本發(fā)明涉及臨床分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種PKD1基因的STR位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：常染色體顯性遺傳性多囊腎病(Autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳病之一,發(fā)病率約為0.1％。其主要臨床特征是雙側(cè)腎臟形成多個(gè)液性囊泡,囊腫進(jìn)行性生長,導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害,至60歲時(shí)約50％患者發(fā)展為終末期腎功能衰竭,約占終末期腎功能衰竭病因的10％。多囊腎病患者除腎臟改變外,還可累及全身多個(gè)器官,如肝、胰、脾囊腫、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、高血壓等。另有學(xué)者認(rèn)為與胰腺癌發(fā)生有關(guān)。ADPKD屬延遲顯性遺傳,患者一般在40歲左右才出現(xiàn)臨床癥狀,此時(shí)多已將致病基因傳給下一代。由于ADPKD目前尚無有效治療方法,因此及時(shí)對(duì)ADPKD家系中有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的成員進(jìn)行癥狀前基因診斷,尤其是對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒或胚胎進(jìn)行產(chǎn)前診斷及植入前遺傳學(xué)診斷,是控制其發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。ADPKD存在遺傳異質(zhì)性,目前已知引起該病的突變基因可能有3個(gè),分別為PKD1,PKD2和PKD3。其中約85％的患者由PKD1突變所致。PKD1基因長度約52kb,包含46個(gè)外顯子,轉(zhuǎn)錄出14.1kbmRNA,編碼4302個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白,其中該基因的3’端(34～46外顯子)約1/3部分為單拷貝區(qū),另2/3部分(1～33外顯子)由于存在至少3個(gè)同源序列區(qū),給基因測(cè)序及突變檢測(cè)帶來了極大困難。目前PKD1的基因檢測(cè)主要有以下幾種方法：一、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)作為第一代分子生物學(xué)標(biāo)記自問世以來已廣泛運(yùn)用于多門生物學(xué)科研究中。RFLP是根據(jù)不同品種(個(gè)體)基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測(cè)，從而可比較不同品種(個(gè)體)的DNA水平的差異(即多態(tài)性)。1985年,Reeders等通過RFLP分析方法將PKD1基因定位于16p13,并利用a-珠蛋白基因的3’HVR探針,成功地在世界上首次對(duì)一個(gè)ADPKD妊娠婦女的胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷。由于該技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量要求高，需要量大，操作復(fù)雜，現(xiàn)已逐漸被其他技術(shù)所取代。二、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)SSCP是利用組成堿基不同導(dǎo)致DNA單鏈構(gòu)象的差異,在進(jìn)行非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí),遷移速度出現(xiàn)改變的檢測(cè)方法。SSCP技術(shù)由于成本低、簡便、快捷,不受家系連鎖分析的限制,能夠?qū)蝹€(gè)患者進(jìn)行突變的檢測(cè),且對(duì)單個(gè)位點(diǎn)的變異檢出率較高。不過該技術(shù)存在5％～30％的漏檢率,且只能檢測(cè)突變的存在而不能確定突變的位置，這些缺陷嚴(yán)重限制了該技術(shù)在臨床上的推廣應(yīng)用。三、變性高效液相層析(DHPLC)DHPLC是對(duì)擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物加熱變性成單鏈狀態(tài),通過高壓液相層析分析儀檢測(cè)其中堿基含量,若發(fā)生改變則會(huì)出現(xiàn)峰值的移動(dòng),從而檢測(cè)突變是否發(fā)生。Mizoguchi等首先采用此技術(shù)從PKD1部分編碼區(qū)(第23～34外顯子)和PKD2全編碼區(qū)檢測(cè)出8個(gè)突變位點(diǎn)。之后Rossetti等應(yīng)用DHPLC技術(shù)分別對(duì)45個(gè)ADPKD患者進(jìn)行了PKD1和PKD2全編碼區(qū)突變檢測(cè)。DHPLC技術(shù)雖然快速、簡便，可判斷有否突變，但不能確定SNP的位置和類型，需用標(biāo)準(zhǔn)樣品或結(jié)合測(cè)序驗(yàn)證。只能檢測(cè)雜合突變是DHPLC的主要不足之處，在點(diǎn)突變篩查的檢測(cè)通量、靈敏度上也與其他檢測(cè)技術(shù)存在差距。四、熒光原位雜交(FISH)熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子(reportermolecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對(duì)定量分析。由于PKD1基因存在同源基因及僅有3％的大片段缺失突變,FISH對(duì)于ADPKD診斷價(jià)值有限，應(yīng)用于ADPKD的基因診斷受到極大限制。五、變性梯度凝膠電泳(DGGE)變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis)是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。具體而言，就是將特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨著電泳的進(jìn)行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當(dāng)它到達(dá)其變性要求的最低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態(tài)，這就導(dǎo)致其遷移速率變慢，由于這種變性具有序列特異性，因此DGGE能區(qū)分存在低至單個(gè)堿基差異的DNA片段，被用于ADPKD的基因突變檢測(cè)領(lǐng)域。該技術(shù)的缺陷在于檢測(cè)通量較低，無法確定突變的具體類型，限制了其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。六、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)STR在基因組中廣泛存在,是以2～6個(gè)堿基為核心單位串聯(lián)重復(fù)而成的一類序列,又稱為微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA)。由于核心序列重復(fù)數(shù)目的變化,而在群體中呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性,但在同一家系內(nèi)具有高度的遺傳保守性,以孟德爾方式遺傳。因此利用微衛(wèi)星DNA多態(tài)性連鎖分析,可在同一家系中篩選出ADPKD患者。目前用于ADPKD連鎖分析的STR基本為(CA)n重復(fù),與PKD1連鎖的微衛(wèi)星DNA有SM6,KG8,Cw2和CW4等。由于ADPKD基因的復(fù)雜性和突變位點(diǎn)的難確定性,連鎖分析仍為目前ADPKD基因診斷的主要手段。但是目前所用的這些STR基因座中并非都是最優(yōu)選擇，有些STR基因座難于進(jìn)行基因型判定。例如:二核苷酸重復(fù)PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)滑行,檢測(cè)不穩(wěn)定,容易發(fā)生錯(cuò)判；SW6基因座的擴(kuò)增片段容易產(chǎn)生雜帶，并與其他基因座不同的擴(kuò)增片段由于構(gòu)象的影響可能會(huì)導(dǎo)致它們具有相同的電泳遷移率，變得難以區(qū)分；CW2離PKD1基因較遠(yuǎn)，可能會(huì)由于基因重組而導(dǎo)致誤診；實(shí)際檢測(cè)中可能會(huì)出現(xiàn)一些STR基因座擴(kuò)增失敗的情況影響檢測(cè)結(jié)果的判讀，等等。為了解決這些問題，我們需要篩選出更多離PKD1基因距離近，遺傳距離小，重組率低，雜合度高的有信息的STR位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記來進(jìn)行常染色體顯性遺傳性多囊腎病的基因檢測(cè)，以提高檢測(cè)效率，為該疾病的臨床診斷和胚胎植入前診斷提供依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決目前PKD1基因的STR位點(diǎn)由于存在離PKD1基因距離較遠(yuǎn)、重組率高、雜合度低等缺點(diǎn)致使檢測(cè)效率不高的技術(shù)問題，提供具有更高分辨率的PKD1基因的STR新位點(diǎn)，該STR新位點(diǎn)用于PKD1基因的連鎖遺傳分析，能有效提高分型識(shí)別效率和準(zhǔn)確性。此外，還需要提供一種用于PKD1基因連鎖遺傳分析的檢測(cè)試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種PKD1基因的STR位點(diǎn)，該STR位點(diǎn)具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核酸序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述PKD1基因的STR位點(diǎn)的應(yīng)用，用于常染色體顯性遺傳性多囊腎病的胚胎植入前診斷或產(chǎn)前診斷。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種診斷常染色體顯性遺傳性多囊腎病的檢測(cè)試劑盒，包含分別針對(duì)SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示STR位點(diǎn)的特異性引物對(duì)。優(yōu)選的，還包含針對(duì)SEQIDNO.3～SEQIDNO.10中任意一個(gè)以上STR位點(diǎn)的特異性引物對(duì)。更優(yōu)選的，還包含分別針對(duì)SEQIDNO.3～SEQIDNO.9所示STR位點(diǎn)的特異性引物對(duì)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于PKD1基因STR位點(diǎn)連鎖遺傳分析的復(fù)合擴(kuò)增系 統(tǒng)，包含：分別針對(duì)SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中任意三個(gè)以上STR位點(diǎn)的特異性引物對(duì)。本發(fā)明SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的兩個(gè)新STR位點(diǎn)，其所在區(qū)域不存在CNV(拷貝數(shù)變異)情況，且該兩個(gè)位點(diǎn)兼容性好，有利于與其它STR基因座位點(diǎn)組成高效的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下：1.新篩出的STR位點(diǎn)是利用現(xiàn)有最新的人類全基因組序列信息進(jìn)行篩選獲得，排除兼容性差、存在CNV或位于高度重復(fù)序列區(qū)等影響因素。2.篩選出的2個(gè)有關(guān)PKD1基因STR新位點(diǎn)，豐富了產(chǎn)前診斷或胚胎植入前診斷等相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域STR基因座的選擇范圍。3.提供了分辨率更高的STR新位點(diǎn)，該STR新位點(diǎn)與已知的STR位點(diǎn)組成同一個(gè)體系檢測(cè)相關(guān)遺傳疾病，能更加高效、準(zhǔn)確地得到分型數(shù)據(jù)。附圖說明下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例2多個(gè)STR位點(diǎn)的原始峰圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明篩選出PKD1基因中具有高分辨度的新STR基因座位點(diǎn)，該新STR位點(diǎn)結(jié)合一些現(xiàn)有STR基因座應(yīng)用于常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)的分子研究和分子診斷領(lǐng)域，為該疾病的臨床診斷和胚胎植入前診斷提供依據(jù)。實(shí)施例1篩選出2個(gè)PKD1基因的STR新位點(diǎn)1.STR的預(yù)測(cè)(1)使用生物公共數(shù)據(jù)庫查閱整理STR信息，(數(shù)據(jù)庫參照截止2011年11月之前NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/數(shù)據(jù)庫)，獲得NCBI有報(bào)道STR信息；(2)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)STR，得到重復(fù)單元2bp重復(fù)次數(shù)10次以上的基因座若干個(gè)；(3)比較這些STR位點(diǎn)在NCBI數(shù)據(jù)庫中的三個(gè)基因組(refercese、HuRef、Celera)中的重復(fù)次數(shù)，獲得重復(fù)數(shù)差異大的STR位點(diǎn)信息；(4)結(jié)合文獻(xiàn)、生物數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，根據(jù)實(shí)際STR的序列特征，篩選出2個(gè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的STR，并將其命名為T16S0002、T16S0004。T16S0002的STR位點(diǎn)序列如SEQIDNO.1所示，T16S0004的STR位點(diǎn)序列如SEQIDNO.2所示。2.STR的檢測(cè)利用熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物長度多態(tài)分析方法檢測(cè)所有預(yù)測(cè)的STR位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)采用primer3軟件，設(shè)計(jì)時(shí)盡量避開目前數(shù)據(jù)庫中已知的SNP多態(tài)位點(diǎn)和高度重復(fù)序列區(qū)域等特 殊序列。PCR產(chǎn)物稀釋后取少量與內(nèi)標(biāo)標(biāo)記混勻后直接上ABI3130xl進(jìn)行毛細(xì)管電泳，數(shù)據(jù)文件用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)來分析；獲得所篩選到的新的STR基因座的多態(tài)信息量(PIC)等信息。實(shí)施例2STR新位點(diǎn)樣本驗(yàn)證將新篩選出來的2個(gè)STR基因座(T16S0002，T16S0004)與7個(gè)常用基因座位點(diǎn)D16S521(SEQIDNO.3)，D16S3024(SEQIDNO.4)，D16S3395(SEQIDNO.5)，D16S291(SEQIDNO.6)，D16S664(SEQIDNO.7)，D16S418(SEQIDNO.8)，Amelogenin(AmeloX：SEQIDNO.9；AmeloY：SEQIDNO.10)組合，采用兩步法多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測(cè)2個(gè)個(gè)體樣本。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：(1)DNA樣本準(zhǔn)備在醫(yī)院中對(duì)2個(gè)選取的樣本個(gè)體采集血液；通過DNA提取試劑盒抽提得到DNA樣本并各取1μl1％agarose電泳對(duì)其樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計(jì)，然后根據(jù)估計(jì)的濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10ng/μl。(2)PCR反應(yīng)各取1ul樣本，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為10微升(1μl10×PCR緩沖液(Qiagen公司)，0.2μl25mmol氯化鎂、1μl檢測(cè)多個(gè)STR基因座的混合引物(引物序列見下表1)、0.8μl2.5mmoldNTP、0.04μlHotStarplusTaq酶(Qiagen公司)，5.96μlddH2O。PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：95℃10分鐘；7個(gè)循環(huán)的Touchdown程序(94℃20秒，65℃-1℃/循環(huán)40秒和72℃2min),28個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94℃20秒，65℃30秒和72℃2min)，在72℃延伸2分鐘，在60℃延伸60分鐘，4℃保存。(3)加熒光反應(yīng)各取1ul樣本，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為10微升(1μl10×PCR緩沖液(Qiagen公司)，0.2μl25mmol氯化鎂、1μl檢測(cè)多個(gè)STR基因座的混合引物、0.8μl2.5mmoldNTP、0.04μlHotStarplusTaq酶(Qiagen公司)，5.96μlddH2O。PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：95℃5分鐘；30個(gè)循環(huán)(94℃20秒，56℃40秒和72℃2min)，在72℃延伸2分鐘，4℃保存。表1PKD1基因9個(gè)基因座引物序列STR基因座引物序列熒光標(biāo)記D16S664F:5’-CCATGGTGCCCGGTCATAAAT-3’(SEQIDNO.11)FAMR:5’-TTGCCATCCGATACTCATCGTTA-3’(SEQIDNO.12)AmeloF:5’-GCCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3’(SEQIDNO.13)FAMR:5’-GTTTCTTGAGGCCAACCATCAGAGCTTA-3’(SEQIDNO.14)D16S291F:5’-GTTAGAGGCACTGAGGGGAGCA-3’(SEQIDNO.15)FAMR:5’-CTCCAAGTGTGGCCTGACAATG-3’(SEQIDNO.16)D16S3395F:5-CCAGCCAGAAGCCATAGTTTCTAAC-3’(SEQIDNO.17)VICR:5-GCCTCAAATCTTCCCTGGCAGT-3’(SEQIDNO.18)D16S521F:5-ATTTCTGCAAAGGCTAAAGGAAGGT-3’(SEQIDNO.19)VICR:5-TTTATTTGCACCCTGGAGAACCTCT-3’(SEQIDNO.20)D16S418F:5-GCTGGACAGACAGCCAGGAAAT-3’(SEQIDNO.21)NEDR:5-CACTGCGTCCATCCCTTAAGTACA-3’(SEQIDNO.22)T16S0002R:5-CAAGCCAGCACCGAGTACAGTG—3’(SEQIDNO.23)NEDR:5-CCCGACGCATTTCCAAAATATG-3’(SEQIDNO.24)D16S3024R:5-GGCTCCTGCAAGGGAGAATCTA-3’(SEQIDNO.25)PETR:5-CCTTGATGCTGACACAGCCTTG-3’(SEQIDNO.26)T16S0004R:5-TCTGTAATGGGCCCCAGATTGT-3’(SEQIDNO.27)PETR:5-CATCACGCCTGGCCTAAAACAT-3’(SEQIDNO.28)PCR反應(yīng)完成后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，取出1ul加入8.9ulHIDI和0.1ulLIZ,混勻后95℃5min，毛細(xì)管電泳上樣；因STR位點(diǎn)檢測(cè)引物帶有熒光，通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)不同顏色熒光及不同大小的擴(kuò)增片斷，用熒光檢測(cè)系統(tǒng)分析結(jié)果得出STR分型信息(如表格2所示)。結(jié)果如圖1和表2-4所示。表2是PKD1基因STR位點(diǎn)分布情況。表2PKD1基因STR位點(diǎn)分布情況圖1是兩個(gè)樣本多個(gè)STR位點(diǎn)檢測(cè)的原始峰圖，分別為樣本1(上圖)和樣本2(下圖)。圖1中，“A”為FAM峰圖，“B”為VIC峰圖，“C”為NED峰圖，“D”為PET峰圖。圖1中各STR位點(diǎn)信息說明見下表3。表3PKD1基因各STR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段大小由圖1得到的STR檢測(cè)結(jié)果見下表4。表49個(gè)STR基因座的檢測(cè)結(jié)果由圖1和表4可知，新篩選得到的2個(gè)STR位點(diǎn)在結(jié)果上表現(xiàn)出了較高的區(qū)分度，應(yīng)用到胚胎植入前診斷、STR分型、親權(quán)鑒定、個(gè)體識(shí)別等生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中，能有效提高分型識(shí)別效率和準(zhǔn)確性，并且這一體系具有很高的個(gè)體識(shí)別率，對(duì)PKD1基因的連鎖遺傳分析有很強(qiáng)的實(shí)用性。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3