甲基{6-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5-基]脲基}甲基}-4-氟苯氧基}苯并噻唑-2-基}氨基甲酸酯
甲基{6-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5-基]脲基}甲基}苯氧基}苯并噻唑-2-基}氨基甲酸酯
甲基{6-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲基}甲基}苯氧基}苯并噻唑-2-基}氨基甲酸酯
以及其可藥用鹽或溶劑化物。
R1＝CH3，NO2，H
取代的苯肼A與氰基頻那酮B于80℃乙醇回流8小時(shí)得到中間體C；中間體C通過與氯甲酸三氯乙酯在0℃四氫呋喃溶液中反應(yīng)12小時(shí)得到中間體D。
取代的鄰氰基氟苯E與4-氨基苯酚P在90℃DMSO溶液中反應(yīng)4小時(shí)得到中間體F；中間體F和硫氰酸鉀，液溴在室溫條件下乙酸溶液中反應(yīng)8小時(shí)得到產(chǎn)物G；中間體G在65℃四氫呋喃溶液中通過氫化鋁鋰還原1小時(shí)得到中間體H。
中間體D與中間體H在100℃DMSO溶液中反應(yīng)1小時(shí)得到中間體I；最后中間體I與取代的異氰酸酯在二氯甲烷中室溫反應(yīng)4h得到通式(I)化合物J。
再一方面，本發(fā)明提供一種用于克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物組合物，其包含上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
再一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，另外包含一種或多種克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物組合物，其包含上述式I的化合物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
再一方面，本發(fā)明提供上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，它們用作克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物。
再一方面，本發(fā)明提供一種克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病及腫瘤性疾病的方法，其包括向該受試者給予治療有效量的上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，并且任選聯(lián)合給予一種或多種其它抗炎藥物。
再一方面，本發(fā)明提供上述式I的化合物或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可 接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病。
現(xiàn)將本申請說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)的用于描述本發(fā)明的術(shù)語定義如下。對于特定的術(shù)語，如果本申請中定義的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義不一致，則以本申請中定義的含義為準(zhǔn)；如果在本申請中沒有定義，則其具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷基”是指直鏈或支鏈一價(jià)飽和烴基?！癈1-C10烷基”是指具有1～10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、異戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基和辛基等。術(shù)語“C1-C6烷基”意指具有1～6，即1、2、3、4、5或6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，典型地為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基等。相似地，術(shù)語“C1-C3烷基”意指具有1、2或3個碳原子的直鏈或支鏈烷基，即甲基、乙基、正丙基和異丙基。本發(fā)明中的烷基優(yōu)選是C1-C6烷基，更優(yōu)選是C1-C3烷基。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴以及碘原子。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳香基”是指包含至少一個不飽和芳環(huán)的任選被取代的單環(huán)或二環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)，優(yōu)選具有6～10，即6、7、8、9或10個碳原子的芳基。本發(fā)明中的芳香基的實(shí)例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氫萘基、吲哚基和茚基等。本發(fā)明中的芳香基可以被以下基團(tuán)取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6鹵代烷基或C1-C6鹵代烷氧基。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的飽和碳環(huán)基團(tuán)。該環(huán)烷基可以是單環(huán)或者多環(huán)稠合系統(tǒng)，而且可以稠合在芳環(huán)上。這些基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基等。本文的環(huán)烷基可以是未取代的，或者在一個或多個可取代的位置被合適的基團(tuán)取代。例如，本發(fā)明中的環(huán)烷基可任選被以下基團(tuán)取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6鹵代烷基或C1-C6鹵代烷氧基。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指包含至少一個和最多四個獨(dú)立地選自N、O或S的雜原子的任選被取代的單環(huán)和雙環(huán)飽和、部分飽和或不飽和的環(huán)狀系統(tǒng)，優(yōu)選具有4～10，即4、5、6、7、8、9或10個原子的5、6或7元雜環(huán)基，條件是該雜環(huán)基的環(huán)不含兩個相鄰的O或S原子。優(yōu)選的雜環(huán)基包括但不限于吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、哌啶基、嗎啉基或哌嗪基等。本發(fā)明中的雜環(huán)基可以被以下基團(tuán)取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6鹵代烷基或C1-C6鹵代烷氧基。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳基烷基”是指被一個或多個如上定義的芳基取代的如上定義的烷基。優(yōu)選的芳基烷基是芳基-C1-C3烷基。本發(fā)明中的芳基烷基的實(shí)例包括芐基和苯基乙基等。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳香雜環(huán)基烷基”是指被如上定義的芳香雜環(huán)基取代的如上定義的烷基。更優(yōu)選的芳香雜環(huán)基烷基是5-或6-元雜芳基-C1-C3-烷基。本發(fā)明中的雜芳基烷基的實(shí)例包括吡啶基乙基等。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基烷基”是指被如上定義的雜環(huán)基取代的如上定義的烷基。更優(yōu)選的雜環(huán)基烷基是5或6元雜環(huán)基-C1-C3-烷基。本 發(fā)明中的雜環(huán)基烷基的實(shí)例包括四氫吡喃基甲基。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”意指在制藥上可接受的并且具有母體化合物的所需藥理學(xué)活性的本發(fā)明化合物的鹽。這類鹽包括：與無機(jī)酸或與有機(jī)酸形成的酸加成的鹽，所述的無機(jī)酸諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有機(jī)酸諸如乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟腦磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母體化合物上存在的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子或堿土金屬離子取代時(shí)形成的鹽；或與有機(jī)堿形成的配位化合物，所述的有機(jī)堿諸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“溶劑化物”意指本發(fā)明化合物與制藥上可接受的溶劑結(jié)合形成的物質(zhì)。制藥上可接受的溶劑包括水，乙醇，乙酸等。溶劑化物包括化學(xué)計(jì)算量的溶劑合物和非化學(xué)計(jì)算量的溶劑合物，優(yōu)選為水合物。本發(fā)明的化合物可以用水或各種有機(jī)溶劑結(jié)晶或重結(jié)晶，在這種情況下，可能形成各種溶劑化物。
本發(fā)明的藥物組合物包括有效劑量的本發(fā)明式式I化合物或其異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽或水合物和一種或多種適宜的藥學(xué)上可接受的載體。這里的藥用載體包括但不限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，羊毛脂。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用：口服，噴霧 吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。
當(dāng)口服用藥時(shí)，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。如果需要，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。
當(dāng)局部用藥時(shí)，特別是治療局部外敷容易達(dá)到的患面或器官，如眼睛、皮膚或下腸道神經(jīng)性疾病時(shí)，可根據(jù)不同的患面或器官將本發(fā)明化合物制成不同的局部用藥制劑形式，具體說明如下：
當(dāng)眼部局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可配制成一種微粉化懸浮液或溶液的制劑形式，所使用載體為等滲的一定pH的無菌鹽水，其中可加入也可不加防腐劑如氯化芐基烷醇鹽。對于眼用，也可將化合物制成膏劑形式如凡士林膏。
當(dāng)皮膚局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)能浉?、洗劑或霜劑制劑形式，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于：礦物油，液體凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蠟和水；洗劑或霜劑可使用的載體包括但不限于：礦物油，脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，吐溫60，十六烷酯蠟，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，芐醇和水。
本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單 甘油酯或二甘油酯。
具體實(shí)施方式
下面的具體實(shí)施例是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其不應(yīng)理解為對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
化合物的熔點(diǎn)由RY-1熔點(diǎn)儀測定，溫度計(jì)未較正。質(zhì)譜由Micromass ZabSpec高分辨率質(zhì)譜儀(分辨率1000)測定。1H NMR由JNM-ECA-400超導(dǎo)NMR儀測定，工作頻率1H NMR 400MHz，13C NMR 100MHz。
實(shí)施例
實(shí)施例1 甲基{6-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5-基]脲基}甲基}-4-氟苯氧基}苯并噻唑-2-基}氨基甲酸酯
在250mL茄型瓶中加入100mL乙醇，(30mmol)特戊酰基乙腈，(33.63mmol)4-甲基苯肼，攪拌下滴加3.6mL濃鹽酸，加熱回流8小時(shí)，冷卻，濃縮，殘余物用稀氫氧化鈉調(diào)pH 10-11，用乙酸乙酯提取三次，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到的固體用乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶得到白色晶體C，收率80.3％。5-叔丁基-2-對甲基苯基-3-氨基吡唑(3.5mmolC)置于100ml三頸瓶中，以30ml四氫呋喃溶解，將三頸瓶置于低溫槽降溫至-20℃，攪拌下分批加入2.9g碳酸氫鈉，15min后，逐滴滴加氯甲酸三氯乙酯(3.5mmol)，控制溶液溫度不超過 0℃，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30min，然后升溫至0℃反應(yīng)12h.反應(yīng)完畢，混合物過濾，濾渣用乙酸乙酯沖洗，濾液濃縮，收率85％。
取105mmol 2-腈基-4-氟氟苯溶于150ml DMSO中，分批加入15g碳酸鉀。混合液室溫?cái)嚢?0min。稱取100mmol 4-氨基苯酚加入反應(yīng)液，將混合液加熱至90℃，反應(yīng)12h。反應(yīng)畢。反應(yīng)液倒入200ml冰水，置于冰箱中，3h后，取出，有黃色固體Q析出，過濾，干燥，收率90％。取50mmol的中間體Q溶解于50ml的冰醋酸溶液中，控溫T＜0℃，加入75mmol的KSCN入反應(yīng)液，攪拌20min，以1滴/2秒的速度加入50mmol的液溴，室溫反應(yīng)8小時(shí)，反應(yīng)完畢，反應(yīng)液倒入200ml水中，用氨水調(diào)節(jié)PH＝8-9，析出白色固體R，抽濾，干燥，收率73％。取50mmol四氫鋰鋁加入25ml無水四氫呋喃中，反應(yīng)瓶置于冰浴中，取中間體R 10mmol溶20ml無水四氫呋喃，溶液逐滴滴入四氫鋰鋁的混懸液，滴加完畢后，65℃回流攪拌1h。反應(yīng)畢，混合液中加入乙醇至無氣泡產(chǎn)生，過濾，濃縮，以柱層析分離產(chǎn)物S，產(chǎn)率70％。
在50mL三口瓶中加入20mL二甲亞砜，加入化合物0.5mmol 2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基)酰胺D，再加入中間體S 0.5mmol，滴加0.5ml三乙胺入反應(yīng)，加熱80℃反應(yīng)1小時(shí)。冷卻，倒入150ml水中，用乙酸乙酯提取3次，有機(jī)層用飽和氯化鈉洗滌3次，無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮，柱層析分離產(chǎn)物T，產(chǎn)率55％。取中間體T 0.5mmol加入50ml單口瓶中，用20ml DCM和1ml DMSO混合溶劑溶解，向反應(yīng)液中加入2.5mmol的氯甲酸甲酯，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)液倒入50ml水中，二氯甲烷提取3次，無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮，柱層析分離得終產(chǎn)物U白色固體，產(chǎn)率90％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：12.07(s，1H)，8.25(s，1H)，7.69(d，1H)，7.58(s，1H)，7.35(m，6H)，7.26(m，3H)，6.22(s，1H)，4.30(d，2H)，3.78(s，3H)，2.35(s，3H)，1.24(s，9H).(M+H)+：603.Mp：177-179℃.
實(shí)施例2 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{{2-[3-(叔丁基)脲基]苯并噻唑-6-基}氧基}芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為異氰酸叔丁酯，2-腈基-4-氟氟苯改為鄰氟苯腈，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.26(s，1H)，8.22(s，1H)，7.58(d，1H)，7.49(s，1H)，7.25(m，6H)，7.09(m，6H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.29(d，2H)，2.35(s，3H)，1.32(s，9H)，1.24(s，9H).(M+H)+：626.Mp：180-182℃.
實(shí)施例3 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-乙基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為乙基異氰酸酯，2-腈基-4-氟氟苯改為鄰氟苯腈，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.65(s，1H)，8.22(s，1H)，7.58(d，1H)，7.49(s，1H)，7.25(m，6H)，7.09(m，6H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.29(d，2H)，3.11(m，2H)，2.35(s，3H)，1.24(s，9H)，0.85(t，3H).(M+H)+：598.Mp：183-185℃.
實(shí)施例4 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{{2-[3-(2-氯乙基)脲基]苯并噻唑-6-基}氧基}芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為2-氯乙基異氰酸酯，2-腈基-4-氟氟苯改為鄰氟苯腈，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.65(s，1H)，8.22(s，1H)，7.58(d，1H)，7.49(s，1H)，7.25(m，6H)，7.09( m，6H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.28(d，2H)，3.75(m，2H)，3.55(m，2H)，2.34(s，3H)，1.25(s，9H).(M+H)+：632.Mp：199-201℃.
實(shí)施例5 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-環(huán)己基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為環(huán)己基異氰酸酯，2-腈基-4-氟氟苯改為鄰氟苯腈，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.39(s，1H)，8.22(s，1H)，7.58(d，1H)，7.49(s，1H)，7.25(m，6H)，7.09(m，6H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.29(d，2H)，3.40(m，1H)，2.34(s，3H)，1.53(m，6H)，1.24(s，9H)，0.95(m，4H).(M+H)+：652.Mp：151-153℃.
實(shí)施例6 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-乙基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}-5-氟芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為乙基異氰酸酯，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.55(s，1H)，8.22(s，1H)，7.53(d，1H)，7.49(s，1H)，7.29(m，6H)，7.09(m，5H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.29(d，2H)，3.11(m，2H)，2.35(s，3H)，1.24(s，9H)，0.85(t，3H).(M+H)+：616.Mp：155-157℃.
實(shí)施例7 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{[2-(3-環(huán)己基脲基)苯并噻唑-6-基]氧基}-5-氟芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為環(huán)己基異氰酸酯，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.39(s，1H)，8.22(s，1H)，7.58(d，1H)，7.49(s，1H)，7.25(m，6H)，7.09( m，5H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.29(d，2H)，3.40(m，1H)，2.34(s，3H)，1.53(m，6H)，1.24(s，9H)，0.95(m，4H).(M+H)+：670.Mp：175-177℃.
實(shí)施例8 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5基]-3-{2-{{2-[3-(叔丁基)脲基]苯并噻唑-6-基}氧基}-5-氟芐基}脲
采用實(shí)施例1的方法，將其中的氯甲酸甲酯改為叔丁基異氰酸酯，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：10.36(s，1H)，8.22(s，1H)，7.58(d，1H)，7.49(s，1H)，7.25(m，5H)，7.09(m，5H)，7.09(m，1H)，7.00(m，1H)，6.94(m，1H)，6.91(d，2H)，6.62(s，1H)，6.22(s，1H)，4.29(d，2H)，2.35(s，3H)，1.32(s，9H)，1.24(s，9H).(M+H)+：644.Mp：182-184℃.
實(shí)施例9 甲基{6-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-1H-吡唑-5-基]脲基}甲基}苯氧基}苯并噻唑-2-基}氨基甲酸酯
采用實(shí)施例1的方法，2-腈基-4-氟氟苯改為鄰氟苯腈，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：12.07(s，1H)，8.25(s，1H)，7.69(d，1H)，7.58(s，1H)，7.35(m，6H)，7.26(m，4H)，6.22(s，1H)，4.30(d，2H)，3.78(s，3H)，2.35(s，3H)，1.24(s，9H).(M+H)+：585.Mp：154-156℃.
實(shí)施例10 甲基{6-{2-{{3-[3-(叔丁基)-1-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲基}甲基}苯氧基}苯并噻唑-2-基}氨基甲酸酯
采用實(shí)施例1的方法，2-腈基-4-氟氟苯改為鄰氟苯腈，2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基)酰胺改為2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-硝基-苯基)-1H-吡唑-5-基)酰胺，得到白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：12.09(s，1H)，8.25(s，1H)，7.59(d，1H)，7.58(s，1H)，7.35(m，6H)，7.26(m，4H)，6.22(s，1H)，4.30(d，2H)，3.78(s，3H)，1.24(s，9H).(M+H)+：616. Mp：163-165℃.
實(shí)施例11 1-{2-[(2-氨基苯并噻唑-6-基)氧基]芐基}-3-[3-(叔丁基)-1-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲
采用實(shí)施例1的方法，得到產(chǎn)物白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.58(s，1H)，8.32(d，2H)，7.82(d，2H)，7.41(s，2H)，7.25(m，4H)，7.06(m，2H)，6.99(m，1H)，6.87(m，1H)，6.32(s，1H)，4.29(d，2H)，1.27(s，9H).(M+H)+：558.Mp：135.2-137.98℃.
實(shí)施例12 1-{2-[(2-氨基苯并噻唑-6-基)氧基]5-氟芐基}-3-[3-(叔丁基)-1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲
采用實(shí)施例1的方法，得到產(chǎn)物白色固體。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.58(s，1H)，8.32(d，2H)，7.82(d，2H)，7.41(s，2H)，7.25(m，3H)，7.06(m ，2H)，6.98(m，1H)，6.85(m，1H)，6.32(s，1H)，4.29(d，2H)，1.27(s，9H).(M+H)+：545.Mp：145.1-147.2℃.
實(shí)施例13 在脂多糖誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞TNF-α檢測實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行藥物篩選
新鮮血液收集和PBMC分離
1.采血員聯(lián)系志愿者，采集足夠新鮮血液儲存于肝素鈉采血管中。
2.轉(zhuǎn)移DPBS對比稀釋的血液至加有15ml Lymphoprep分離液的SepMate分離管中，
3.常溫1200g離心30分鐘，無剎車停止離心。
4.吸出白膜層(包含PBMC)，DPBS洗兩次。
5.用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基重懸PBMC，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
LPS誘導(dǎo)的TNF-α釋放實(shí)驗(yàn)
1.PBMC鋪板每孔8萬個細(xì)胞，按計(jì)劃加稀釋過的化合物，37度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一小時(shí)。
2.加LPS刺激細(xì)胞。終濃度為10ng/ml。37度細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜。
3.離心取上清，按照TNF-αELISA試劑盒步驟檢測細(xì)胞上清中的TNF-α含量。
4.FlexStation3讀取吸光度，導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算IC50。
實(shí)施例14 藥物對p38α酶的抑制實(shí)驗(yàn)篩選化合物
1.準(zhǔn)備濃度為500ng/ml的p38α緩沖液。
2.利用濃度為500ng/ml激酶緩沖溶液連續(xù)2倍稀釋，稀釋16個點(diǎn)。
3.取5uL稀釋過的p38α緩沖溶液加入384孔板中。
4.準(zhǔn)備0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。
5.在每個空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出發(fā)反應(yīng)。
6.密封室溫培養(yǎng)1小時(shí)。
7.準(zhǔn)備ATF-2抗體1ml。
8.向每個孔中加入10ul的抗體，混合均勻。
9.密封，室溫培養(yǎng)30分鐘。
10.在儀器上讀取TR-FRET信號。
11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每個孔3倍稀釋，11個濃度，2次重復(fù)(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。
12.加入4uL p38α到每個孔中。
13.室溫培養(yǎng)15分鐘。
14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激發(fā)反應(yīng)。
15.室溫培養(yǎng)1小時(shí)。
16.每個孔加入10uL抗體。
17.室溫培養(yǎng)30分鐘。
18.儀器上讀取TR-FRET信號，計(jì)算IC50值。
實(shí)施例15 化合物對p38α/β/γ/δ酶的選擇性抑制實(shí)驗(yàn)
1.準(zhǔn)備濃度為500ng/ml的p38α/β/γ/δ緩沖液。
2.利用濃度為500ng/ml激酶緩沖溶液連續(xù)2倍稀釋，稀釋16個點(diǎn)。
3.取5uL稀釋過的p38α緩沖溶液加入384孔板中。
4.準(zhǔn)備0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。
5.在每個空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出發(fā)反應(yīng)。
6.密封室溫培養(yǎng)1小時(shí)。
7.準(zhǔn)備ATF-2抗體1ml。
8.向每個孔中加入10ul的抗體，混合均勻。
9.密封，室溫培養(yǎng)30分鐘。
10.在儀器上讀取TR-FRET信號。
11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每個孔3倍稀釋，11個濃度，2次重復(fù)(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。
12.加入4uL p38α到每個孔中。
13.室溫培養(yǎng)15分鐘。
14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激發(fā)反應(yīng)。
15.室溫培養(yǎng)1小時(shí)。
16.每個孔加入10uL抗體。
17.室溫培養(yǎng)30分鐘。
18.儀器上讀取TR-FRET信號，計(jì)算IC50值。