本發(fā)明涉及家蠶蛻皮激素受體(ecdysterod receptor，EcR)及超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)蛋白復(fù)合物的表達(dá)及純化方法。

背景技術(shù)：

昆蟲由幼蟲發(fā)育為成蟲的形態(tài)變化過程稱為變態(tài)(Metamorphosis)，蠶屬于完全變態(tài)的昆蟲，在蠶的發(fā)育過程中，要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲(蛾)四個發(fā)育階段才能完成生命周期。在蠶的生長發(fā)育過程中，要經(jīng)過多次蛻皮才能成熟。蠶的蛻皮過程包括：胚胎孵化蛻皮、幼蟲各年齡期間的蛻皮以及從幼蟲到蛹和蛹到成蟲的蛻皮。蠶的蛻皮和變態(tài)發(fā)育主要受體內(nèi)蛻皮激素的控制，20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)是由包括昆蟲類和甲殼類在內(nèi)的節(jié)肢動物分泌的一種甾體類蛻皮激素，在蛻皮和蛻變的發(fā)展過渡階段以及細(xì)胞分化和生殖的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

20E的作用靶標(biāo)由蛻皮激素接受子(ecdysteroid receptor，EcR)和過剩氣門蛋白(ultraspiracle，USP)組成，兩者都是蛻皮激素受體超家族的成員，前者包括5個特征結(jié)構(gòu)域，分別為A/B域(轉(zhuǎn)錄激活域transactivation domain)、C域(DNA結(jié)合域DNA-binding domain，DBD)、D域(鉸鏈域hinge region)、E域(配體結(jié)合域ligand binding domain，LBD)和F域5部分組成，各部分都具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能。

只有EcR和USP形成異二聚體后，蛻皮激素才能結(jié)合在EcR上形成蛻皮激素-EcR/USP三聚體，然后結(jié)合在DNA上，誘導(dǎo)產(chǎn)生蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，由蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子再調(diào)控蛻皮級聯(lián)反應(yīng)的相關(guān)基因族的表達(dá)。EcR與USP的異源二聚體復(fù)合物對配體和DNA的高親和力有著極其重要的作用，EcR的空間結(jié)構(gòu)具有很強的柔韌性和適應(yīng)性，USP與EcR結(jié)合后起到穩(wěn)定EcR配體結(jié)合域(LBD)空間結(jié)構(gòu)的作用。

目前已有20余種昆蟲的EcR、USP被同時或單獨克隆測序，并且大多已在細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞系中實現(xiàn)了離體表達(dá)和提取純化。研究表明在細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)的EcR和USP蛋白，無論其粗提液，還是純化蛋白，均可用于活性篩選及三維結(jié)構(gòu)研究。目前家蠶EcR基因(BmEcR，GeneBank登錄號：692756)和USP基因(BmUSP，GeneBank登錄號：U06073)已經(jīng)被克隆和測序。但是，目前還沒有家蠶EcR/USP蛋白復(fù)合物的表達(dá)及純化方法。

因此有必要建立一種家蠶EcR/USP蛋白復(fù)合物表達(dá)及純化方法，從而可以利用該方 法指導(dǎo)進(jìn)一步的活性篩選及三維結(jié)構(gòu)研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種家蠶蛻皮激素受體EcR/USP蛋白復(fù)合物的表達(dá)及純化方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種蠶類蛻皮激素受體EcR/USP蛋白復(fù)合物的表達(dá)及純化方法，包括以下步驟：

(a)構(gòu)建USP-pET-28a(+)重組載體和EcR-pET21b-MDX12重組載體；

(b)將所述USP-pET-28a(+)重組載體和EcR-pET21b-MDX12重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌，培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)重組目的蛋白復(fù)合物；

(c)將所得的重組目的蛋白復(fù)合物經(jīng)鎳離子親和層析及分子篩層析進(jìn)行純化。

本發(fā)明通過構(gòu)建重組表達(dá)載體EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，將兩個載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)兩種蛋白的共表達(dá)，從而得到大量的重組目的蛋白復(fù)合物，然后經(jīng)鎳離子親和層析柱和分子篩分離純化可以得到純度較高的目的蛋白，為以后研究其三維功能和生物學(xué)功能奠定了及其重要的基礎(chǔ)，本發(fā)明還解決了蠶蛻皮激素受體蛋白可溶性差、難純化的問題。

較佳地，步驟(a)中，構(gòu)建USP-pET-28a(+)重組載體包括以下步驟：

(a-1)設(shè)計上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ酶切位點、和

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切位點；

(a-2)以蠶類USP基因為模板，用所設(shè)計的引物F和R擴增特異性片段，膠回收產(chǎn)物USP基因，所述USP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(a-3)將PCR割膠回收產(chǎn)物和pET-28a(+)載體利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ同時進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化E.col TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒USP-pET-28a(+)。

較佳地，步驟(a)中，構(gòu)建EcR-pET21b-MDX12重組載體包括以下步驟：

(a-1’)設(shè)計上游引物F-1：

5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶KpnI酶切位點，斜體部分為TEV酶堿基序列、和

下游引物R-1：5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'，其中下劃線部分為限制性內(nèi)切 酶XhoI酶切位點；

(a-2’)以蠶類EcR基因為模板，所述蠶類EcR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用引物F-1和R-1添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，構(gòu)建基因KpnI-TEV-EcR-XhoI；

(a-3’)設(shè)計無縫(infusion)克隆上游引物F-2：

5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'，其中下劃線部分為與線性載體互補序列、和

下游無縫克隆引物R-2：

5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'，其中下劃線部分為與線性載體互補序列；

(a-4’)利用通過引物F-1、R-1進(jìn)行PCR擴增的產(chǎn)物為模板擴增目的片段，同時用KpnI和XhoI兩種酶線性化載體pET21b-MDX12，將目的DNA片段和線性化載體按摩爾比為3:1的比例進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.col TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR；

(a-5’)將PCR、雙酶切鑒定正確且測序正確的菌落搖菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒EcR-pET21b-MDX12。

較佳地，在步驟(a-3)和/或步驟(a-5’)中，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒。

較佳地，步驟(b)中，將所述USP-pET-28a(+)重組載體和EcR-pET21b-MDX12重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌包括以下步驟：

將構(gòu)建好的且測序正確的表達(dá)載體USP-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化宿主菌，得到第一重組菌，并制備第一重組菌的感受態(tài)；

用EcR-pET21b-MDX12轉(zhuǎn)化第一重組菌的感受態(tài)，得到第二重組菌。

較佳地，所述宿主菌為E.coli BL21(DE3)、plysS、或Rossetta(DE3)，優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。

較佳地，通過CaCl₂法制備第一重組菌的感受態(tài)。

較佳地，步驟(b)中，培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)重組目的蛋白復(fù)合物包括以下步驟：

在含50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入終濃度為3mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，16℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜，得到重組蛋白。

較佳地，步驟(b)中，重組蛋白EcR/USP蛋白復(fù)合物的表達(dá)為共表達(dá)。

較佳地，步驟(c)中，純化包括以下步驟：

(c-1)將收集的菌體超聲破碎后，將得到的可溶性重組目的蛋白復(fù)合物經(jīng)離心后，與鎳離子親和層析柱結(jié)合，用不同濃度的咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫；

(c-2)經(jīng)鎳柱純化后的重組蛋白復(fù)合物超濾濃縮，過分子篩進(jìn)行分離純化。

較佳地，步驟(c-1)中，咪唑緩沖液的濃度依次為20mM、50mM、100mM、250mM。

較佳地，步驟(c-2)中，分子篩為Superdex^TM200 16/60。

較佳地，在將重組目的蛋白復(fù)合物純化后，還包括蛋白活性測定步驟。

較佳地，所述蛋白活性測定步驟包括：用經(jīng)0.22μM纖維素膜過濾過的與樣品一致的緩沖液清洗樣品池等，20E溶液20次注射到ITC池中，滴定EcR/USP蛋白復(fù)合體溶液，收集數(shù)據(jù)并矯正原始數(shù)據(jù)，矯正后的數(shù)據(jù)非線性回歸得出熱力學(xué)參數(shù)。

較佳地，所述滴定是用1mM的20E滴定100μM的EcR/USP蛋白復(fù)合體。

附圖說明

圖1USP PCR擴增結(jié)果的圖；

圖2USP PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切圖；

圖3USP-pET-28a(+)菌落PCR的圖；

圖4USP-pET-28a(+)酶切鑒定圖；

圖5EcR第一次PCR擴增結(jié)果的圖；

圖6EcR第二次PCR擴增結(jié)果的圖；

圖7pET21b-MDX12雙酶切結(jié)果的圖；

圖8EcR-pET21b-MDX12菌落PCR的圖；

圖9EcR-pET21b-MDX12酶切鑒定圖；

圖10表達(dá)測試圖；

圖11鎳離子親和層析圖；

圖12鎳離子親和層析結(jié)果SDS-PAGE圖；

圖13S200分子篩層析圖；

圖14S200分子篩結(jié)果SDS-PAGE圖；

圖15ITC圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和下述實施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，附圖及下述實施方式僅 用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明通過構(gòu)建重組表達(dá)載體EcR-pET21b-MDX12、USP-pET-28a(+)，將兩個載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)兩種蛋白的共表達(dá)，從而得到大量的重組目的蛋白復(fù)合物，然后經(jīng)鎳離子親和層析柱和分子篩分離純化可以得到純度較高的目的蛋白。

USP-pET-28a(+)重組載體的構(gòu)建可以采用雙酶切法，具體地，可以包括以下步驟：

(1)USP密碼子優(yōu)化及基因合成；

(2)設(shè)計上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ酶切位點)

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切位點)；

(3)以蠶類USP基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)為模板，用所設(shè)計的引物F和R擴增特異性片段，擴增的具體程序可為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，擴增完成后膠回收產(chǎn)物USP基因；

(4)將USP基因和pET-28a(+)載體利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ同時進(jìn)行雙酶切，將酶切回收的產(chǎn)物用T4連接酶連接過夜并轉(zhuǎn)化E.col TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR；

(5)將PCR鑒定和雙酶切鑒定正確且測序正確的菌落搖菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒USP-pET-28a(+)，提取方法包括但不限于堿裂解法。

EcR-pET21b-MDX12重組載體的構(gòu)建可以采用無縫克隆法，具體地，可以包括以下步驟：

(1)EcR密碼子優(yōu)化及基因合成；

(2)設(shè)計上游引物F-1：

5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶KpnI酶切位點，斜體部分為TEV酶堿基序列)

下游引物R-1：

5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶XhoI酶切位點)；

(3)以蠶EcR基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)為模板，利用引物添加5’KpnI、TEV、3’TAA和3’XhoI，構(gòu)建基因KpnI-TEV-ECR-XhoI；

(4)設(shè)計無縫克隆上游引物F-2：

5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'(下劃線部分為與線性載體互 補序列)

無縫克隆下游引物R-2：

5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'(下劃線部分為與線性載體互補序列)；

(5)利用引物F-1、R-1的PCR產(chǎn)物為模板擴增目的片段，同時用KpnI和XhoI兩種酶線性化載體pET21b-MDX12，將目的DNA片段和線性化載體以3:1的比例進(jìn)行重組反應(yīng)(例如將反應(yīng)體系37℃反應(yīng)15min、50℃反應(yīng)15min)，完成后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.col TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR；

(6)將PCR鑒定且測序正確的菌落搖菌培養(yǎng)后用堿裂解法提取重組質(zhì)粒EcR-pET21b-MDX12。

將所構(gòu)建的EcR-pET21b-MDX12重組載體和USP-pET-28a(+)共轉(zhuǎn)化表達(dá)菌。例如，可以先將USP-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化宿主菌，得到第一重組菌并將其制備成感受態(tài)后，再用EcR-pET21b-MDX12轉(zhuǎn)化第一重組菌感受態(tài)，得到第二重組菌；也可以先用EcR-pET21b-MDX12轉(zhuǎn)化，再用USP-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化。感受態(tài)的制備可以采用CaCl₂法。

宿主菌可為E.coli BL21(DE3)、plysS、或Rossetta(DE3)。另外，可以通過表達(dá)測試來選擇更加合適的宿主菌及培養(yǎng)條件。例如，可以通過如下步驟來選擇：

將構(gòu)建好的且測序正確的表達(dá)載體USP-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)等宿主菌，得到重組菌，并用CaCl₂法分別制備USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受態(tài)，然后用EcR-pET21b-MDX12分別轉(zhuǎn)化USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受態(tài)，得到重組菌，挑選單菌落，在含50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml的卡那霉素的5ml LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入終濃度為3mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜，并設(shè)置誘導(dǎo)前對照組，即對照組不加IPTG誘導(dǎo)；

各取2ml誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液，離心棄上清，菌體分別用400μl PBS混懸，取50μl誘導(dǎo)前溶液作為誘導(dǎo)前對照樣品，取50μl誘導(dǎo)后溶液作為誘導(dǎo)后全菌樣品。誘導(dǎo)后樣品超聲破碎儀冰浴超聲破碎，超6次，每次1s，間隔5s，功率400W，破碎后菌液將破碎后的菌液12000rpm，4℃，離心5min，分別上清和沉淀制備蛋白質(zhì)樣品，SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。最終選擇BL21(DE3)為宿主菌進(jìn)行擴大培養(yǎng)及表達(dá)純化。

對第二重組菌進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)重組目的蛋白。在一個示例中，包括以下步驟：取100μl甘油菌，轉(zhuǎn)接至100ml含抗生素的LB中，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。第二天，取 20ml種子液加入2L含抗生素LB中(1％接種)，37℃180rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀0.6后，0.3mM IPTG16℃誘導(dǎo)過夜。收菌，5000rpm×10min離心，棄上清，收集菌體。

將收集到的菌體進(jìn)行分離純化，以得到高純度的重組目的蛋白。優(yōu)選地，經(jīng)鎳離子親和層析柱和分子篩進(jìn)行純化。在一個示例中，分離純化包括以下步驟：

(1)將收集的菌體超聲破碎后，將得到的可溶性重組目的蛋白復(fù)合物離心。例如可以將收集的菌體用10倍體積的裂解液(50mM Tris-HCl，PH8.0，300mM NaCl，10％甘油(Glycerol))重懸，超聲破碎儀冰浴超聲破碎30min，超3s，間隔6s，功率400W。4℃12000rpm離心30min；

(2)離心后的上清與鎳離子親和層析柱結(jié)合，然后用不同濃度的含有咪唑的洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl，PH8.0，300mM NaCl，10％Glycerol，250mM咪唑(Imidazole))進(jìn)行梯度洗脫。經(jīng)純化條件的摸索，用濃度為20mM、50mM、100mM的咪唑緩沖液可以洗去非特異性結(jié)合在柱子上的雜蛋白，用250mM的咪唑緩沖液可以洗脫下所有的重組目的蛋白且純度很高，洗脫樣品跑SDS-PAGE凝膠電泳顯示重組目的蛋白復(fù)合物在含250mM咪唑的洗脫緩沖液中被洗脫下來。因此，可以使用20mM、50mM、100mM、250mM的咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；

(3)經(jīng)Ni柱純化過后的重組蛋白復(fù)合物經(jīng)超濾濃縮后，過分子篩進(jìn)行分離純化。超濾濃縮可以使用50ml的Millipore超濾濃縮管濃縮至2ml。分子篩可以選用superdex 200。具體地，可以包括以下步驟：

平衡：將superdex 200分子篩層析柱接入蛋白純化儀AKTA Explorer系統(tǒng)用洗脫緩沖液(elution buffer)(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0)平衡一個柱體積，平衡至基線平衡；

上樣：用2ml注射器將蛋白質(zhì)樣品注入2ml上樣環(huán)中；

洗脫：用洗脫緩沖液(elution buffer)(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0)進(jìn)行洗脫，流速1ml/min；

收集：按峰收集，2ml/管收集洗脫下來的蛋白；

收集的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

獲得EcR/USP蛋白復(fù)合物后，還可以對其進(jìn)行活性測定。例如可以采用等溫滴定量熱法(ITC)。在一個示例中，活性測定包括以下步驟：用1mM的20E滴定100μM的EcR/USP蛋白復(fù)合體(兩者buffer完全一致)，首先用0.22μM纖維素膜過濾過的透析液清洗樣品池等，20E溶液20次注射到ITC池的緩沖溶液中，滴定EcR/USP蛋白復(fù)合體溶液， 滴定的蛋白溶液體積至少40μl，被滴定的溶液體積至少200μl。每個注射峰下方的區(qū)域與注射所釋放的總熱量相等。當(dāng)這種綜合的熱量相對添加到池中的配體摩爾比作圖時，就獲得了相互作用的完整結(jié)合等溫線注射所釋放的總熱量相等。當(dāng)這種綜合的熱量相對添加到池中的配體摩爾比作圖時，就獲得了相互作用的完整結(jié)合等溫線。

本發(fā)明通過構(gòu)建重組表達(dá)載體USP-pET-28a(+)、EcR-pET21b-MDX12，并通過共轉(zhuǎn)誘導(dǎo)表重組目的蛋白復(fù)合體的共表達(dá)，得到大量的重組蛋白，經(jīng)鎳離子親和層析和分子篩層析等簡易技術(shù)可以得到純度較高的重組目的蛋白，為以后研究其三維結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了及其重要的基礎(chǔ)。

下面進(jìn)一步例舉實施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1：USP-pET-28a(+)、EcR-pET21b-MDX12重組載體構(gòu)建

＜pET-28a-USP重組載體構(gòu)建＞

(1)引物設(shè)計

擴增USP基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示，引物設(shè)計如下：

上游引物F：5'CCGGAATTCATGCATCCCAGCAGCTCTGTAC 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ酶切位點)

下游引物R：5'GGGTTCGAAGGCCTTAAGTTACATGATGTTGG 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切位點)

(2)重組載體構(gòu)建

以蠶類USP為模板，用所設(shè)計的引物F和R擴增特異性片段，具體程序為：

最后膠回收得到產(chǎn)物USP基因(見圖1)；

(3)在PCR管中，加入下列組分

各組分混合均勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)；

(4)將PCR割膠回收產(chǎn)物和pET-28a(+)載體利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ(購自Takara公司)和Hind Ⅲ(購自Takara公司)同時進(jìn)行雙酶切(見圖2)，將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接過夜，并轉(zhuǎn)化E.col TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)后利用堿裂解法抽提重組質(zhì)粒，用雙酶切和PCR鑒定(如圖3、4所示)，說明克隆成功，并送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，與預(yù)期結(jié)果相同。

＜EcR-pET21b-MDX12重組載體構(gòu)建＞

(1)設(shè)計上游引物F-1：

5'GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAGAACATACCACCATTGTCG 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶KpnI酶切位點，斜體部分為TEV酶堿基序列)

下游引物R-1：

5'CTCGAGTTATAGCACCACCGGGTTG 3'(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶XhoI酶切位點)；

(2)從模板中擴增基因ECR，利用引物添加5’KpnI、TEV-tag、3’TAA和3’XhoI，PCR反應(yīng)組分同USP，具體程序如下

(3)設(shè)計無縫克隆上游引物F-2：

5'GTGCCAGGCGGTTCT GGTACCGAGAACCTGTACTTC 3'(下劃線部分為與線性載體互補序列)

下游無縫克隆引物R-2：

5'GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGTTATAGCACCACCG 3'(下劃線部分為與線性載體互補序列)；

利用引物F-1、R-1的PCR產(chǎn)物為(見圖5)為模板擴增目的片段(見圖6)

(4)同時用KpnI和XhoI兩種酶線性化載體pET21b-MDX12，將目的DNA片段和線性化載體以3:1的比例進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

將反應(yīng)體系37℃反應(yīng)15min、50℃反應(yīng)15min，完成后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.col TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)挑取長勢良好的單菌落培養(yǎng)后利用堿裂解法抽提重組質(zhì)粒，用雙酶切和PCR鑒定(如圖7、8所示)，說明克隆成功，并送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，與預(yù)期結(jié)果相同。

實施例2：重組蛋白表達(dá)測試

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒USP-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)(均由實驗室自制)宿主菌感受態(tài)中，1μl的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，熱激90s，冰浴2min，加500μl LB培養(yǎng)基(無抗)，37℃，250rpm震蕩1h，取50μl涂板(50μg/ml卡那霉素)，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜得到重組菌；

次日，CaCl₂法制備USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受態(tài)。分別挑單克隆，在含50μg/ml的卡那霉素的5ml LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm震蕩過夜；取100μl培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至100ml含抗生素的LB中，37℃250rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀至0.4；將菌液轉(zhuǎn)移至50ml EP管中，冰上放置10min；4℃，4000rpm，離心10min，倒出培養(yǎng)基；用0.1M CaCl₂-MgCl₂溶液30mL重懸細(xì)胞沉淀，冰上放置30min；4℃，4000rpm，離心10min，倒出上清液；用2ml預(yù)冷0.1MCaCl₂-15％甘油重選細(xì)胞沉淀，將其100μl管分裝至滅菌EP管中，-80℃凍存；

用重組質(zhì)粒EcR-pET21b-MDX12分別轉(zhuǎn)化USP-pET-28a(+)in E.coli BL21(DE3)、plysS、Rossetta(DE3)感受態(tài)(轉(zhuǎn)化方法同上，固體培養(yǎng)基含50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml的卡那霉素)，得到重組菌。分別挑單克隆，在含50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml的卡那霉素的5ml LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6，加入終濃度為3mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜，并設(shè)置誘導(dǎo)前對照組，即對照組不加IPTG誘導(dǎo)；

各取2ml誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液，離心棄上清，菌體分別用400μlPBS混懸，取50μl誘導(dǎo)前溶液作為誘導(dǎo)前對照樣品，取50μl誘導(dǎo)后溶液作為誘導(dǎo)后全菌樣品。誘導(dǎo)后樣品超聲破碎儀冰浴超聲破碎，超6次，每次1s，間隔5s，功率400W，破碎后菌液將破碎后的菌液12000rpm，4℃，離心5min，取上清50μl，作為上清樣品；將沉淀用400μlPBS溶解，作為沉淀樣品；各樣品分別加等體積的2×SDS Loading Buffer，加熱煮沸5min，跑SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。結(jié)果如(圖10所示)，表明利用上述方法成功表達(dá)了蠶類蛻皮激素受體EcR/USP蛋白復(fù)合物且表達(dá)量很高，且重組蛋白復(fù)合物是以可溶的形式存在于緩沖液中。最終選擇BL21(DE3)為宿主菌進(jìn)行擴大培養(yǎng)及表達(dá)純化。

實施例3重組蛋白擴大表達(dá)及純化

取100μl種子液，轉(zhuǎn)接至100ml含抗生素(終濃度為50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml的卡那霉素)的LB中，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。第二天，取20ml培養(yǎng)液加入2L含抗生素LB培養(yǎng)基中(1％接種，含終濃度為50μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml的卡那霉素)，37℃180rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6后，0.3mM IPTG16℃誘導(dǎo)過夜。收菌，4℃，5000rpm，10min離心，棄上清，收集菌體；

菌體用十倍體積的裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10％Glycerol，PH8.0)重懸，超聲破碎儀超聲破碎30min，超3s，間隔6s，功率400W。4℃12000rpm離心30min，離心后的上清與鎳離子親和層析柱結(jié)合(填料購自GE Healthcare)，用濃度為20mM、50 mM、100mM、250mM的咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分別取不同濃度的咪唑緩沖液的洗脫液配置蛋白樣品，SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖11、12所示，說明20mM、50mM、100mM的咪唑緩沖液可以洗去非特異性結(jié)合在柱子上的雜蛋白，用250mM的咪唑緩沖液可以系脫下所有的重組目的蛋白,且純度可以達(dá)到95％；

經(jīng)鎳柱純化后的重組蛋白復(fù)合物用Millipore超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，濃縮至2mL，過分子篩進(jìn)行分離純化：所用的分子篩層析柱為Superdex^TM200 16/60。具體操作步驟如下：

平衡：將Superdex^TM200分子篩層析柱接入蛋白純化儀AKTA Explorer系統(tǒng)，以elution buffer(20mM Tris-HCl 50mM NaCl 150Mm KCl 5％Glycerol pH8.0)平衡至少一個柱體積，流速設(shè)為1.2ml/min，平衡至基線水平；

上樣：用2ml的注射器將濃縮及離心去沉淀后的蛋白質(zhì)樣品注入2ml的上樣環(huán)中；

洗脫：用Elution Buffer(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0)進(jìn)行洗脫，流速1ml/min(較慢的流速有利于提高柱子分辨率)；

收集：按峰收集，2ml每管收集系脫下來的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖13、14所示，說明兩步色譜柱純化成功得到了可溶性的EcR/USP蛋白復(fù)合體，且目的蛋白復(fù)合物純度可達(dá)99％。

實施例4ITC重組蛋白復(fù)合物活性測定

該試驗完成于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞分析技術(shù)平臺，所使用ITC儀器為MicroCal ITC200，首先通過預(yù)實驗確定合適的反應(yīng)物濃度，最終確定用1mM的20E滴定100μM的EcR/USP蛋白復(fù)合體(兩者緩沖液完全一致20mM Tris-HCl，50mM NaCl，150Mm KCl，5％Glycerol，pH8.0，1％DMSO)，首先用0.22μM纖維素膜過濾過的與樣品一致的緩沖液清洗樣品池等，20E溶液20次注射到ITC池中，滴定EcR/USP蛋白復(fù)合體溶液，滴定的蛋白溶液體積至少40μl，被滴定的溶液體積至少200μl。每個注射峰下方的區(qū)域與注射所釋放的總熱量相等。收集數(shù)據(jù)并矯正原始數(shù)據(jù)，矯正后的數(shù)據(jù)非線性回歸得出熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如圖15所示，結(jié)果表明EcR/USP蛋白復(fù)合體與20E在體外結(jié)合并相互作用，說明純化得到的EcR/USP蛋白復(fù)合體具有良好的生物活性。