本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及EPFL1蛋白及其編碼基因在植物育性中的應用。

背景技術：

植物雄配子體花粉的形成包括小孢子的發(fā)生和雄配子的形成兩個過程。小孢子的發(fā)生這一過程都在幼小的花藥中進行，包括小孢子母細胞的形成，減數分裂過程以及四分體的分散過程。雄配子體即花粉粒是小孢子經過兩次有絲分裂形成的，其中包含被稱作雄配子的精細胞。在花粉發(fā)育的這一系列過程中涉及到眾多相關基因，只有他們按照一定的時空順序正常表達，才能保證可育花粉的形成。

我國的雄性不育研究和利用在國際上處于領先地位。近年來應用現代細胞生物學技術、遺傳學和分子生物學手段對模式植物水稻和擬南芥的雄性不育過程做了深入的研究，取得了一些新的研究結果，如：擬南芥中的Ems1、CER1、AtGSL2基因和水稻UDT1、MSP1、GAMYB、UDPG、WDA1基因等，上述基因的突變直接導致了植株的育性降低，有的完全不育。Ems1編碼一個受體激酶基因，該基因主要參與花粉母細胞、絨氈層的發(fā)育；UDT1基因是小孢子發(fā)育的關鍵基因，該基因主要作用于減數分裂時期，它對于絨氈層細胞的發(fā)育、小孢子母細胞的減數分裂以及中層的降解起作用；GAMYB基因對于小孢子母細胞緊貼絨氈層細胞吸收營養(yǎng)進而進行正常的減數分裂是必需的；WDA1基因對于水稻花粉壁蠟質層形成是必需的。對它們的研究加深了對植物雄性不育機理的理解。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的是提供抑制EPFL1蛋白的編碼基因表達的物質的用途。

本發(fā)明提供了抑制EPFL1蛋白的編碼基因表達的物質在降低植物育性中的應用。

上述應用中，所述EPFL1蛋白的氨基酸序列為序列表中序列5。

上述應用中，所述抑制EPFL1蛋白的編碼基因表達的物質為如下1)-3)：

1)如序列表中序列2所示的DNA片段；

2)由1)所述的DNA片段編碼的miRNA；

3)含有1)所述的DNA片段的重組載體。

上述應用中，所述重組載體為將所述DNA片段和驅動其表達的啟動子共同插入表達載體中得到的載體。

上述應用中，所述表達載體為pCAMBIA2300；所述啟動子的核苷酸序列為序列表中序列3。

上述應用中，所述重組載體具體為將所述DNA片段替換pCAMBIA2300載體的 Pst I和Hind III酶切位點間的DNA片段，且將序列3所示的啟動子替換pCAMBIA2300的Kpn I和Sal I酶切位點間的DNA片段得到的載體。

上述應用中，所述降低植物育性體現在使植物雄蕊變小和/或角果變短和/或胚珠數目降低。

上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育育性降低或者培育不育植物的方法。

本發(fā)明提供的培育育性降低或者培育不育植物的方法包括如下步驟：將抑制EPFL1蛋白的編碼基因表達的物質導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的育性低于所述目的植物。

上述方法中，所述抑制EPFL1蛋白的編碼基因表達的物質為EPFL1 RNAi片段；

所述EPFL1 RNAi片段的核苷酸序列為序列表中序列2；

所述EPFL1 RNAi片段是通過重組載體中導入目的植物的；

所述重組載體為將如序列表中序列2所示的EPFL1 RNAi片段插入表達載體中得到的載體。

上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種DNA分子。

本發(fā)明提供的DNA分子為如下1)或2)：

1)序列為序列表中序列2的DNA分子；

2)在嚴格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。

本發(fā)明利用反義核酸沉默擬南芥體內EPFL1基因表達，得到的轉基因擬南芥雄蕊變小、角果變短、胚珠數目降低，從而證明EPFL1基因可以調控植物的育性，在農業(yè)生產中的育種、產種過程中獲得雄性不育系、創(chuàng)造人工可控制雄性不育以及轉基因生物安全的受體材料等方面都具有重要的應用前景。

附圖說明

圖1為RNAi片段構建引物配搭示意圖。

圖2為pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒圖譜。

圖3為轉基因株系2#、3#、4#、8#、9#的表達量鑒定。

圖4為亞歷山大染色法觀察轉基因株系2#、3#、4#、8#、9#的雄蕊育性。

圖5為轉基因植株3#、4#的角果觀察結果。

圖6為轉基因植株3#、4#的胚珠數目。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

pRS300質粒(5ng/ul)在文獻“Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis.Schwab R,Ossowski S,Riester M,Warthmann N,Weigel D.Plant Cell.2006 May.18(5):1121-33.”中公開過，公眾可從北京大學生命科學學院獲得。

pQGIE110質粒在文獻“Expression and functional analysis of the rice plasma-membrane intrinsic protein gene family.Lei Guo,Zi Yi Wang,Hong Lin,Wei Er Cui,Jun Chen,Meihua Liu,Zhang Liang Chen,Li Jia Qu and Hongya Gu.Cell Research.2006.March.16(16)277–286.”中公開過，公眾可從北京大學生命科學學院獲得。

pCAMBIA2300質粒是北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，產品目錄號為MCV036。

實施例1、pEPFL1::EPFL1 RNAi轉基因擬南芥的獲得

一、pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒的獲得

1、EPFL1 RNAi片段設計

使用在線RNAi片段設計網站WMD3(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi)設計如下引物用于構建EPFL1(At5g10310)的EPFL1 RNAi片段，引物序列如下：

A:5′-CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3′；

B:5′-CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC-3′；

I(miR-s)：5′-GACGACCACTTTTATTATCCTTTTCTCTCTTTTGTATTCC-3′；

II(miR-a)：5′-GAAAAGGATAATAAAAGTGGTCGTCAAAGAGAATCAATGA-3′；

III(miR*s)：5′-GAAACGGATAATAAATGTGGTCGTCACAGGTCGTGATATG-3′；

IV(miR*a)：5′-GACGACCACATTTATTATCCGTTTCTACATATATATTCCT-3′。

2、EPFL1 RNAi片段的獲得

(1)以pRS300質粒(5ng/ul)為模板，按照圖1所示的引物搭配方法進行PCR，得到(a)、(b)、(c)三個中間PCR產物。

PCR反應體系(50ul)：2xKOD Mix 25ul、pRS300(1:100)2ul、上游引物2ul、下游引物2ul、KODase 1ul、ddH₂O補足50ul。

PCR反應條件：95℃5’；94℃30”，58℃30”，68℃40”，24cycles；68℃10’。

(2)向上述步驟(1)獲得的(a)、(b)、(c)三個中間PCR產物中加5ul(10X)loading buffer，用2％瓊脂糖凝膠電泳方法分離、純化、回收，調整濃度為5ng/ul；以(a)、(b)、(c)三個中間PCR產物為模板，進行PCR反應，得到PCR產物。

PCR反應體系(50ul)：2xKOD Mix 25ul、OligoA-SmaI 2ul、oligoB-SacI 2ul、KODase 1ul、(a)0.5ul、(b)0.5ul、(c)0.5ul、ddH₂O補足50ul。

PCR反應條件：95℃5’；94℃30”，58℃30”，68℃40”，24cycles；68℃10’。

(3)向步驟(2)得到的PCR產物中加5ul(10X)loading buffer，用2％瓊脂糖凝膠電泳方法分離、純化、回收，得到大小為701bp的EPFL1 RNAi模板(d)即為EPFL1的人工干擾miRNA基因片段(如序列表中序列1所示)。

(4)用限制性內切酶SmaI和Sac I對上述步驟(3)獲得的EPFL1 RNAi模板進行雙酶切，得到大小為701bp的DNA片段；用限制性內切酶SmaI和Sac I對pQGIE110質粒進行雙酶切，得到骨架載體大片段。

(5)用T4連接酶將上述得到的DNA片段和骨架載體大片段連接，得到重組載體。連接反應體系如下：10x T4ase Buffer 1ul、T4ase 1ul、DNA片段2ul、骨架載體1ul、ddH₂O 5ul。16℃恒溫連接反應16h。

(7)使用大腸桿菌熱擊轉化法將上述步驟(6)得到的重組載體轉化DH5α菌株，篩選得到陽性克隆。

(8)采用Oligo A和EPFL1-RNAi-a-Hind III引物，以上述步驟(7)獲得的陽性克隆為模板進行PCR擴增，得到如序列表中序列2所示的DNA片段即為EPFL1 RNAi片段。

Oligo A：5’-CCCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’；

EPFL1-RNAi-a-Hind III：5’-TCCCCAAGCTTGGCCGCTCTAGAACTAGT-3’。

3、pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒的獲得

(1)用限制性內切酶Pst I和Hind III對上述獲得的EPFL1 RNAi片段和pCAMBIA2300質粒進行雙酶切，用T4連接酶連接(反應體系同上述步驟(5))，得到含EPFL1 RNAi片段的重組質粒。

(2)采用pEPFL1-Kpn-lp和pEPFL1-Sal-rp引物，從擬南芥基因組中克隆EPFL1編碼區(qū)上游2kb區(qū)域的DNA片段(如序列表中序列3所示)，作為驅動EPFL1 RNAi片段進行原位基因沉默的啟動子。引物序列如下(下劃線的序列代表酶切位點)：

pEPFL1-Kpn-lp：5’-CCGGGGTACC TGTGAAAGTCTTCTCTTTCTG-3’；

pEPFL1-Sal-rp：5’-TCGCGTCGAC TAAAGGAGGAGCTTCATGTGG-3’。

(3)使用限制性內切酶Kpn I和Sal I對上述步驟(2)獲得的啟動子和步驟(1)獲得的含EPFL1 RNAi片段的重組質粒進行雙酶切，用T4連接酶連接，得到如圖2所示的pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒，并對其進行測序驗證。

測序結果表明：pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒為將序列2所示的EPFL1 RNAi片段替換pCAMBIA2300載體的Pst I和Hind III酶切位點間的DNA片段，且將序列 3所示的啟動子替換pCAMBIA2300的Kpn I和Sal I酶切位點間的DNA片段得到的載體。

二、轉基因植株的獲得

將步驟一獲得的pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒，電擊轉化到農桿菌GV3101菌株中，得到含有pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒的農桿菌，然后使用花絮浸泡法將含有pEPFL1::EPFL1 RNAi重組質粒的農桿菌轉染野生型擬南芥(Columbia)。使用含有100ug/mL硫酸卡那霉素的固體MS培養(yǎng)基篩選轉基因T₀代的種子，得到18株轉基因T₁代植株，并用RT-PCR法對18株轉基因T₁代植株的EPFL1表達量進行檢測。

檢測結果如圖3所示：和對照相比，轉基因株系2#，3#，4#，8#，9#的EPFL1表達量明顯下降，選取轉基因株系2#，3#，4#，8#，9#株系用于進一步的表型分析。

1、農桿菌電擊轉化方法如下：

(1)農桿菌電擊轉化感受態(tài)制備

A、復蘇農桿菌菌株，從-80℃挑取農桿菌菌株GV3101于5ml含硫酸慶大霉素和利福平抗性的LB培養(yǎng)基中，28℃，220rpm活化過夜；

B、擴大培養(yǎng)，將活化的GV3101按1:1000比例接入800ml含硫酸慶大霉素和利福平抗性的LB培養(yǎng)基中，28℃，220rpm培養(yǎng)至OD550≈1.0；

C、無菌操作，將菌液分為兩瓶，每瓶400ml，4℃，4000×g離心10min，棄上清，每瓶用200ml預冷10％甘油重懸菌體；

D、無菌操作，4℃，4000×g離心10min，棄上清，每瓶用15ml預冷10％甘油重懸菌體；

E、無菌操作，4℃，4000×g離心10min，棄上清；用0.5ml預冷10％甘油重懸菌體，終體積0.75ml左右，立即使用或分裝為50ul每管后-80℃凍存。

(2)電擊轉化

A、提取待轉化的質粒，濃度至少達到20ng/μl；

B、冰上溶化-80℃凍存的農桿菌感受態(tài)50μl，同時預冷Bio-Rad 0.2cm電擊杯；

C、冰上操作，取100ng質粒DNA于農桿菌感受態(tài)中，輕彈管壁混勻；

D、設置Bio-Rad GenePulser XcellTM PC Module電擊儀V＝2.4kv，C＝25μF，PC＝200ohm，電擊杯參數0.2cm；

E、將步驟3中的質粒感受態(tài)混合液加入電擊杯底部；

F、將電擊杯放入電擊槽中，電擊；

G、電擊完畢后迅速加入1ml常溫LB培養(yǎng)基，轉移至1.5ml EP管中；

H、28℃，220rpm復蘇3h，取200ul涂于含硫酸慶大霉素，利福平，硫酸卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，28℃倒扣平板篩選研陽性菌落。

2、轉染方法如下：

(1)挑取-80℃保存的含目標基因的農桿菌菌株，轉接入5ml含硫酸慶大霉素，利福平，硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，28℃220rpm活化過夜；

(2)以1:100的比例轉接已活化的菌液到500ml的相對應抗性的LB培養(yǎng)基中，28℃、220rpm培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.6；

(3)室溫離心4000rpm、10min，棄上清；

(4)用同等體積(500ml)的轉化緩沖液(轉化緩沖液配方(1L)：MS粉末(Sigma M5519)2.2g、蔗糖50g、使用KOH調pH＝5.7、1mg/mL 6-芐氨基嘌呤(6-BA)10μL、Silwet L-77 200μL)重懸菌體；

(5)取抽苔達10-15cm的野生型(Columbia)擬南芥，澆水至飽和，同時剪除完成授粉的花及角果，只保留未開花部分的花絮；

(6)將植株地上部分倒置于轉化緩沖液。重懸的農桿菌中，保證植株基生葉以上部分全部浸沒于菌液中，侵染8min(同一份轉化液可連續(xù)侵染3盆植株)；

(7)取出植物，將花盆側放避光培養(yǎng)24h；

(8)按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)(注意不可對植株地上部分澆水)；

角果成熟后收集T₀代種子；

(9)對T₀代種子進行滅菌處理后，種在含抗性的MS平板上，篩選T₁代陽性植株。

實施例2、轉基因株系的表型鑒定

一、雄蕊

使用亞歷山大染色法對T1代轉基因株系2#，3#，4#，8#，9#的雄蕊進行染色分析，以野生型擬南芥植株(Col)為對照。亞歷山大染色方法如下：

吸取200uL亞歷山大染色液于1.5mL EP管中，取適宜時期的小花完全浸入染色中，室溫染色8h以上。取出染液中的小花，在體視鏡下將雄蕊解剖出來，置于載玻片上，滴上適量透明液，蓋玻片封片，透明8～24h后，顯微鏡下觀察拍照。

亞歷山大染色液是由95％乙醇10mL、1％孔雀綠(95％乙醇配制)1mL、蒸餾水50mL、甘油25mL、苯酚5g、水合三氯乙醛5g、1％酸性品紅5mL、1％橙G(Orange G)0.5mL和冰醋酸1mL(未從花藥中散粉的花粉需用4mL)混勻得到的。

透明液是將三氯乙醛、甘油、水按照8:1:2的體積比混勻得到的。

結果如圖4所示：從整體來看，和野生型擬南芥植株(Col)相比，轉基因株系2#，3#，4#，8#，9#的雄蕊變小，有些藥室發(fā)育不正常。

二、角果

選取轉基因株系3#和4#對角果進行進一步的分析。以野生型擬南芥植株(Col)為對照。

結果如圖5所示：轉基因植株的育性明顯下降，其中都出現敗育的角果，3#更為明顯，但并不是全株完全敗育，也能夠結出一些較短的角果。

對這些角果進行進一步觀察，轉基因植株的角果相對于野生型來說明顯變短，其中，轉基因株系3#角果最短，4#的角果稍長，但仍然短于野生型。育性顯著下降。

三、胚珠

解剖轉基因株系3#和4#的角果，對角果內的胚珠進行觀察。以野生型擬南芥植株(Col)為對照。

結果如圖6所示：轉基因植株只有部分胚珠能夠正常發(fā)育，大量胚珠出現敗育情況，對這些植株的胚珠數目進行統(tǒng)計，發(fā)現轉基因株系3#和4#的胚珠數目顯著下降，其中轉基因株系3#的每個角果所含的胚珠數目下調降至野生型的50％以下。