本發(fā)明涉及一種查爾酮化合物，尤其涉及HDPC-12(2-羥基-4,4′-二異戊烯氧基查爾酮)以及以該查爾酮化合物為活性物質(zhì)的藥物組合物，該查爾酮化合物的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

查爾酮類化合物是以1,3-二苯基丙烯酮為基本骨架結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，廣泛存在于甘草、紅花等多種藥物植物中，是植物體內(nèi)合成黃酮的前體，同時(shí)也是一類重要的有機(jī)醫(yī)藥中間體，由于其分子具有較大的柔性，能與不同的受體結(jié)合，表現(xiàn)出多方面的生物學(xué)活性，特別是在抗失眠、抗衰老、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗病毒、抗菌、抗炎、抗血小板凝集等方面活性顯著，已成為國(guó)內(nèi)外天然藥物開發(fā)利用研究的熱點(diǎn)。如：專利號(hào)為ZL02113777.3(授權(quán)公告號(hào)為CN 1197560C)的中國(guó)發(fā)明專利《一種預(yù)防或治療艾滋病的藥物及其制備方法和應(yīng)用》公開了一種具有預(yù)防或治療艾滋病作用的酒花查爾酮；申請(qǐng)?zhí)枮镃N2014102451182.9(公開號(hào)為CN104016843A)的中國(guó)發(fā)明專利《一種具有改善睡眠作用的查爾酮化合物》；專利號(hào)為ZL200910264515.1(授權(quán)公告號(hào)為CN101759544A)的中國(guó)發(fā)明專利《一種新查耳酮化合物及其制備方法與應(yīng)用》公開了一種具有抗腫瘤和抗炎癥作用的新耳酮化合物。

腫瘤是威脅人類生命的常見疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球腫瘤死亡總數(shù)達(dá)700萬(wàn)人，我國(guó)每年死于腫瘤者達(dá)100多萬(wàn)人，并呈逐年增加趨勢(shì)，腫瘤已成為城市人口的第一位死因，因此尋找有效、安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物，一直是腫瘤藥物研發(fā)工作這孜孜以求的目標(biāo)。目前研究發(fā)現(xiàn)的查爾酮化合物抗腫瘤作用主要表現(xiàn)為：(1)抑制細(xì)胞增殖，對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，對(duì)正常細(xì)胞無毒性和致突作用，同時(shí)具有抗氧化和正向的免疫調(diào)節(jié)作用；(2)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；(3)查爾酮類化合物能抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶等的活性；(4)查爾酮化合物具有抗炎、抗氧化作用和促進(jìn)抑癌基因表達(dá)的作用。近年來對(duì)查爾酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的相關(guān)性研究越來越受重視，這對(duì)從自然界中尋找查爾酮先導(dǎo)化合物和進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾，以及對(duì)創(chuàng)制新藥具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種具有抗腫瘤活性的查爾酮化合物HDPC-12(2-羥基-4,4′-二異戊烯氧基查爾酮)。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述查爾酮化合物HDPC-12的制備方法。

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種以上述查爾酮化合物HDPC-12為活性組分的藥物組合物。

本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述查爾酮化合物HDPC-12的應(yīng)用。

本發(fā)明解決第一個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種查爾酮化合物HDPC-12，其特征在于，所述查爾酮化合物的結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示。

本發(fā)明解決第二個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：上述查爾酮化合物HDPC-12的制備方法中，以式Ⅱ所述的化合物Ⅱ?yàn)槠鹗嘉镏苽洹?/p>

進(jìn)一步，上述查爾酮化合物HDPC-12的具體制備方法為：向所述化合物Ⅱ中加入4-異戊烯氧基苯甲醛，混合均勻后滴加由無水乙醇和KOH固體配成的14％KOH溶液，室溫反應(yīng)9～10h，所述化合物Ⅱ、4-異戊烯氧基苯甲醛和KOH的質(zhì)量比為1:1.2～1.4:9～10；反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入冰水中，用3mol/L HCl調(diào)至中性，過濾得到黃色固體，干燥得粗產(chǎn)品，最后粗產(chǎn)品用95％乙醇重結(jié)晶，即得所述查爾酮化合物。

本發(fā)明解決第三個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于抗腫瘤活性的藥物組合物，包括有效劑量的作為活性組分的上述的查爾酮化合物HDPC-12和至少一種可藥用賦形劑，所述的可藥用賦形劑為惰性無毒賦形劑，該藥物組合物特別指適合口服、非腸道(靜脈或皮試)和鼻內(nèi)途徑給藥的那些片劑或糖衣片劑、舌下片劑、明膠膠囊、栓劑、霜?jiǎng)④浉鄤?、皮膚用凝膠劑、可注射制劑或可飲用懸浮液等?？商貏e提及適合口服、非腸道(靜脈或皮試)和鼻內(nèi)途徑給藥的那些片劑或糖衣片劑、舌下片劑、明膠膠囊、栓劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、皮膚用凝膠劑、可注射制劑或可飲用懸浮液等，各種劑型可以按 照藥物領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

本發(fā)明解決第四個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：上述查爾酮化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明中的查爾酮化合物HDPC-12具有顯著的抗腫瘤活性作用，該查爾酮化合物能顯著抑制人肺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖并呈一定的濃度相關(guān)性，抑制SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡，并且一定濃度的HDPC-12對(duì)SPC-A-1細(xì)胞中的pro-caspase9、caspase 9、caspase 3、Bax的蛋白水平均具有明顯的上調(diào)作用，對(duì)Bcl-2蛋白水平具有明顯的下調(diào)作用，顯示出具有價(jià)值的作為抗腫瘤的藥理性質(zhì)作用；同時(shí)該查爾酮化合物原料來源豐富、低廉，制備方法簡(jiǎn)單，可制成各種劑型的抗腫瘤藥物或者與其他藥物共同組方，制成多靶點(diǎn)抗腫瘤的復(fù)方藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中不同濃度的HDPC-12對(duì)SPC-A-1增殖活性的影響；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中HDPC-12不同作用時(shí)間下對(duì)SPC-A-1的IC₅₀值；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中HDPC-2對(duì)SPC-A-1細(xì)胞影響的倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)圖(×200)，其中A為對(duì)照組，B為25μg/mL加藥組，C為50μg/mL加藥組，D為100μg/mL加藥組；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中HDPC-12對(duì)SPC-A-1細(xì)胞影響的HE染色細(xì)胞形態(tài)圖(×400)，其中A為對(duì)照組，B為25μg/mL加藥組，C為50μg/mL加藥組，D為100μg/mL加藥組；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中HDPC-12對(duì)SPC-A-1細(xì)胞影響的AO/EB染色細(xì)胞形態(tài)圖(×200)，其中A為對(duì)照組，B為25μg/mL加藥組，C為50μg/mL加藥組，D為100μg/mL加藥組；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中HDPC-12對(duì)SPC-A-1細(xì)胞影響的透射電鏡圖，其中A為對(duì)照組(×4200)，B為25μg/mL加藥組(×2500)，C為50μg/mL加藥組(×4200)，D為100μg/mL加藥組(×5900)；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中流式細(xì)胞檢測(cè)HDPC-12對(duì)SPC-A-1細(xì)胞凋亡的影響，其中左上圖為對(duì)照組，右上圖為25μg/mL加藥組，左下圖為50μg/mL加藥組，右下圖為100μg/mL加藥組；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例5中HDPC-12作用24h對(duì)SPC-A-1細(xì)胞影響的線粒體膜電位圖，其中左上圖為對(duì)照組，右上圖為25μg/mL加藥組，左下圖為50μg/mL加藥組，右下圖為100μg/mL加藥組；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例6中HDPC-12作用24h后的SPC-A-1細(xì)胞中Bcl-2、Bax、 pro-caspase9、caspase9和caspase 3的Western blotting蛋白電泳條帶圖，圖中正常為對(duì)照組，低濃度組為25μg/mL組，中濃度組為50μg/mL組，高濃度組為100μg/mL組；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例6中HDPC-12作用24h后的SPC-A-1細(xì)胞中Bax蛋白經(jīng)Aphla化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析后的水平表達(dá)與β-actin比值變化示意圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例6中HDPC-12作用24h后的SPC-A-1細(xì)胞中Bcl-2蛋白經(jīng)Aphla化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析后的水平表達(dá)與β-actin比值變化示意圖；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例6中HDPC-12作用24h后的SPC-A-1細(xì)胞中caspase9蛋白經(jīng)Aphla化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析后的水平表達(dá)與β-actin比值變化示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1：HDPC-12(2-羥基-4,4′-二異戊烯氧基查爾酮)的制備

向0.5g 3.2mmol化合物II中加入0.648g 4.8mmol 4-異戊烯氧基苯甲醛，混合均勻后，滴加由35mL無水乙醇和4.9g KOH配成14％KOH的溶液，室溫反應(yīng)10h，其中上述化合物II的結(jié)構(gòu)式為如下式II所示。

反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入60mL冰水中，用3mol/L HCl調(diào)pH至中性，過濾得到黃色固體，干燥，粗產(chǎn)品用95％乙醇重結(jié)晶，得黃色晶體，即所需的查爾酮化合物HDPC-12(2-羥基-4,4′-二異戊烯氧基查爾酮)。

上述制備的查爾酮化合物HDPC-12經(jīng)過IR、¹H-NMR、¹³C-NMR、MS和元素分析確定其結(jié)構(gòu)和純度，光譜數(shù)據(jù)如下：

產(chǎn)率:71％，熔點(diǎn)：75-77℃。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)：δ1.69(s,6H,-C₂H₆),1.74(s,6H,-C₂H₆),4.49(m,4H,-C₂H₄),5.42(t,2H,J＝9Hz,＝CH),6.40-7.74(m,4H,-C₆H₄),7.39(d,1H,J＝15Hz,＝CH),6.86-6.93(m,3H,-C₆H₃),7.79(d,1H,J＝15Hz,＝CH),13.50(s,1H,-OH).¹³C-NMR(CDCl₃,75MHz):18.2,18.4,25.4,25.7,65.1,65.2,102.7,108.6,113.7,118.5,123.3,123.4,127.6,128.6,130.5,131.5,131.8,132.3,132.5,136.6,138.6,139.4,165.5,166.9,191.7.IR(KBr)cm^－1:3215,1642,1584,1221,970.Anal.Calcd.for C₂₅H₂₈O₄:C,76.50；H,7.19；O,16.31.Found:C,76.45；H,7.05；O,16.20.MS m/z 393(M+1)。

實(shí)施例2：細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

2.1SPC-A-1細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌SPC-A-1細(xì)胞(購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù))置于1640培養(yǎng)液(GIbco公司)、37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)時(shí)，0.25％的胰蛋白酶消化，每2～3天傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞懸液，以1×10⁴/mL接種至96孔板，每孔200μL，培養(yǎng)24h后吸棄上清。

2.2MTT法檢測(cè)

設(shè)對(duì)照組及12.5、25、50和100μg/mL加藥組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h和72h后棄培養(yǎng)液，加入1mg/mLMTT(GIbco公司)200μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄MTT，加入150μL的DMSO，充分混合。置酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)在490nm測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)(IR)，IR＝[(對(duì)照組A值-加藥組A值)/(對(duì)照組A值-調(diào)零孔A值]×100％，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.3試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，由圖1可見，隨著HDPC-12濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SPC-A-1細(xì)胞的增殖抑制指數(shù)明顯上升，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且，如圖2所示，24h、48h和72h的IC₅₀分別為27.9μg/mL、31.9μg/mL和39.5μg/mL。

實(shí)施例3：人肺癌SPC-A-1細(xì)胞形態(tài)觀察

3.1光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

6孔培養(yǎng)板內(nèi)放入經(jīng)處理過的蓋玻片(經(jīng)賴氨酸浸泡)，取SPC-A-1單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×10⁵/mL，接種于培養(yǎng)板，每孔2ml，次日換液，設(shè)對(duì)照組及25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL加藥組，培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。

隨后取出蓋玻片，用PBS洗3次，95％乙醇固定30min，蘇木素染染色5～10min，自來水浸洗，伊紅染色0.5～1min，經(jīng)梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

倒置顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)飽滿，呈上皮樣生長(zhǎng)，邊界清楚(如圖3A所示)。如圖3B和C所示，HDPC-12作用SPC-A1細(xì)胞24h后，細(xì)胞收縮變圓，體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞貼壁能力下降，部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中，并且，如圖3D所示，當(dāng)藥物濃度為100μg/mL時(shí)，細(xì)胞失去了正常形態(tài)，部分細(xì)胞破裂，培養(yǎng)液中可見明顯的細(xì)胞碎片及顆粒物，部分細(xì)胞壞死。由上可見，HDPC-12對(duì)SPC-A1細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，并且呈一定的濃度依賴性。

HE染色結(jié)果如圖4所示，由圖4A可見，對(duì)照組SPC-A1細(xì)胞呈上皮樣，核仁數(shù)目多。藥物作用后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則：由圖4B可見，當(dāng)HDPC-12濃度為25μg/mL時(shí)，胞質(zhì)溶解，出現(xiàn)較多空泡，核仁數(shù)目減少；由圖4C可見，當(dāng)藥物濃度為50μg/mL時(shí)，細(xì)胞體積明顯縮小，出現(xiàn)胞芽，核固縮，部分細(xì)胞核消失；由圖4D可見，當(dāng)藥物濃度為100μg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)各異，大部分細(xì)胞核溶解、消失，存在的細(xì)胞核也進(jìn)一 步固縮，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化。

3.2AO/EB染色

6孔培養(yǎng)板內(nèi)放入經(jīng)處理過的蓋玻片(經(jīng)賴氨酸浸泡)，取SPC-A-1單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×10⁵/mL，接種于培養(yǎng)板，每孔2ml，次日換液，設(shè)對(duì)照組及25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL加藥組，培養(yǎng)24h。

取AO和EB各1mg分別溶解于10mL pH7.2的PBS中，搖勻混合，用前配制，遮光保存。取上述經(jīng)24h培養(yǎng)的蓋玻片，觀察前滴加40μL PBS和10μLAO/EB混合液于載玻片上，將有細(xì)胞一面的蓋玻片朝下，熒光顯微鏡觀察、拍照。

AO/EB染色結(jié)果如圖5所示，由圖5A可見，對(duì)照組無明顯凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，胞核呈現(xiàn)綠色熒光。用藥后細(xì)胞均不同程度出現(xiàn)形態(tài)變化：由圖5B可見，25μg/mL組細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡的現(xiàn)象，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，核呈黃綠色熒光，核固縮呈新月形；由圖5C可見，50μg/mL組細(xì)胞核呈桔黃色熒光，核固縮；由圖5D可見，當(dāng)藥物濃度為100μg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)多樣性，體積明顯縮小，部分細(xì)胞核消失，核成桔紅色熒光，表示細(xì)胞已處于晚期凋亡狀態(tài)；部分細(xì)胞核呈均一紅色，表示細(xì)胞已壞死。

3.3透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

6孔培養(yǎng)板內(nèi)放入經(jīng)處理過的蓋玻片(經(jīng)賴氨酸浸泡)，取SPC-A-1單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×10⁵/mL，接種于培養(yǎng)板，每孔2ml，次日換液，設(shè)對(duì)照組及25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL加藥組。

培養(yǎng)48h后后經(jīng)消化、離心，加2.5％的戊二醛前固定，PBS洗2次后，1％鋨酸固定1h，PBS洗2次；乙醇梯度脫水，丙酮+環(huán)氧樹脂618滲透包埋，超薄切片約70nm厚，醋酸鈾、硝酸銀雙重染色，透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)并拍照。

結(jié)果如圖6所示，由圖6A可見，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48h后可見細(xì)胞表面有較多微絨毛.核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯。由圖6B、C及D可見，應(yīng)用HDPC-12后的SPC-A-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，可見細(xì)胞表面的微絨毛明顯減少，染色質(zhì)電子密度增高并濃縮聚集至核膜邊緣，部分細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象，出現(xiàn)凋亡小體，為細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。

實(shí)施例4：流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞密度約為1×10⁵的SPC-A-1細(xì)胞接種在25mL的培養(yǎng)瓶中,常規(guī)培養(yǎng)24h后加入分別含25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的HDPC-12的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。

繼續(xù)培養(yǎng)24h后，0.25％胰蛋白酶消化，預(yù)冷的PBS懸浮細(xì)胞，1000r/min離心5min。去上清，加入1×Annexin V結(jié)合液400μL吹打混勻，然后加入5μL Annexin V-FITC染 液，混勻后避光孵育15min后，再加入10μL的PI，室溫下在暗室靜置5min后過200目篩子，置于流式細(xì)胞儀(美國(guó)MILLIPORE公司)進(jìn)行檢測(cè)，其中Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)于上海貝博生物。

結(jié)果如圖7所示，以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分成4個(gè)區(qū)：左下象限(LL)，代表正常細(xì)胞；左上象限(μL)Annexin V-FITC^-PI⁺，代表機(jī)械損傷細(xì)胞；右下象限(LR)Annexin V-FITC⁺/PI^-，為早期凋亡細(xì)胞；右上象限(μR)Annexin V-FITC⁺/PI⁺凋亡晚期或壞死細(xì)胞。從圖中可見，對(duì)照組細(xì)胞基本分布在LL區(qū)域，以不同濃度的HDPC-12作用后，早期凋亡細(xì)胞明顯增多，當(dāng)HDPC-12濃度達(dá)到100μg/mL時(shí)，早期凋亡率達(dá)到14.86％，晚期凋亡細(xì)胞達(dá)14.47％。

實(shí)施例5：流式細(xì)胞儀分析線粒體膜電位變化

細(xì)胞濃度約為1×10⁵的SPC-A-1細(xì)胞接種在25mL的培養(yǎng)瓶中,常規(guī)培養(yǎng)24h后分別加入含25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的HDPC-12的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。培養(yǎng)24h后，0.25％胰酶消化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，再用3mL PBS洗滌細(xì)胞兩次(離心1000rpm，5min1000r/min離心5min)，收集細(xì)胞。取500μL 1×Incubation Buffer，加1μL的JC-1混合均勻，吸取500μL的JC-1工作液將細(xì)胞懸浮，放置于37℃、5％CO₂條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20min。離心(1500rpm，5min)并收集細(xì)胞，用1×IncubationBuffer懸浮細(xì)胞，重復(fù)兩次，最后將用1×Incubation Buffer懸浮均勻的細(xì)胞過200目篩子，置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，其中線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展有限公司。

細(xì)胞內(nèi)線粒體對(duì)JC-1染料的攝取依賴于線粒體的膜電位，正常情況下的SPC-A-1細(xì)胞線粒體的膜電位比較高，呈現(xiàn)出紅色熒光，當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，線粒體的膜電位出現(xiàn)下降，出現(xiàn)由紅色熒光向綠色熒光的轉(zhuǎn)變。如圖8所示，圖8中右上象限表示為正常線粒體膜電位所占細(xì)胞的百分率(即JC-1聚集在線粒體膜上)，右下象限則為線粒體膜電位降低細(xì)胞的百分率(即JC-1釋放為單體形式存在)。結(jié)果如圖8所示，當(dāng)HDPC-12作用SPC-A-1細(xì)胞24h后，線粒體膜電位開始下降，當(dāng)HDPC-12作用濃度分別為25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL時(shí)，其膜電位降低細(xì)胞所占的百分率分別為2.68％、7.42％和21.50％，表明隨藥物濃度的增加，線粒體膜電位也逐漸降低。

實(shí)施例6：Western blotting

藥物濃度及分組設(shè)置同3.1，加入RIPA(250μL/50mm²)+PMSF(10μL/mL)后反復(fù)吹打，冰上細(xì)胞裂解30min。收集細(xì)胞裂解液，12000r/min離心10min，取上清液。按照測(cè)定的蛋白含量取等體積的蛋白提取液，與5×蛋白上樣緩沖液按1:4的比例混合，沸水浴5min后，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

采用SDS-PAGE法，按照實(shí)驗(yàn)需要先后配置分離膠和濃縮膠。取蛋白樣品各25μL經(jīng)上樣緩沖液處理后上樣，電壓60v電泳25min后轉(zhuǎn)換電壓100v，電泳90min；在轉(zhuǎn) 膜溶液中將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含20％Tween-20的TBST溶液漂洗1次后，將PVDF膜至于5％脫脂奶粉中4℃封閉2h；TBST 10mL溶液洗膜2次，TBS 10mL溶液洗膜1次，將膜置于1％BSA溶液稀釋后的一抗(稀釋比例參照使用說明書)的雜交袋，4℃孵育過夜；洗膜后加入1％BSA的溶液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋比例參照說明書)，4℃搖床孵育2h后，洗膜后ECL顯影，應(yīng)用Alpha化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)Alpha公司)進(jìn)行掃描并記錄光密度強(qiáng)度。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照校正并做相對(duì)量分析，數(shù)值以兩者的光密度值積分比值表示。

SPC-A-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的CHIPC作用24h后，Bcl-2、Bax、pro-caspase9、caspase9和caspase 3的蛋白電泳條帶結(jié)果如圖9所示，經(jīng)Aphla化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析后Bax、Bcl-2以及caspase9蛋白的水平表達(dá)與β-actin比值變化示意圖分別如圖10、圖11及圖12所示。Western blotting結(jié)果顯示，25μg/mL組細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著增加，pro-caspase9、caspase 9、caspase 3水平顯著上調(diào)，結(jié)果表明一定濃度的HDPC-12對(duì)pro-caspase9、caspase 9、caspase 3、Bax的蛋白水平均具有明顯的上調(diào)作用，對(duì)Bcl-2蛋白水平具有明顯的下調(diào)作用。

本實(shí)施例使用的Bcl-2、Bax、TNF-α、Caspase-9、Caspase-3抗體均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。