本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個水稻抗病相關(guān)基因OsDR11的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用研究。OsDR11是參與水稻抗病反應(yīng)。由于選擇性剪接模式不同，可產(chǎn)生OsDR11S和OsDR11L兩個轉(zhuǎn)錄本。超量表達OsDR11S的轉(zhuǎn)基因植株以及抑制OsDR11L表達的轉(zhuǎn)基因植株抵抗白葉枯病的能力均顯著提高。

背景技術(shù)：

植物在生長的過程中會受到多種病原物的侵害，使植物致病的病原菌包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲等。當(dāng)病原物侵入植物后有可能會導(dǎo)致兩種結(jié)果：(1)寄主植物殺死病原物或阻止其生長，產(chǎn)生抗病反應(yīng)；(2)寄主植物不能抵御病原體入侵和繁殖，產(chǎn)生相關(guān)的病癥。所以利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時又保護環(huán)境的根本出路。

植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類：(1)主效抗病基因，又稱MR(major resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因(Kou and Wang,2010；Zhang and Wang,2013)。

根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認(rèn)識，MR基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導(dǎo)路徑(Zhang and Wang,2013)。MR基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)MR基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的主效抗病基因大約只有三十幾個；(2)MR基因通常具有病原種類和病原生理小種特異性，即一個MR基因通常只對某一病原的部分生理小種具有抗性，抗病范圍有限；(3)因為病原的快速突變，一個MR基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。

抗病相關(guān)基因是指除MR基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號分子、參于信號傳導(dǎo)、阻止信號傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點是病原誘導(dǎo)后它們的表達量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Schenk等，2000；Zhou等，2002；Chu等，2004)。目前，人們對抗病相關(guān)基因的認(rèn)識有限。根據(jù)已有報道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨作用時的抗性能力可能比主效抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源：(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源(Kou and Wang,2010)；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。但是，水稻中雖然鑒 定了很多抗病相關(guān)基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，這些基因在水稻抗病反應(yīng)中的作用機理、以及單個抗病相關(guān)基因是否會引起水稻抗病表型的改變都不清楚。

水稻是人類重要的糧食作物，在亞洲國家、美洲的南部和中部、非洲的中部和東部都有廣泛的種植，雖然我國的環(huán)境適合種植水稻，但是水稻仍然會受到許多環(huán)境的影響從而造成減產(chǎn)。白葉枯病對水稻的危害嚴(yán)重，根據(jù)水稻生長階段、地理位置和季節(jié)條件，造成的水稻減產(chǎn)(Kou and Wang,2013)。雨水多，濕度大，或者深水灌溉均容易引發(fā)大規(guī)模的白葉枯病，造成嚴(yán)重的減產(chǎn)，所以抗白葉枯病品種的選育是極為關(guān)鍵。

為了控制病害的發(fā)生，人們往往采取化學(xué)制劑、輪作等方式來提高水稻抗病的水平，但是化學(xué)制劑往往提高了額外的經(jīng)濟成本，造成環(huán)境污染；而輪作在現(xiàn)代化的農(nóng)業(yè)種植模式下對于植物抗病效率也不高(Helliwell and Yang,2013)。相比較而言，賦予植株寄主抗性是最為經(jīng)濟有效并且環(huán)境友好的防治病蟲害的方式，所以培育出能夠抗病的水稻，種植抗病品種具有極高的應(yīng)用價值。

與MR基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通過超量表達抗病反應(yīng)的正調(diào)控因子基因或者抑制表達抗病反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子序列進行水稻品種的改良，將進一步增強水稻的抗病性，拓寬水稻的抗譜。這些方面是采用常規(guī)水稻育種和改良技術(shù)所不能達到的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中攜帶的一個抗病相關(guān)基因完整DNA片段，并利用超量表達技術(shù)，以及RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)通過使目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因受體中超量表達或者沉默從而鑒定其在抗病反應(yīng)過程中所起的作用，為利用這個基因改良水稻品種或其它植物抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。這個基因被命名為OsDR11。

本發(fā)明涉及分離一種包含OsDR11基因的DNA片段并鑒定其功能，該片段能賦予水稻對由白葉枯病菌所引起的病害產(chǎn)生的抗病反應(yīng)。對其序列進行分析，表明它是一個編碼LAMMER蛋白激酶的水稻基因，并發(fā)現(xiàn)該基因能夠通過不同的選擇性剪接方式產(chǎn)生OsDR11S以及OsDR11L兩個轉(zhuǎn)錄本。超量表達OsDR11S(SEQ ID NO：1)或者抑制表達OsDR11L(SEQ ID NO：2)均可以增強水稻對白葉枯病的抗性。所以，所述OsDR11片段如序列表SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的亞片段。

可以采用已經(jīng)克隆的OsDR11基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的OsDR11基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsDR11基因的序列或者包含一段OsDR11基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞超量表達OsDR11S轉(zhuǎn)錄本或抑制OsDR11L轉(zhuǎn)錄本的表達，產(chǎn)生抗病轉(zhuǎn)基因植物。采用這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育 種技術(shù)所不能達到的。

本發(fā)明為增強水稻對白葉枯病菌的抗性提供了新的方法。包括將OsDR11S基因完整編碼區(qū)的CDS片段與能夠超量表達目標(biāo)基因的載體連接、轉(zhuǎn)入水稻，通過超量表達OsDR11S改良水稻對白葉枯病的抗性；還包括將OsDR11L轉(zhuǎn)錄本的部分片段和與能夠表達雙鏈RNA的載體連接、轉(zhuǎn)入水稻，通過抑制其自身OsDR11L轉(zhuǎn)錄本的表達改良水稻對白葉枯病的抗性。

在本發(fā)明的實施例部分，發(fā)明人闡述了OsDR11基因的分離、功能驗證和應(yīng)用研究過程以及該基因的特點。

附圖說明

序列表SEQ ID NO：1本發(fā)明分離克隆的OsDR11基因的基因組序列。序列長度為3206bp。

序列表SEQ ID NO：2本發(fā)明分離克隆的OsDR11基因由于選擇性剪接方式不同產(chǎn)生的OsDR11S轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列，序列長度為1435bp，其中1-531位堿基所示的序列是編碼閱讀框(即CDS)，編碼170個氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：3本發(fā)明分離克隆的OsDR11基因由于選擇性剪接方式不同產(chǎn)生的OsDR11S轉(zhuǎn)錄本序列編碼的蛋白質(zhì)序列。

序列表SEQ ID NO：4本發(fā)明分離克隆的OsDR11基因由于選擇性剪接方式不同產(chǎn)生的OsDR11L轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列，序列長度為1404bp，其中1-1113位堿基所示的序列是編碼閱讀框(即CDS)，編碼370個氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：5本發(fā)明分離克隆的OsDR11基因由于選擇性剪接方式不同產(chǎn)生的OsDR11L轉(zhuǎn)錄本序列編碼的蛋白質(zhì)序列。

圖1：本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因OsDR11以及驗證OsDR11基因功能的流程圖。

圖2：OsDR11S和OsDR11L轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。圖中顯示為水稻品種明恢63中獲得的包含OsDR11基因、長3206bp的DNA片段。橫線表示內(nèi)含子，橫柱條表示外顯子，其中黑色部分代表編碼序列，白色部分代表非翻譯區(qū)；數(shù)字表示各個結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)或位置?！癆TG”和“TAG”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。

圖3：是本發(fā)明分離克隆的OsDR11基因的兩個轉(zhuǎn)錄本OsDR11S和OsDR11L在水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)的蛋白激酶的活性圖。圖3中的A圖是OsDR11S和OsDR11L在水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位圖。圖3中的B圖是OsDR11L轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白 質(zhì)具有蛋白激酶的活性。OsDR11L蛋白在加入γ-³²P-ATP后能使自身蛋白磷酸化。

圖4：是水稻不同組織中OsDR11S和OsDR11L的表達量檢測。圖4中的A圖是利用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測水稻不同組織中OsDR11S和OsDR11L的表達量。圖4中的B圖是用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測水稻接種白葉枯病菌PXO61后不同水稻品種或品系中OsDR11S和OsDR11L基因的表達量。圖中標(biāo)記：ck表示沒有任何處理的樣品(對照)，1、4、8、24、48、84、144為明恢63/珍汕97接種1小時、4小時、8小時、24小時、48小時、84小時、144小時后的樣品。2、4、8、12、24、48、72為牡丹江8/Rb49接種2小時、4小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時后的樣品。

圖5：是OsDR11S轉(zhuǎn)錄本在對照材料和T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株中的表達量及它們與植株病斑面積大小的關(guān)系檢測。圖5中的A圖是用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測OsDR11S轉(zhuǎn)錄本在對照材料(牡丹江8)和T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D35UM8)中的表達量以及它們與植株病斑面積大小的關(guān)系。圖5中的B圖是用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測OsDR11L轉(zhuǎn)錄本在對照材料(明恢63)和T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D229RM)中的表達量以及它們與植株病斑面積大小的關(guān)系。

圖6：是T₁代遺傳轉(zhuǎn)化家系接種白葉枯病菌兩周后的表型。圖6中的A圖是T₁代遺傳轉(zhuǎn)化家系D35UM8-33和D35UM8-54植株接種白葉枯病菌PXO99兩周后的表型。圖中標(biāo)記：“+”符號示陽性遺傳轉(zhuǎn)化植株，“-”符號示陰性遺傳轉(zhuǎn)化植株，牡丹江8是遺傳轉(zhuǎn)化的受體(對照)。圖6中的B圖是T₁代遺傳轉(zhuǎn)化家系D229RM7和D229RM7植株接種白葉枯病菌PXO99兩周后的表型。圖中標(biāo)記：“+”符號示陽性遺傳轉(zhuǎn)化植株，“-”符號示陰性遺傳轉(zhuǎn)化植株，明恢63是遺傳轉(zhuǎn)化的受體(對照)。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆OsDR11基因以及驗證OsDR11基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。

實施例1：分離克隆OsDR11基因和基因結(jié)構(gòu)分析

1.OsDR11兩個不同轉(zhuǎn)錄本的確定

在本發(fā)明的前期研究工作中，本發(fā)明人所在的作物遺傳改良國家重點實驗室采用cDNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)來源于水稻品種明恢63的cDNA克隆EI39C8在水稻品種明恢63接種白葉枯菌后表達量被誘導(dǎo)上升2.4-2.6倍(Zhou等，2002)。本發(fā)明的發(fā)明人對EI39C8克隆的插入片段測序后，以EI39C8的序列作為模板通過BLASTN方法，分析EI39C08插入序列， 發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物與擬南芥LAMMER蛋白激酶同源。而根據(jù)GenScan、FGENESH(http://www.softberry.com)以及ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)等軟件的預(yù)測結(jié)果，EI39C08包含完整的的cDNA片段。EI39C8與水稻品種日本晴12號染色體AP008218的一段序列(第16244777至16241534bp)的同源性為98％，與MSU Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中注冊號為LOC-Os12g27520的基因同源性為96％，這些結(jié)果提示cDNA克隆EI39C8對應(yīng)的水稻明恢63基因組序列位于水稻第十二染色體，是LOC-Os12g27520的等位基因，我們將其命名為OsDR11(Orazy sativa defense response gene 11)。

我們還發(fā)現(xiàn)Os12g27520基因具有選擇性剪接的現(xiàn)象。發(fā)明人檢索明恢63全生育期平衡化cDNA文庫(Chu et al.,2003)中發(fā)現(xiàn)OsDR11的另外一個cDNA克隆EI114F3也包含完整cDNA序列信息。通過Southern雜交的手段證明OsDR11在水稻基因組中是以單拷貝形式存在的，所以確認(rèn)這兩個不同的全長cDNA是由OsDR11通過不同的剪切方式產(chǎn)生的兩個不同的轉(zhuǎn)錄本，按照編碼產(chǎn)物的長短分別命名為OsDR11S和OsDR11L。

2.OsDR11基因結(jié)構(gòu)的確定

分別對EI39C8和EI114F3進行測序，得到OsDR11S和OsDR11L的cDNA序列，然后根據(jù)cDNA的序列以及OsDR11等位基因Os12g27520的序列設(shè)計引物，對水稻品種明恢63中的OsDR11基因進行PCR擴增并測序，使用到的引物為：39C8-GSP3(5′-AGCCGAGAGAGAGAGAAAGA-3′)、39C8-GSP2(5′-CTTTCCTTTCCCTATCCCAAC-3′)、39C8-8F(5′-GTCCCAGGAAATCCCTCGTT-3′)、83J4-2R(5′-CAGGCACTTTAATGTACTCCG-3′)、83J4-2F(5′-CGGAACTGGTTTGACTATCG-3′)、39C8-6R(5′-CTGCGGTAGCTTTGGTAACTC-3′)、39C8-3F(5′-TTGGATGGAGTTACCCCTGTG-3′)、39C8-1R(5′-CTGGATCCTCTTCTTCGCTCGGACTGCT-3′)，確定了OsDR11的基因組序列，共3206bp。

分析來源于秈稻明恢63的OsDR11的基因組序列(序列表SEQ ID NO：1)以及同樣來源于明恢63的OsDR11S的cDNA序列(序列表SEQ ID NO：2)，確定OsDR11S轉(zhuǎn)錄本由1435個核苷酸組成，編碼區(qū)包含5個外顯子及4個內(nèi)含子，3’非翻譯區(qū)(UTR)包含2個外顯子和1個外內(nèi)含子(圖2)。第一個外顯子由99個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1－99bp處)，第一個內(nèi)含子由683個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的100－782bp處)，第二個外顯子由163個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的783－945bp處)，第二個內(nèi)含子由111個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的946－1056bp處)，第三個外顯子由27個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1057－1083bp處)，第三個內(nèi)含子由120個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1084－1203bp處)，第四個外顯子由154個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1204－1357bp處)，第四個內(nèi)含子由776個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1358－2133bp處)，第五個外顯子由70個核苷酸組 成(位于序列表SEQ ID NO：1的2134－2203bp處)，第一段3’UTR由609個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2204－2812bp處)，第五個外內(nèi)含子由81個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2813－2893bp處)，第二段3’UTR由313個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2894－3206bp處)。

分析來源于秈稻明恢63的OsDR11的基因組序列(序列表SEQ ID NO：1)以及同樣來源于明恢63的OsDR11L的cDNA序列(序列表SEQ ID NO：3)，確定OsDR11L轉(zhuǎn)錄本由1404個核苷酸組成，編碼區(qū)包含10個外顯子及9個內(nèi)含子，3’UTR包含2個外顯子和1個外內(nèi)含子(圖2)。第一個外顯子由99個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1－99bp處)，第一個內(nèi)含子由683個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的100－782bp處)，第二個外顯子由163個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的783－945bp處)，第二個內(nèi)含子由111個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的946－1056bp處)，第三個外顯子由27個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1057－1083bp處)，第三個內(nèi)含子由120個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1084－1203bp處)，第四個外顯子由154個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1204－1357bp處)，第四個內(nèi)含子由107個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1358－1464bp處)，第五個外顯子由49個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1465－1513bp處)，第五個內(nèi)含子由96個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1514－1609bp處)，第六個外顯子由115個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1610－1724bp處)，第六個內(nèi)含子由192個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1725－1916bp處)，第七個外顯子由92個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的1917－2008bp處)，第七個內(nèi)含子由125個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2009－2133bp處)，第八個外顯子由157個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2134－2290bp處)，第八個內(nèi)含子由83個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2291－2373bp處)，第九個外顯子由65個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2374－2438bp處)，第九個內(nèi)含子由79個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2439－2517bp處)，第十個外顯子由192個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2518－2709bp處)，第一段3’UTR由103個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2710－2812bp處)，第十個外內(nèi)含子由81個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2813－2893bp處)，第二段3’UTR由188個核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO：1的2894－3081bp處)。

實施例2：OsDR11基因編碼產(chǎn)物的分析

1.OsDR11基因編碼產(chǎn)物亞細(xì)胞定位分析

在OsDR11的氨基端與其他家族成員一樣具有核定位序列，預(yù)示著OsDR11S和OsDR11L可能都是定位于細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。以cDNA克隆EI39C8，用39C8-4F4(5′-ATTCTAGAATGGAGTGCTTGGCCGAGAT-3′)和39R-XBA1(5′-CTTCTAGACCTTAATAGCACTGGACTTG-3′)擴增OsDR11S全長cDNA，通過XbaⅠ單酶切 后連接到pM999-YFP載體上，挑取陽性單克隆測序驗證，構(gòu)建OsDR11S亞細(xì)胞定位載體。以cDNA克隆EI114F3為模板，用39C8-4F4(5′-ATTCTAGAATGGAGTGCTTGGCCGAGAT-3′)和F3R-XBA1(5′-CTTCTAGACATACAAGCAACAAATGAGC-3′)通過PCR擴增出外源片段，通過XbaⅠ單酶切后連接到pM999-YFP載體上，挑取陽性單克隆測序驗證，構(gòu)建OsDR11L亞細(xì)胞定位載體。

將水稻種子進行表面消毒后放于MS培養(yǎng)基上，生長至2葉期時切取水稻小苗的葉鞘段，用鋒利的刀片將其切成0.5厘米的小段置于0.6M的甘露醇中，將組織轉(zhuǎn)入酶解液中(0.6M甘露醇，10mM pH值為5.7的MES，1.5％的纖維素酶RS，0.75％果膠酶，0.1％BSA，1mM CaCl₂，50μg/mL的羧芐青霉素)避光于28℃搖床40轉(zhuǎn)/分鐘慢速搖晃4-5小時。然后80轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖30分鐘使原生質(zhì)體釋放。慢慢加入W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM pH值為5.7的MES)20mL，液體過35μm孔徑的尼龍膜布。室溫100g離心5分鐘，用槍小心吸出上清，再加入30mL W5小心洗滌沉淀，100g離心5分鐘收集。加入預(yù)冷的MMG溶液(0.6M甘露醇，15mM MgCl₂，4mM pH值為5.7的MES)懸浮原生質(zhì)體，在冰上放置30分鐘。將10μg的質(zhì)粒DNA加入一個2mL的圓底離心管，再加入100μL上述制備的原生質(zhì)體中，加入110μL PEG-CaCl₂，輕輕混勻在室溫孵育20分鐘。加入440μL W5溶液停止轉(zhuǎn)化。100g離心3分鐘后棄上清，加入1mL WI溶液(0.6M甘露醇，4mM KCl，4mM pH5.7的MES)重懸原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)入平板黑暗培養(yǎng)12-24小時后用共聚焦熒光顯微鏡(Leica，德國)進行觀察照相。

本研究發(fā)明人將將融合了YFP的LAMMER蛋白和融合了CFP的GHD7蛋白用水稻原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化的方法(Cheng et al.,2015)共轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中，對其進行亞細(xì)胞的定位。GHD7是一個已經(jīng)證實定位在細(xì)胞核內(nèi)的基因(Xue等，2008)，所以我們將Ghd7-PM999-CFP作為核定位的標(biāo)記。實驗結(jié)果顯示PM999-YFP空載體單獨轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，其黃色熒光可以在在細(xì)胞中的分布沒有特異性，而轉(zhuǎn)化OsDR11S-PM999-YFP和OsDR11L-PM999-YFP的原生質(zhì)體中，產(chǎn)生的黃色熒光與融合CFP的GHD7蛋白產(chǎn)生的青色熒光完全重疊，非常特異的分布在細(xì)胞核中。這說明OsDR11S和OsDR11L都是分布在細(xì)胞核內(nèi)的(見圖3中的A圖)。由此證實OsDR11S和OsDR11L是細(xì)胞核蛋白質(zhì)，它們都在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

2.OsDR11基因編碼產(chǎn)物蛋白激酶活性分析

序列分析顯示OsDR11屬于LAMMER蛋白激酶，而LAMMER家族的特征就是蛋白的激酶區(qū)有一個非常保守的“LAMMER”結(jié)構(gòu)域，OsDR11S編碼一個由170個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(序列表SEQ ID NO：1)，而OsDR11L編碼一個由370個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(序列表SEQ ID NO：2)。通過PROSITE(ScanProsite Results Viewer，http://prosite.expasy.org/prosite.html)預(yù)測OsDR11蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)OsDR11第88-370位氨基酸為蛋白激酶區(qū)，94-102位同樣為核苷酸磷酸酯結(jié)合區(qū)域(NP_BIND)，117位氨基酸賴 氨酸為ATP結(jié)合位點，同時OsDR11在213位氨基酸天冬氨酸是質(zhì)子接受位點(proton acceptor)。這些結(jié)構(gòu)預(yù)示了OsDR11有可能具有蛋白激酶活性。

為了驗證這一推測，本發(fā)明采用Shen等(2010)方法，在大腸桿菌中表達OsDR11S和OsDR11L蛋白，分離純化OsDR11蛋白用于酶活性分析。具體操作如下：以cDNA克隆EI39C8，用39C8-4F2(5’-CTGGATCCATGGAGTGCTTGGCCGAGAT-3’)和39C8pmalR-BamH1(5′-CTGGATCCTCACCTTAATAGCACTGGAC-3′)擴增OsDR11S全長CDS，通過BamHⅠ單酶切后連接到pMAL-C2X載體上，挑取陽性單克隆測序驗證。構(gòu)建OsDR11S原核表達載體。以cDNA克隆EI114F03為模板，用39C8-4F2和expF3-2R(5’-ATGTCGACCTACATACAAGCAACAAAT-3’)擴增OsDR11L全長CDS。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ消化后與經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ酶切后純化的載體pGBKT7(美國Clontech公司)做連接反應(yīng)。通過酶切篩選陽性克隆，再經(jīng)測序驗證有無核苷酸突變。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ消化帶有OsDR11基因的編碼區(qū)段的陽性克隆和pMAL-C2X載體(德國Novagen公司)，通過酶切及測序驗證陽性克隆，構(gòu)建OsDR11L原核表達載體。將獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，本實施例所用電壓為1800V，具體操作參考該儀器的使用說明書)進入大腸桿菌表達用宿主菌株BL21(DE3)(德國Novagen公司)進行原核表達。將pMAL-C2X空載體也導(dǎo)入BL21(DE3)作為對照。挑取單克隆培養(yǎng)12h，1:100擴大培養(yǎng)2－3h，待其OD值達到0.5，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)到終濃度1mM/L，誘導(dǎo)5h，收集菌體，表達蛋白的純化用麥芽糖親和樹脂Amylose Resin(New England Biolabs，北京)，操作參照說明書。OsDR11蛋白激酶反應(yīng)程序參照前人的方法(Shen等，2010)。具體操作如下：帶有MBP標(biāo)簽的OsDR11L和OsDR11S重組蛋白被用于自磷酸化活性的檢測，以空載體表達出的MBP蛋白作為對照。反應(yīng)緩沖液為20μL體系，包括50mM Tris-HCl，pH 7.5的10mM MgCl₂，10mM MnCl₂和0.3μCiγ-³²P-ATP。純化后的重組蛋白在此緩沖液中室溫反應(yīng)30分鐘后加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液與95℃變性10分鐘，在10-12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后取膠塊壓X光片自顯影檢測自磷酸化活性。結(jié)果顯示：OsDR11L融合蛋白具有自磷酸化活性，因為磷酸化而偶聯(lián)上了帶有放射性的³²P，因此在自身蛋白大小的地方通過放射自顯影能出現(xiàn)條帶(見圖3中的B圖)。

實施例3：OsDR11基因的表達模式分析

1.OsDR11兩個不同轉(zhuǎn)錄本的在水稻組織中的表達模式分析

用秈稻品種明恢63在不同時期不同組織中的RNA樣品，包括愈傷組織，兩分蘗期的根和葉，孕穗期的葉、葉鞘和幼穗、抽穗期的劍葉和穗、揚花期的雄蕊和雌蕊，通過反轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR的方法檢測其表達情況(見圖4中的A圖)。實驗結(jié)果證實兩個轉(zhuǎn)錄本在水稻的各個生育期的不同組織中都有表達，在孕穗期的葉片、葉鞘以及揚花期的配子中表達較高，OsDR11S在成熟的營養(yǎng)器官比如葉片以及葉鞘中表達量較高，而OsDR11L則在幼嫩的營養(yǎng)器官比如愈傷組織以及生殖器官中表達量較OsDR11S更為豐富。地上部分的表達量差異 說明它們可能有著不同的生物學(xué)功能。

2.OsDR11兩個不同轉(zhuǎn)錄本的在不同水稻品種中的表達模式分析

為了證實OsDR11基因是否參于抗病反應(yīng)的調(diào)控，本發(fā)明采用定量RT－PCR(quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR)技術(shù)(Qiu等，2007)分析了OsDR11基因在不同水稻品種中接種白葉枯病菌株P(guān)XO61(菲律賓生理小種1)(Sun等，2004)后的表達模式。白葉枯病菌接種采用剪葉法對成株期的水稻進行接種(Sun等，2004)。白葉枯病菌菌株P(guān)XO61由菲律賓國際水稻研究所惠贈(Sun等，2004)。白葉枯病菌的培養(yǎng)遵循已經(jīng)公開發(fā)表的方法(Sun等，2004)。接種后分不同時間點取接種葉片抽提總RNA(Zhou等，2002)。取5μg總RNA用DNaseI(美國Invitrogen公司)處理15分鐘以去除基因組DNA污染，然后參照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)進行反轉(zhuǎn)錄。采用實時定量PCR分析試劑盒Green PCR Master Mix(大連Tokara公司)、并根據(jù)試劑盒使用說明書，在ABI 7500Real-Time PCR system(美國Applied Biosystems公司)儀器上進行實時定量PCR反應(yīng)。用水稻內(nèi)源肌動蛋白(actin)基因的表達量衡量、并均一化樣品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的OsDR11S特異PCR引物是39C8-6F(5′-GAATGTTGGGATAGGGAAAGG-3′)和39C8-7R(5′-ACGGGATGAAACCTGGATCTAC-3′)，OsDR11L特異PCR引物是83J4-2F(5′-CGGAACTGGTTTGACTATCG-3′)和83J4-2R(5′-CAGGCACTTTAATGTACTCCG-3′)，肌動蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

利用明恢63/珍汕97和牡丹江8/Rb49接種PXO61后時間點的兩套材料來系統(tǒng)的檢測了OsDR11S和OsDR11L在受到病原誘導(dǎo)以后的表達情況。明恢63是攜帶抗白葉枯病主效基因Xa25(t)和Xa26的抗病水稻品種(Chen等，2003；Sun等，2004)，RB11是攜帶抗白葉枯病主效基因Xa3/Xa26的抗病水稻品種(Cao等，2007)，珍汕97和牡丹江8是不攜帶任何抗病基因的感病水稻品種。實驗結(jié)果顯示OsDR11S在感病材料和抗病材料中都受到了病原菌的誘導(dǎo)上升表達，并且在抗病品種中較感病品種中的表達量高。而OsDR11L則僅在感病材料中誘導(dǎo)上升，在抗病品種中有所下降，并且在感病品種中的表達量高于抗病品種。這些結(jié)果說明OsDR11S和OsDR11L可能都參與到水稻-白葉枯病的互作中，調(diào)控這兩個轉(zhuǎn)錄本的表達可能可以提高水稻的抗病性(見圖4中的B圖)。

實施例4：OsDR11基因的功能驗證

1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

將實施例1所述的包含OsDR11S完整編碼序列的cDNA克隆EI39C8,利用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI消化，然后用BamHI和KpnI消化超量表達轉(zhuǎn)化載體pU1301。pU1301是常用的水稻遺傳轉(zhuǎn)化載體(Cao等，2007；Qiu等，2007；Ding等，2008)，它是攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米泛素基因啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體。酶切完畢，用氯仿： 異戊醇(體積比24：1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含OsDR11S的酶切回收片段和純化好的載體做連接反應(yīng)。構(gòu)建了OsDR11S的超表達載體，通過測序驗證陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為D35U。

將實施例一所述的包含完整OsDR11L編碼序列的cDNA的文庫質(zhì)粒EI114F3中，用引物F3DSF1732(5′-AGACTAGTGGTACCTTGTGTTCAAATTCGGAACTGG-3′)和F3DSF2253(5′-CGGAGCTCGGATCCTTTGTAATCAGGCACTTTAATG-3′)通過PCR擴增出抑制片段，將該片段通過BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切后連入載體pDS1301。pDS1301是常用的水稻遺傳轉(zhuǎn)化RNAi載體(Cao等，2007)，該載體攜帶具有組成型表達的花椰菜花葉病毒啟動子，能夠組成性抑制目標(biāo)基因的表達。再用SacⅠ和SpeⅠ分別雙酶切外源片段和連入第一鏈的pDS1301載體，回收后將上述兩個酶切產(chǎn)物用T4-DNA連接酶連接。篩選陽性克隆測序驗證并命名為D229R。

2.分析T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，2005)將D35U導(dǎo)入水稻品種牡丹江8。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D35UM8(其中D35U為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，M8代表水稻品種牡丹江8)。本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)化植株43株，用遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301上的特異PCR引物GUS-2F(5′-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3′)和GUS-2R(5′-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACCG-3′)檢測陽性植株。對轉(zhuǎn)化植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)XO99(菌株P(guān)XO99由菲律賓國際水稻研究所惠贈，Sun等，2004)，在鑒定的21株D35UM8基因植株中有10株顯著提高了對白葉枯菌PXO99抗性(P<0.05)，病斑面積范圍從14％-39％，而野生型轉(zhuǎn)化受體牡丹江8植株病斑面積是60％(表1)。為進一步驗證遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗病能力增強是否與OsDR11S基因表達量相關(guān)，本發(fā)明采用Northern分析OsDR11S基因表達量，實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中OsDR11S基因的表達量變化與植株的病斑面積呈極顯著相關(guān)(見圖5中的A圖)。該結(jié)果說明OsDR11S的編碼產(chǎn)物可能在水稻抗白葉枯病反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控因子的作用，超量水稻中OsDR11S基因的表達，可能增強水稻對白葉枯病的抗性。

表1.T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D35UM8)對白葉枯病菌株P(guān)XO99的反應(yīng)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將D229R導(dǎo)入水稻品種明恢63。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D229RM(其中D229R為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，M代表水稻品種明恢63)。本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)化植株12株，用遺傳轉(zhuǎn)化載體pDS1301上的特異PCR引物pMCG-f(5′-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3′)和pMCG-r(5′-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3′)檢測陽性植株。對全部轉(zhuǎn)化植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)XO99，與對照明恢63相比及遺傳轉(zhuǎn)化陰性植株相比10株陽性遺傳轉(zhuǎn)化植株中的7株的抗性顯著增強(表2)。為進一步驗證遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗病能力增強是否與OsDR11L表達量相關(guān)，本發(fā)明采用上述實時定量RT-PCR方法檢測了其中12株T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株中OsDR11L基因的表達量。實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中OsDR11L的表達量變化與植株的病斑面積呈極顯著負(fù)相關(guān)(圖5中的B圖)。該結(jié)果說明OsDR11L的編碼產(chǎn)物可能在水稻抗白葉枯病反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控因子的作用；抑制水稻中OsDR11基因的表達，可能增強水稻對白葉枯病的抗性。

表2.T₀代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D229RM)對白葉枯病菌株P(guān)XO99的反應(yīng)

3.遺傳轉(zhuǎn)化植株的共分離分析

為了進一步驗證上述推測，對OsDR11S超量的T₁代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D35UM8-33和D35UM8-54)的進行分析。接種調(diào)查和Realtime-PCR的結(jié)果表明，所有T₁家系單株的抗性 增強與OsDR11S的超量表達水平變化表現(xiàn)共分離(見圖6中的A圖和表3)。說明遺傳轉(zhuǎn)化植株抗病表型與轉(zhuǎn)入的超表達的OsDR11S共分離，進一步證明超表達OsDR11S可增強水稻抗病性。

表3.T₁代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D35UM8)對白葉枯病菌株P(guān)XO99的反應(yīng)

另外，本研究發(fā)明人對OsDR11L抑制的T₁代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D229RM-7和D229RM-8)的T₁代家系進行分析。接種調(diào)查和Realtime-PCR的結(jié)果表明，所有T₁家系單株的抗性增強與OsDR11L的抑制表達水平變化表現(xiàn)共分離(圖6中的B圖，表4)。說明遺傳轉(zhuǎn)化植株抗 病表型與轉(zhuǎn)入的抑制表達的OsDR11L共分離，進一步證明抑制表達OsDR11L可增強水稻抗病性。

表4.T₁代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D229RM)對白葉枯病菌株P(guān)XO99的反應(yīng)

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