本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種細(xì)胞熒光檢測系統(tǒng)，具體地說，涉及一種當(dāng)細(xì)胞暴露于電磁場時，可以實(shí)時檢測和記錄細(xì)胞內(nèi)熒光探針對電磁場動態(tài)響應(yīng)的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：電磁生物效應(yīng)是生物體對電磁場或電磁波的反應(yīng)，可以分為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)兩種。熱效應(yīng)作用機(jī)理比較清楚，是由焦耳熱或輻射能所致。非熱效應(yīng)是一種弱效應(yīng)，作用機(jī)理不清楚，是生物電磁學(xué)的研究熱點(diǎn)。電磁生物效應(yīng)是一種因果節(jié)聯(lián)反應(yīng)，最初是電磁場與生物分子發(fā)生物理反應(yīng)，反應(yīng)后的生物分子相互之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，化學(xué)反應(yīng)后的生物分子導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致后續(xù)的生物器官和整體的反應(yīng)。因此，基于物理反應(yīng)的原初效應(yīng)是電磁生物效應(yīng)的起點(diǎn)，也是關(guān)鍵點(diǎn)。電磁生物效應(yīng)的研究有流行病調(diào)查、動物或人體、細(xì)胞、分子與生化、生物物理等層次。目前，細(xì)胞實(shí)驗的研究方法主要是基于暴露后觀察的組間對照，沒有在電磁場暴露期間觀察細(xì)胞自身反應(yīng)，即非實(shí)時性。這樣，很難確認(rèn)電磁場所引起的細(xì)胞效應(yīng)，尤其是很難排除電磁場以外的其它外源性干擾因素，如細(xì)胞樣品從培養(yǎng)箱移出瞬間遭受室溫與培養(yǎng)箱之間溫差所致的應(yīng)激反應(yīng)，以及細(xì)胞自身代謝的內(nèi)源性干擾等。在電磁場暴露期內(nèi)實(shí)時檢測細(xì)胞的生物效應(yīng)，可以最大限度地降低干擾因素，對認(rèn)識無擾或低擾狀態(tài)下電磁生物效應(yīng)特性具有重要意義。在細(xì)胞實(shí)驗中，活性氧自由基(ROS)、細(xì)胞內(nèi)鈣(Ca2+)、線粒體膜電位(MMP)等都是重要的電磁生物效應(yīng)觀察物。ROS是具有不配對電子的基團(tuán)或分子(R.)，主要有超氧陰離子()、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(.OH)等等，其化學(xué)性質(zhì)活潑，壽命短，有順磁性，是電磁生物原初效應(yīng)的重要標(biāo)志。細(xì)胞內(nèi)鈣(Ca2+)作為第二信使在細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中起著信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵作用，是多種參與蛋白質(zhì)、磷脂和核酸分解的酶的激活分子之一。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是由質(zhì)膜Ca2+轉(zhuǎn)位酶和細(xì)胞內(nèi)鈣池系統(tǒng)共同操縱控制的。細(xì)胞損害時，這一操縱過程紊亂可導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，胞內(nèi)Ca2+濃度不可控地持續(xù)增加。研究表明，電磁場暴露可以使細(xì)胞內(nèi)離子鈣濃度增加，因此，Ca2+是電磁生物效應(yīng)中信號傳導(dǎo)的重要標(biāo)志。線粒體是細(xì)胞能量生產(chǎn)工廠，ATP酶生成的主要場所。線粒體在呼吸氧化過程中產(chǎn)生ROS，在線粒體內(nèi)膜集聚質(zhì)子和其他離子而形成線粒體膜電位(MMP)?；钚匝踝杂苫?ROS)、細(xì)胞內(nèi)鈣(Ca2+)、線粒體膜電位(MMP)都可以用熒光探針觀察。ROS的熒光探針有DCFH-DA、Ca2+有Fluo-3、MMP有JC-1等等。熒光淬滅是指隨著時間的延長，熒光亮度逐漸變暗的過程，是熒光的一種基本特性。由于熒光淬滅特性的存在，一般細(xì)胞的熒光檢測技術(shù)不用在實(shí)時研究，大大限值了電磁生物細(xì)胞效應(yīng)的實(shí)時研究。本發(fā)明了一種由電磁場發(fā)生器和熒光顯微成像系統(tǒng)整合在一起的一體機(jī)所構(gòu)成的 實(shí)時電磁場細(xì)胞暴露系統(tǒng)，可以在電磁場暴露期，實(shí)時觀察和記錄細(xì)胞內(nèi)熒光的動態(tài)變化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：實(shí)時電磁場細(xì)胞暴露系統(tǒng)是由C形電磁鐵芯1、勵磁電流發(fā)生器2、熒光顯微鏡3、CCD攝像頭4、攝像頭操作系統(tǒng)5、熒光圖像處理系統(tǒng)6、電腦7等組成。C形電磁鐵芯1與勵磁電流發(fā)生器2和熒光顯微鏡3連接，熒光顯微鏡3與CCD攝像頭4連接，CCD攝像頭4與攝像頭操作系統(tǒng)5連接，攝像頭操作系統(tǒng)5與勵磁電流發(fā)生器2、熒光圖像處理系統(tǒng)6和電腦7連接，熒光圖像處理系統(tǒng)6與電腦7連接。C形電磁鐵芯1由矽鋼片堆9和勵磁線圈10組成。矽鋼片堆9圍成C形狀，其中空隙作為細(xì)胞槽8，用于放置細(xì)胞皿。勵磁電流發(fā)生器2是由信號發(fā)生器11、頻率調(diào)節(jié)器12、電流放大器13、勵磁電流調(diào)節(jié)14、勵磁電流開關(guān)15、霍爾傳感器16、霍爾傳感器檢測電路17組成。信號發(fā)生器11與頻率調(diào)節(jié)器12和電流放大器13連接，電流放大器13與勵磁電流調(diào)節(jié)14和勵磁電流開關(guān)15連接。霍爾傳感器16與霍爾傳感器檢測電路17連接。信號發(fā)生器11通過頻率調(diào)節(jié)器12產(chǎn)生0-340Hz的正弦信號，并輸入到電流放大器13。電流放大器13通過勵磁電流調(diào)節(jié)14產(chǎn)生0-1A、0-340Hz的勵磁電流，并通過勵磁電流開關(guān)15輸入到勵磁線圈10，使細(xì)胞槽8中產(chǎn)生磁感應(yīng)強(qiáng)度0.01-25.37mT，頻率0-340Hz的交變磁場。勵磁電流開關(guān)15控制勵磁電流的導(dǎo)流和阻斷，從而控制細(xì)胞槽8中交變磁場的發(fā)生和停止?；魻杺鞲衅鳈z測電路17接受由霍爾傳感器16的磁場檢測信號，用于實(shí)測細(xì)胞槽8中交變磁場的磁感應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)磁場的質(zhì)量控制。當(dāng)勵磁電流發(fā)生器2輸出電流，在細(xì)胞槽8產(chǎn)生交變磁場時，細(xì)胞槽8中細(xì)胞皿的細(xì)胞暴露在該磁場中。同時，熒光顯微鏡3對該細(xì)胞進(jìn)行顯微熒光成像，CCD攝像頭4對熒光顯微鏡3成像的圖像進(jìn)行實(shí)時記錄、保存，產(chǎn)生一個按時間序列排列的圖像集。攝像頭操作系統(tǒng)5對CCD攝像頭4的開啟、關(guān)閉，圖像捕獲、測量、處理、記錄、保存、標(biāo)記等進(jìn)行控制。勵磁電流發(fā)生器2在發(fā)生或阻斷電流的同時，向攝像頭操作系統(tǒng)5發(fā)出一個啟閉信號，并標(biāo)記在圖像集中，用于指示交變磁場開啟或關(guān)閉的時間。熒光圖像處理系統(tǒng)6從攝像頭操作系統(tǒng)5中獲取圖像集，對圖像集中的圖像進(jìn)行圖像采樣、細(xì)胞定位、細(xì)胞識別、熒光測算、像線轉(zhuǎn)換、曲線校正等處理和分析，以實(shí)現(xiàn)時間序列的圖像集轉(zhuǎn)換為時間序列的細(xì)胞熒光曲線。熒光圖像處理系統(tǒng)6是由圖像采樣18、細(xì)胞定位19、細(xì)胞識別20、熒光測算21、像線轉(zhuǎn)換22、曲線校正23組成。圖像采樣18是通過A/D轉(zhuǎn)換的方式將顯微鏡顯示的模擬量圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。數(shù)字圖像的色彩用三原色(紅、綠、藍(lán))亮度等級描述，每個像素原色(紅、綠、藍(lán))的亮度等級為一個字節(jié)(1bit)，即為255個等級。細(xì)胞定位19先在圖像集的第一幀圖像中用一個或多個方框標(biāo)記單個或多個目標(biāo)細(xì)胞，然后，在第二幀及以后的圖像中，在同一方框位置對標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行邊緣提取和熒光強(qiáng)度分析。細(xì)胞識別20是在細(xì)胞圖像中，選 擇綠色分量作為閾值分析參數(shù)，當(dāng)某一像素的綠色分量小于閾值(＜50)，則該像素標(biāo)記為0，代表為背景，否則，標(biāo)記為1，代表為細(xì)胞區(qū)部分。閾值50是可以根據(jù)分析要求人工設(shè)定的。對圖像的噪聲干擾采取自動選擇最大面積的連通區(qū)標(biāo)記為1，作為目標(biāo)細(xì)胞，其它標(biāo)記為0，作為背景噪聲。熒光測算21是在定位的標(biāo)記為1的細(xì)胞區(qū)域計算細(xì)胞總熒光亮度為區(qū)域各像素點(diǎn)的熒光強(qiáng)度C(λ)平均值S。像線轉(zhuǎn)換22是對圖像集中的每一個目標(biāo)細(xì)胞熒光測算強(qiáng)度平均值S后，按時間順序連接成曲線，形成的熒光曲線圖。曲線校正23的方法是設(shè)時間為t，圖像采集頻率為Ts，tp為電磁場切入時刻。在電磁場暴露前(t≤tp)，先對感興趣的目標(biāo)細(xì)胞采集Tn時間(約1-10分鐘)，有n＝Tn/Ts個數(shù)據(jù)，實(shí)測值為F(t)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)建立該目標(biāo)細(xì)胞熒光淬滅線性擬合方程：F1(t)＝at+b(0＜t≤tp)。在電磁場切入后(t＞tp)，對感興趣的目標(biāo)細(xì)胞采集Tm時間，有m＝Tm/Ts個數(shù)據(jù)，并對實(shí)測值F(t)進(jìn)行糾偏：ΔF＝F(t)-F1(t)(t＞tp)。得到糾偏后細(xì)胞熒光校正函數(shù)為：F2(t)=F‾+ΔF=F‾+F(t)-F1(t).]]>本發(fā)明的有益之處在于：本系統(tǒng)可以在細(xì)胞遭受電磁場暴露的同時，觀察和記錄細(xì)胞熒光隨時間變化的動態(tài)過程。為排除可能的內(nèi)源性或外源性干擾，準(zhǔn)確判斷細(xì)胞電磁生物效應(yīng)，研究細(xì)胞實(shí)時動態(tài)特性及其導(dǎo)致生物效應(yīng)發(fā)生的生物物理機(jī)制提供科學(xué)研究儀器。附圖說明圖1是實(shí)時電磁場細(xì)胞暴露系統(tǒng)圖。圖2是C形電磁鐵芯1示意圖。圖3是勵磁電流發(fā)生器2示意圖。圖4是熒光圖像處理系統(tǒng)6示意圖。圖5是實(shí)時電磁場細(xì)胞暴露胞內(nèi)ROS時序圖。圖6是實(shí)時電磁場細(xì)胞暴露胞內(nèi)Ca2+時序圖。圖7是熒光淬滅校正曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明加以詳細(xì)說明。實(shí)施例1：參見圖1，實(shí)時電磁場細(xì)胞暴露系統(tǒng)是由C形電磁鐵芯1、勵磁電流發(fā)生器2、熒光顯微鏡3、CCD攝像頭4、攝像頭操作系統(tǒng)5、熒光圖像處理系統(tǒng)6、電腦7等組成。C形電磁鐵芯1與勵磁電流發(fā)生器2和熒光顯微鏡3連接，熒光顯微鏡3與CCD攝像頭4連接，CCD攝像頭4與攝像頭操作系統(tǒng)5連接，攝像頭操作系統(tǒng)5與勵磁電流發(fā)生器2、熒光圖像處理系統(tǒng)6和電腦7連接，熒光圖像處理系統(tǒng)6與電腦7連接。參見圖2，C形電磁鐵芯1由矽鋼片堆9和勵磁線圈10組成。矽鋼片堆9圍成C形狀，其中空隙作為細(xì)胞槽8，用于放置細(xì)胞皿。勵磁電流發(fā)生器2可發(fā)生0-1A的電流，并輸入到C形電磁鐵芯1的勵磁線圈10 中，以產(chǎn)生磁感應(yīng)強(qiáng)度0.01-25.37mT，頻率0-340Hz的交變磁場。熒光顯微鏡3對細(xì)胞皿中的細(xì)胞熒光進(jìn)行顯微成像，CCD攝像頭4對熒光顯微鏡3成像的圖像進(jìn)行實(shí)時記錄、保存，產(chǎn)生一個按時間序列排列的圖像集，攝像頭操作系統(tǒng)5對CCD攝像頭4的開啟、關(guān)閉，圖像采集、測量、處理、記錄、保存、標(biāo)記等進(jìn)行控制。勵磁電流發(fā)生器2在發(fā)生或阻斷電流的同時，向攝像頭操作系統(tǒng)5發(fā)出一個啟閉信號，并標(biāo)記在圖像集中，用于指示交變磁場開啟或關(guān)閉的時間。熒光圖像處理系統(tǒng)6從攝像頭操作系統(tǒng)5中獲取圖像集，對圖像集中的圖像進(jìn)行圖像采樣、細(xì)胞定位、細(xì)胞識別、熒光測算、像線轉(zhuǎn)換、曲線校正等處理，以實(shí)現(xiàn)時間序列的圖像集轉(zhuǎn)換為時間序列細(xì)胞熒光亮度曲線。實(shí)施例2：參見圖3，勵磁電流發(fā)生器2是由信號發(fā)生器11、頻率調(diào)節(jié)器12、電流放大器13、勵磁電流調(diào)節(jié)14、勵磁電流開關(guān)15、霍爾傳感器16、霍爾傳感器檢測電路17組成。信號發(fā)生器11與頻率調(diào)節(jié)器12和電流放大器13連接，電流放大器13與勵磁電流調(diào)節(jié)14和勵磁電流開關(guān)15連接?；魻杺鞲衅?6與霍爾傳感器檢測電路17連接。信號發(fā)生器11通過頻率調(diào)節(jié)器12產(chǎn)生0-340Hz的正弦信號，并輸入到電流放大器13。電流放大器13通過勵磁電流調(diào)節(jié)14產(chǎn)生0-1A、0-340Hz的勵磁電流，并輸入到勵磁電流開關(guān)15。勵磁電流開關(guān)15控制勵磁電流的導(dǎo)流和阻斷，從而控制細(xì)胞槽8中交變磁場的發(fā)生和停止。霍爾傳感器檢測電路17接受由霍爾傳感器16的磁場檢測信號，用于實(shí)測細(xì)胞槽8中交變磁場的磁感應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)磁場的質(zhì)量控制。實(shí)施例3：參見圖4，熒光圖像處理系統(tǒng)6是由圖像采樣18、細(xì)胞定位19、細(xì)胞識別20、熒光測算21、像線轉(zhuǎn)換22、曲線校正23組成。熒光圖像處理系統(tǒng)6的主要任務(wù)是從CCD攝像頭4實(shí)時記錄、保存的圖像集中，將感興趣的細(xì)胞圖像的熒光亮度轉(zhuǎn)換為按時間序列的數(shù)值數(shù)據(jù)，并建立時間域的熒光亮度曲線。攝像頭操作系統(tǒng)5將CCD攝像頭4的圖像以1幀/秒的采樣頻率采集圖像數(shù)據(jù)，將視野中的圖像用1340×1004的高分辨率進(jìn)行采樣，通過USB接口將這些數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌z像頭操作系統(tǒng)5中，以連續(xù)圖像的格式存儲，進(jìn)行后續(xù)圖像處理。圖像采樣18是通過A/D轉(zhuǎn)換的方式將顯微鏡顯示的模擬量圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。數(shù)字圖像的色彩用三原色(紅、綠、藍(lán))亮度等級描述，每個像素原色(紅、綠、藍(lán))的亮度等級為一個字節(jié)(1bit)，即為255個等級。細(xì)胞定位19是用于確定感興趣的目標(biāo)細(xì)胞，其處理方法是選擇成像清晰，熒光明亮，且周圍沒有粘連物的細(xì)胞作為分析目標(biāo)，一般有人工定位和自動定位兩種圖像處理方法：(1)自動定位：采用邊緣檢測，自動識別圖像中的多個細(xì)胞。這種方法客觀方便，數(shù)據(jù)處理自動化，可以快速處理大量的圖像數(shù)據(jù)；(2)人工定位：先在圖像集的第一幀圖像中用一個或多個方框標(biāo)記單個或多個目 標(biāo)細(xì)胞，然后，在第二幀及以后的圖像中，在同一方框位置對標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行邊緣提取和熒光強(qiáng)度分析。實(shí)際上，多細(xì)胞粘連是很常見的現(xiàn)象，自動定位往往會出現(xiàn)偏差，而人工定位介入人的判斷能力，可以保證所定位的細(xì)胞是單個無粘連的，是切實(shí)可行的方法。細(xì)胞識別20的作用是在熒光圖像中將細(xì)胞區(qū)域識別出來，把細(xì)胞區(qū)的部分標(biāo)記為1，其余標(biāo)記為0。實(shí)現(xiàn)方法是根據(jù)細(xì)胞熒光為綠色，背景為黑色的事實(shí)，將細(xì)胞圖像進(jìn)行二值化處理。處理方法是在細(xì)胞圖像中，選擇綠色分量作為閾值分析參數(shù)，當(dāng)某一像素的綠色分量小于閾值(＜50)，則該像素標(biāo)記為0，代表為背景，否則，標(biāo)記為1，代表為細(xì)胞區(qū)部分。閾值50是可以根據(jù)分析要求人工設(shè)定的。CCD攝像頭4是一種基于半導(dǎo)體的電荷耦合裝置，其成像質(zhì)量受到溫度變化等的噪聲干擾而不清晰，表現(xiàn)在細(xì)胞熒光圖像中一些不是細(xì)胞的圖像也顯示為綠色，造成二值化后的多個圖像連通現(xiàn)象。處理方法是自動選擇最大面積的連通區(qū)標(biāo)記為1，作為目標(biāo)細(xì)胞，其它標(biāo)記為0，作為背景噪聲。熒光測算21是在定位的標(biāo)記為1的細(xì)胞區(qū)域計算細(xì)胞總熒光亮度。計算方法是經(jīng)圖像采集獲得的熒光圖像是以R、G、B(紅綠藍(lán))三分量表示的數(shù)據(jù)，根據(jù)國際照明委員會的規(guī)范(CIE)，將數(shù)字圖像的RGB系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為CIE-XYZ系統(tǒng)。首先，RGB系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為CIE-XYZ系統(tǒng)三分量刺激值：X=0.490R+0.310G+0.200BY=0.177R+0.812G+0.011BZ=0.010G+0.990G---(1)]]>然后，轉(zhuǎn)換色度坐標(biāo)x，y，z：x=X/(X+Y+Z)y=Y/(X+Y+Z)z=Z/(X+Y+Z)---(2)]]>以y色度坐標(biāo)分量為主，搜索CIE不同波長與色度坐標(biāo)x，y，z對應(yīng)關(guān)系對比表，找到與y色度分量最為匹配的顏色波長λ。CIE-XYZ系統(tǒng)給出了不同波長λ對應(yīng)的理想三原色值和空間色度坐標(biāo)值。取色度坐標(biāo)x，y建立直角坐標(biāo)系，將代表不同波長的x、y值標(biāo)記出來，即可得到一條馬蹄形曲線。對于任意給出的像素RGB值，計算的色度坐標(biāo)x、y不一定恰好位于馬蹄形曲線上。如有一點(diǎn)P，在距離馬蹄線上最近的點(diǎn)波長值作為該像素的波長，如P點(diǎn)距離馬蹄線上480nm點(diǎn)最近，故P點(diǎn)的波長就是480nm。得到波長λ后，搜索CIE-RGB顏色空間，查找與波長對應(yīng)的三分量刺激值R(λ)、G(λ)、B(λ)，并計算熒光強(qiáng)度C(λ)：C(λ)＝R(λ)+4.590G(λ)+0.060B(λ)(3)從像素的RGB數(shù)據(jù)計算相應(yīng)的波長，計算量很大，尤其是對于連續(xù)采集30分鐘的高分辨率圖像，其運(yùn)行時間非常大。因此，我們對于可窮舉的RGB，先建立一張λ(x、y)＝λ(R，G，B)查詢表，通過數(shù)據(jù)庫查詢，對于某一像素可以快速獲得λ，大大提高了運(yùn)算速度。細(xì)胞的總熒光亮度是在細(xì)胞識別的區(qū)域中各像素點(diǎn)的熒光強(qiáng)度C(λ)平均值S：S=1NΣi=1NCi(λ)---(4)]]>參見圖5和圖6，像線轉(zhuǎn)換22是對圖像集中的每一個目標(biāo)細(xì)胞熒光測算強(qiáng)度平均值S后，按時間順序連接成曲線，形成的熒光曲線圖。圖5和圖6分別是電磁場海馬神經(jīng)元暴露期胞內(nèi)ROS和Ca2+熒光的實(shí)時時序圖。傳統(tǒng)上，生物熒光技術(shù)是用于單次成像，熒光淬滅不影響圖像獲得。但在實(shí)時研究中，熒光圖像是多次成像形成圖像集，熒光淬滅將持續(xù)降低熒光亮度，形成成像偏差，影響像線轉(zhuǎn)換。因此，像線轉(zhuǎn)換的熒光曲線必須進(jìn)行校正。曲線校正23的方法是：設(shè)時間為t，圖像采集頻率為Ts，tp為電磁場切入時刻。在電磁場暴露前(t≤tp)，先對感興趣的目標(biāo)細(xì)胞采集Tn時間(約1-10分鐘)，有n＝Tn/Ts個數(shù)據(jù)，實(shí)測值為F(t)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)建立該目標(biāo)細(xì)胞熒光淬滅線性擬合方程：F1(t)＝at+b(0＜t≤tp)(5)這里：F1(t)為擬合方程目標(biāo)細(xì)胞熒光亮度計算值，a和b為最小二乘擬合方程參數(shù)：a=Σi=1n(ti-t‾)(Fi-F‾)Σi=1n(ti-t‾)2---(6)]]>b=F‾-at‾---(7)]]>這里：和分別為細(xì)胞熒光實(shí)測值F和時間值t的平均值。在電磁場切入后(t＞tp)，對感興趣的目標(biāo)細(xì)胞采集Tm時間，有m＝Tm/Ts個數(shù)據(jù)，并對實(shí)測值F(t)進(jìn)行糾偏：ΔF＝F(t)-F1(t)(t＞tp)(8)得到糾偏后細(xì)胞熒光校正函數(shù)為：F2(t)=F‾+ΔF=F‾+F(t)-F1(t)---(9)]]>參見圖7，曲線校正23的方法可以獲得較好的效果。實(shí)施例4：在研究實(shí)時電磁場暴露海馬神經(jīng)元胞內(nèi)ROS和Ca2+的應(yīng)用。在超凈臺內(nèi)用0.5ml的0.1mg/ml多聚賴氨酸(Poly-L-lysine，Sigma)包被細(xì)胞皿30min，吸棄，過夜晾干備用。用75％酒精消毒SD大鼠，終止生命，取大腦海馬組織，剝除腦膜和血管，置于冰浴解剖液中。將海馬組織切碎后，轉(zhuǎn)移至2ml0.25％胰酶溶液(Trypsin(1X)，Lifetechnologies)中，37℃消化20min。吸棄胰酶，用37℃溫浴中2ml種植液終止消化，再用種植液洗海馬組織2遍。在海馬組織中加入2m1種植液，用1ml移液槍輕輕吹打，用500轉(zhuǎn)/min離心30s，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后，用種植液稀釋細(xì)胞懸液，并按1×106/ml密度接種在細(xì)胞皿0.5ml。4h后用Neurobasal-A使用液全量換液，第3天用Neurobasal-A使用液 半量換液，并加上0.5μl10μM阿糖胞苷(Ara-c，Sigma)，再隔3天用Neurobasal-A使用液半量換液。取第7天的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。系統(tǒng)使用本系統(tǒng)前，勵磁電流發(fā)生器2上的霍爾傳感器16插入C形電磁鐵芯1的細(xì)胞槽8中，通過頻率調(diào)節(jié)器12和勵磁電流調(diào)節(jié)14調(diào)節(jié)勵磁電流，使細(xì)胞槽8內(nèi)的磁感應(yīng)強(qiáng)度在0-340Hz，0.01-25.37mT內(nèi)連續(xù)可調(diào)，以保證細(xì)胞槽8內(nèi)磁場的合格性。系統(tǒng)使用時，細(xì)胞皿放置在C形電磁鐵芯1中的細(xì)胞槽8中。當(dāng)勵磁電流發(fā)生器2輸出電流，在細(xì)胞槽8產(chǎn)生交變磁場時，細(xì)胞槽8中細(xì)胞皿的細(xì)胞暴露在該磁場中。同時，熒光顯微鏡3對該細(xì)胞進(jìn)行顯微熒光成像，實(shí)現(xiàn)C形電磁鐵芯1中的電磁場暴露與熒光顯微鏡3的熒光成像同步產(chǎn)生，達(dá)到實(shí)時的目的。系統(tǒng)使用后，熒光圖像處理系統(tǒng)6從攝像頭操作系統(tǒng)5中導(dǎo)出圖像集，通過像線轉(zhuǎn)換，獲得時間序列的實(shí)時電磁場暴露曲線。實(shí)施例5：研制了兩臺勵磁電流發(fā)生器2，送浙江省計量科學(xué)研究院檢測，檢測結(jié)果如表1和表2。細(xì)胞槽內(nèi)霍爾傳感器電壓：1-200mV；磁感應(yīng)強(qiáng)度：0.01047-25.3679mT；精度：1.623％；磁場頻率：0-340Hz。表11#機(jī)磁場特性表22#機(jī)磁場特性當(dāng)前第1頁1 2 3