本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及抗人IL-17的單克隆抗體的領(lǐng)域。更具體說，本發(fā)明涉及單克隆抗體-IL-17A拮抗劑，其與IL-17抗原表位高親和力結(jié)合；本文的抗體在重鏈和輕鏈的高變區(qū)包含氨基酸取代。本發(fā)明的抗體可以是嵌合的、人源化的或人抗體或其抗原結(jié)合片段，而且可用作藥物用于治療自身免疫和炎癥性紊亂或細(xì)胞增殖和發(fā)育異常。本發(fā)明還涉及所述抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
：免疫系統(tǒng)的主要功能是保護(hù)機(jī)體免受感染(例如，病毒或細(xì)菌)和惡性腫瘤。該系統(tǒng)涉及幾種淋巴和骨髓細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，T-細(xì)胞，B-細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。這些淋巴和骨髓細(xì)胞可誘導(dǎo)被稱為細(xì)胞因子的信號蛋白。炎癥是免疫應(yīng)答的一部分，其導(dǎo)致免疫細(xì)胞的積累，全身性的或者集中在機(jī)體中的某些部分。當(dāng)對任何外源物質(zhì)的感染產(chǎn)生應(yīng)答時，免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，其以它們的順序，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化和遷移。免疫應(yīng)答能誘導(dǎo)各種病理過程，例如，如果正好發(fā)生自身免疫疾病，它引發(fā)過度炎癥(ref.Abbasetal.(eds.)(2000)CellularandMolecularImmunology,W.B.SaundersCo.,Philadelphia,Pa.；OppenheimandFeldmann(eds.)(2001)CytokineReference,AcademicPress,SanDiego,Calif.；vonAndrianandMackay(2000)NewEngl.J.Med.343:1020-1034；DavidsonandDiamond(2001)NewEngl.J.Med.345:340-350)。目前IL-17家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。IL-17家族的所有成員都具有4個高度保守的半胱氨酸殘基，其涉及鏈內(nèi)二硫鍵的形成，和2個或多個也可能涉及的半胱氨酸殘基。IL-17家族的成員與其它已知半胱氨酸的序列沒有相似性。白細(xì)胞介素-17A(IL-17A，也稱為細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-8(CTLA-8)，IL-17)，是一個20-30kDa的同型二聚體細(xì)胞因子，其由具有以下抗原識別的記憶性T-細(xì)胞產(chǎn)生。白細(xì)胞介素-23(IL-23)促進(jìn)這些T-細(xì)胞的生長(McKenzieetal.(2006)TrendsImmunol.27(1):17-23；Langrishetal.(2005)J.Exp.Med.201(2):233-40)。IL-17A通過兩個受體(IL-17RA和IL-17RC)發(fā)揮作用，啟動涉及具有嗜中性粒細(xì)胞的過程、炎癥性過程和器官損傷的許多分子。該細(xì)胞因子是與腫瘤壞死因子(TNF)或白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)協(xié)同作用的，以獲得更顯著的抗炎作用。在許多炎癥的治療中，免疫和增殖疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān)節(jié)炎、患有RA的患者中的骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性纖維化(包括硬皮病、肺纖維化和肝硬化)、齒齦炎、牙周炎或牙周疾病、炎性腸病(例如，克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和炎性腸病)、哮喘(包括變應(yīng)性哮喘)、變態(tài)反應(yīng)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、癌癥，以及其它疾病，其通過阻斷所述受體的抗體或結(jié)合抗原的抗體片段企圖降低IL-17A的活性(例如，參見US2003/0166862,WO2005/108616,WO2005/051422和WO2006/013107)。目前，開發(fā)了幾種抗IL-17抗體，包括AIN457(AbbottLaboratories的secukinumab)、LY2439821(EliLilly的Ixekizumab)、SCH900117(Merck)和RG4943(Roche)，等等。例如，美國專利申請?zhí)朥S2010/0245666描述了在重鏈或輕鏈的一個CDR區(qū)含有氨基酸取代的抗IL-17抗體(secukinumab，AIN457)。該抗體與IL-17是高親和力的，其解離常數(shù)KD為約122μМ。該申請還公開了使用所述抗體抑制IL-17與合適的抗體結(jié)合，尤其用于治療眼色素層炎。目前，所述抗體在進(jìn)行治療RA、強(qiáng)直性脊柱關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、牛皮癬、多發(fā)性硬化和臭氧誘導(dǎo)的中性白細(xì)胞增多癥的臨床試驗(yàn)。該抗體顯示是安全的，而且在患有RA的患者中顯示46％的功效(Durezetal.,CommunicationEULAR2009-RA)?，F(xiàn)有知識也已經(jīng)公開了抗IL-17的人源化抗體，如WO2007/070750公開的國際申請中描述的(LY2439821，ixekizumab，EliLilly)。所述抗體含有氨基酸取代的重鏈和輕鏈可變區(qū)。于是，所述抗體與人IL-17是高親和力的(KD低于約7.0-4.0pM)，而且對人IL-17的koff指數(shù)<2×10-5sec-1?？贵w在對患有RA的個體中進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥的安全性、耐受力和功效的臨床研究。(Genoevseetal.,CommunicationEULAR2009-RA；Genoevseetal.,Arthritis&Rheumatism,62:929-39,(2010)。現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)有關(guān)于其它抗IL-17抗體的信息：鼠抗人中和性抗體eBio64CAP17(eBioscience)及其衍生物。專利申請US2009/0175881A1和US2008/0269467A1，以及國際公布WO2008/001063A1和WO2007/117749A1中公開了其它的抗IL-17抗體的實(shí)例。因此，考慮到它在炎癥區(qū)域內(nèi)的局部擴(kuò)張，IL-17是一種炎癥和自身免疫疾病治療中的新的靶點(diǎn)，其藥物安全性可能高于靶向系統(tǒng)循環(huán)促炎性細(xì)胞因子如TNF(腫瘤壞死因子)的藥物?；谝陨纤觯梢缘贸鼋Y(jié)論，存在需要具有拮抗或中和IL-17A活性的抗體的需求，其用于治療IL-17A的生物學(xué)活性導(dǎo)致或促進(jìn)不利的生理學(xué)結(jié)果的疾病和狀況，或者IL-17生物學(xué)活性的降低促進(jìn)需要的治療結(jié)果的疾病和狀況，包括炎癥性紊亂，細(xì)胞增殖和發(fā)育紊亂，自身免疫病理學(xué)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎癥性腸病(IBD)。使用這些抗體作為藥劑的最大限制是由于它們的免疫原性和親和力。由于大部分單克隆抗體是在鼠抗體的基礎(chǔ)上獲得的，這些抗體在人類中的常規(guī)應(yīng)用導(dǎo)致對抗體治療的免疫應(yīng)答的發(fā)展(例如，過敏反應(yīng))。這些類型的免疫應(yīng)答最終至少導(dǎo)致缺乏功效，以及最差的情況下可能的過敏性反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了具有氨基酸取代的抗IL-17抗體，其中要求保護(hù)的抗體具有高親和力，改善的溶解性和增加的IC50。附圖說明圖1：獲得的PhoretogramIL-17A蛋白溶液。圖2：獲得的PhoretogramIL-17A-Fc蛋白溶液。圖3：還原(A)和非還原(B)條件下在12％SDS-PAGE溶液中的凝膠電泳。圖4：合成美洲駝組合抗體Fab文庫的流程圖。圖5：用于克隆噬菌體展示Fab文庫的噬菌粒。圖6：合成雜合組合抗體Fab文庫的流程圖。圖7：合成雜合組合抗體Fab文庫的流程圖。圖8：可變區(qū)池的合并。圖9：特異性抗人IL-17Fab的ELISA篩選。圖10：阻斷IL-17A/IL-17R相互作用的Fab候選物的競爭性ELISA篩選。圖11：抗IL-17A人Fab候選物的koff篩選的結(jié)果。圖12：BCD085溶液的電泳圖。圖13：純化的BCD085的HPLC圖。圖14：相較于AIN457，BCD085的IL-6抑制活性。圖15：BCD085與人IL-17的相互作用曲線。圖16：BCD085與猴IL-17(Macacamulatta)的相互作用曲線。圖17：在熱壓后獲得的BCD085抗體的色譜圖。圖18：以40mg/kg的劑量，單次皮下給藥給獼猴(Macacamulatta)后的抗IL-17ABCD085抗體的藥物動力學(xué)模式。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：術(shù)語定義“白細(xì)胞介素17”，也稱為“IL-17”或“IL-17A”，是一種20-30kD的同型二聚體糖蛋白。人IL-17的基因編碼由155個氨基酸組成的蛋白，且該蛋白具有19個氨基酸信號序列和136個氨基酸成熟片段。以它的天然狀態(tài)存在時，全長抗體由4條肽鏈組成的免疫球蛋白(抗體)分子表示：用二硫鍵連接的2條重(H)鏈(大約50-70kD全長)和2條輕(L)鏈(大約25kD全長)。每條鏈的氨基末端區(qū)域包括大約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識別。每條鏈的羧基末端區(qū)域決定主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)?？贵w包括輕鏈和重鏈。重鏈和輕鏈的可變區(qū)形成抗原結(jié)合中心(位點(diǎn))。抗體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)如下。輕鏈分為kappa和lambda，而且具有特異性恒定區(qū)。每條輕鏈的特征在于包括可變的N-末端輕鏈區(qū)(本文稱為LCVR或VL)和由單個功能域組成的恒定的輕鏈區(qū)(CL)。重鏈區(qū)分為γ、δ、α、μ和ε，而且限定免疫球蛋白種類分別為：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE；它們中的一些可以另外劃分為亞類(同型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每種重鏈類型的特征在于特異性的恒定區(qū)Fc。每條重鏈包括可變的N-末端區(qū)(本文稱為HCVR或VH)和恒定區(qū)CH。恒定的重鏈區(qū)由針對IgG、IgD和IgA的3個功能域(CH1、CH2和СН3)和針對IgM和IgE的4個功能域(CH1、CH2、СН3和СН4)組成。HCVR和LCVR也可以劃分為所謂的高變區(qū)Rf(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)，其被多個保守框架區(qū)(FR)打斷。每個HCVR和LCVR都包括從N-末端到C-末端以下列順序定位的3個CDR和FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。本申請中3條重鏈CDR稱為CDRH1、CDRH2和CDRH3，同時3條輕鏈CDR稱為CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDR含有與抗原特異性相互作用的大部分氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，除非另有說明，按照Kabat編碼制對HCVR和LCVR中的CDR殘基進(jìn)行計(jì)數(shù)和定位。除非另有說明，本申請包括用于氨基酸的常用字母密碼子。術(shù)語“抗IL-17A抗體”、“抗IL-17的抗體”、“特異性結(jié)合白細(xì)胞介素IL-17的抗體”和“抗IL-17A的抗體”在本文中可以互換使用，而且涉及特異性結(jié)合IL-17A的抗體。如本文中使用的，與本發(fā)明的抗IL-17A單克隆抗體相關(guān)的術(shù)語“抗體”(或以簡單的形式：“根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體”)，涉及單克隆抗體。除非本申請中另有說明，如本文中使用的，“單克隆抗體”涉及獲自嚙齒類動物、靈長類動物或駱駝科家族的抗體，優(yōu)選涉及鼠、猴、駱駝或美洲駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)已知的雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)、噬菌體展示(phagedisplay)技術(shù)、合成技術(shù)或這些技術(shù)的組合或者現(xiàn)有技術(shù)熟知的其它技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體。如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)的方式獲得的抗體?！皢慰寺】贵w”涉及從單個復(fù)制或克隆，包括：例如，任何真核生物、原核生物或噬菌體獲得的抗體?！皢慰寺】贵w”可以是完整的抗體(具有全部的或全長Fc區(qū))、實(shí)際上完整的抗體、包括抗原結(jié)合區(qū)的抗體部分或片段，例如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’片段或F(ab')2-片段。“Fab”片段包括輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)以及重鏈可變區(qū)和第一重鏈恒定區(qū)(СН1)。“F(ab')2”抗體片段包括一對Fab片段，其主要通過位于C-末端區(qū)域的鉸鏈氨基酸共價結(jié)合。Fv是可變的抗體片段；scFv(單鏈Fv)是抗體的可變片段，其中重鏈和輕鏈片段通過短的接頭肽連接；(scFv)2-片段包括用二硫鍵連接的兩個scFv分子；dsFv-可變片段用另外的分子內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定?？贵w片段之間的其它化學(xué)鍵也是本領(lǐng)域狀態(tài)下熟知的。本文中術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”可以互換使用。每個輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，如本文中使用的，“抗原結(jié)合區(qū)”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”或“抗原結(jié)合功能域”或“抗原結(jié)合中心”可以互換使用，是指包括與抗原相互作用的氨基酸殘基、并且賦予抗體對抗原的特異性和親和力的抗體區(qū)域?？贵w片段包括保持抗原結(jié)合殘基的正確構(gòu)象必需的框架氨基酸殘基。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合區(qū)或整個抗原結(jié)合位點(diǎn)的CDR來源于人類文庫或基本上人類來源的，而且具有改變的特異性氨基酸殘基，例如，用不同的氨基酸殘基取代以便改善抗體的特定特性(例如，它的KD、Koff和IC50)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體框架區(qū)是人類來源的或者基本上人類來源的(至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％人類來源的)。本發(fā)明抗體的優(yōu)選框架區(qū)具有相應(yīng)于人抗體的框架區(qū)的氨基酸序列：重鏈可變區(qū)FR1QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAADGFR2WVRQAPGKGLEWVSFR3RFTISRDDAKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCFR4WGQGTLVTVSS輕鏈可變區(qū)FR1QSVLTQPPSVSVAPGKTVTISCFR2WYQHLPGTAPKLLIYFR3GVPDRFSGSQSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFR4FGGGTKLTVLGQ在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗IL-17抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以來源于其它的非人物種，包括但不限于，兔、老鼠和倉鼠，或者來源于人類物種。此外，本發(fā)明的“單克隆抗體”可以由單鏈Fv片段表示，其可以通過連接編碼LCVR-和HCVR-的DNA與接頭序列獲得(參見Pluckthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,p.269-315,1994)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“抗體”包括這樣的片段或部分以及單鏈形式。只要蛋白保留它特異性或優(yōu)選結(jié)合靶(例如，抗原表位或抗原)的能力，它都包括在術(shù)語“抗體”中?？贵w可以是糖基化的或非糖基化的，都屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中使用的，“單克隆抗體”的群體，指同源的或基本同源的抗體群體(也即，群體中抗體的至少約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％，但是更優(yōu)選不低于約97％或98％，或者進(jìn)一步優(yōu)選至少99％將在ELISA中競爭相同的抗原/抗原表位，或者考慮到它們的氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選抗體是相同的)?？贵w可以是糖基化的或者非糖基化的，都是屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果它們具有相同的氨基酸序列，單克隆抗體就是同源的，但是它們的翻譯后修飾可以不同(例如，糖基化模式)。如本文使用的，抗體“變體”指一種分子，其氨基酸序列通過添加、缺失和/或取代親本抗體序列中的一個或多個氨基酸殘基而不同于親本序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體含有親本抗體的CDR區(qū)中的至少一個(例如，從1到約10，優(yōu)選2、3、4、5、6、7或8)氨基酸插入、缺失和/或取代?？紤]到變體抗體的序列，本申請限定同一性或同源性為變體抗體序列中的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，其等于序列比對后親本抗體中的殘基數(shù)，而且如果需要，切斷以獲得最大的百分?jǐn)?shù)相同序列。變體抗體保留它與親本抗體結(jié)合的相同抗原或者優(yōu)選抗原表位結(jié)合的能力，或者優(yōu)選顯示超過親本抗體的至少一種特性或生物學(xué)活性。例如，相較于親本抗體，該抗體優(yōu)選具有更強(qiáng)的親和力、更長的半衰期、更低的IC50或增強(qiáng)的抑制抗原活性的能力。本申請?zhí)貏e感興趣的變體抗體是，當(dāng)與親本抗體比較時，顯示活性增加至少2倍，優(yōu)選至少5倍、10倍或20倍的抗體。如本文中使用的，“親本”抗體指用于產(chǎn)生變體的氨基酸序列編碼的抗體。親本抗體可以具有來源于羊駝(lamaglama)的框架序列，而且優(yōu)選該框架序列是完全或基本上人類來源的。親本抗體可以來自美洲駝、嵌合的、人源化或人類?？梢允褂酶鞣N工程技術(shù)制備本發(fā)明的抗體，包括重組方法，如各種來源的DNA改組。如本文中使用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”指這種情況，其中涉及特異性結(jié)合過程的一方?jīng)]有顯著結(jié)合除了它的特異性結(jié)合伴侶(partners)以外的分子。該術(shù)語也適用，如果，例如，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)對特定的抗原表位是特異性的，該抗原表位由許多抗原攜帶；在這種情況下，具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性抗體將能特異性結(jié)合攜帶不同抗原表位的抗原。因此，本發(fā)明的單克隆抗體特異性結(jié)合人IL-17(IL-17A)，但是它不特異性結(jié)合人IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-7E和IL-17F。如本文中使用的，術(shù)語“抗原表位”指可以通過抗體的一個或幾個抗原結(jié)合位點(diǎn)識別并結(jié)合的分子部分?？乖砦怀３０肿拥幕瘜W(xué)表面活性基團(tuán)，如：氨基酸或糖側(cè)鏈，并具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特異性的電荷特性。“抑制抗原表位”和/或“中和抗原表位”指，當(dāng)在完整抗原分子和結(jié)合所述抗原表位特異性的抗體的上下文中，導(dǎo)致體內(nèi)或體外喪失或降低的分子或含有該分子的生物體的活性的抗原表位。如本文中使用的，術(shù)語“抗原表位”還指在動物，優(yōu)選在哺乳動物，如：老鼠和人體中具有抗原性和/或免疫原性活性的多肽片段。如本文中使用的，術(shù)語“抗原性表位”是能特異性結(jié)合抗體，而且能通過現(xiàn)有技術(shù)熟知的任何技術(shù)(例如，通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫測定方法)檢測的多肽片段?？乖砦徊皇敲庖咴员匦璧模撬鼈兛删哂忻庖咴?。如本文中使用的，“免疫原性表位”限定為在動物中引起抗體應(yīng)答的多肽片段，如通過現(xiàn)有技術(shù)的任何方法測定的。“非線性表位”或“構(gòu)象性表位”包含與抗原表位特異性抗體結(jié)合的抗原蛋白內(nèi)的不相鄰多肽(氨基酸)。如本文中使用的，涉及本發(fā)明抗體的術(shù)語“生物學(xué)特性”、“生物學(xué)特征”、“活性”和“生物學(xué)活性”是可以互換使用的，而且包括但不限于：抗原表位/抗原親和力和特異性；體內(nèi)或體外的和IL-17的能力或者是IL-17拮抗劑的IC50；抗體穩(wěn)定性和抗體的體內(nèi)免疫原性。從現(xiàn)有技術(shù)鑒定的其它生物學(xué)特性或抗體特性包括：例如，交叉反應(yīng)性(與靶肽的非人同源物或其它蛋白或靶的反應(yīng))和在哺乳動物細(xì)胞中保持高的蛋白表達(dá)水平的能力?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公認(rèn)的方法觀察、測定或評估上述特性或特征，這些方法包括但不限于：ELISA、競爭性ELISABIACORE表面胞質(zhì)基因共振或KINEXA、體外或體內(nèi)非限制性的中和分析、受體結(jié)合、細(xì)胞因子或生長因子的產(chǎn)生和/或釋放、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和從各種來源包括人類、靈長類動物或任何其它來源獲得的組織切片的免疫組織化學(xué)研究。如本文中使用的，術(shù)語“抑制”或“中和”，考慮到本發(fā)明的抗體活性時，將指顯著抵抗、阻斷、預(yù)防、限制、減緩、中斷、破壞、終止、降低或逆轉(zhuǎn)例如抑制個體的發(fā)育或嚴(yán)重程度的能力，包括但不限于：生物學(xué)活性(如IL-17的活性)或特性，疾病或狀況。本發(fā)明的抗體與IL-17結(jié)合導(dǎo)致抑制或中和優(yōu)選至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的IL-17活性。如本文中使用的，術(shù)語“患者”指哺乳動物，包括但不限于：老鼠、猴、人、家畜哺乳動物、運(yùn)動哺乳動物和寵物哺乳動物；優(yōu)選地，該術(shù)語用于人。在某個實(shí)施方案中，患者優(yōu)選哺乳動物、優(yōu)選人，另外地特征在于IL-17A介導(dǎo)的疾病、紊亂或狀況可以通過降低IL-17的生物學(xué)活性而改善。術(shù)語“載體”指能轉(zhuǎn)運(yùn)與它連接的其它核酸的核酸分子，包括但不限于：質(zhì)粒和病毒載體。某些載體能在其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，而其它的載體能整合到宿主細(xì)胞基因組中病與宿主基因組一起復(fù)制。而且，一些載體能介導(dǎo)它們功能性結(jié)合的基因的表達(dá)。本申請中，這些載體稱為“重組表達(dá)載體”(或“表達(dá)載體”)；示例性的載體是現(xiàn)有技術(shù)熟知的。如本文中使用的，術(shù)語“細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和“生產(chǎn)細(xì)胞系”可以互換使用，指單個細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其是本發(fā)明的任意分離的多核苷酸或含有編碼本發(fā)明的HCVR、LCVR或單克隆抗體的序列的任意重組載體(多個重組載體)的受體。宿主細(xì)胞包括獲自單個宿主細(xì)胞的后代；由于天然、偶然或計(jì)劃的突變和/或變異，這些后代不必是與原始宿主細(xì)胞完全相同的(關(guān)于形態(tài)或完全DNA互補(bǔ))。宿主細(xì)胞包括用重組載體、表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的單克隆抗體或它的重鏈或輕鏈轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的細(xì)胞。包含本發(fā)明的重組載體的宿主細(xì)胞(整合到宿主染色體中或者沒有)都稱為“重組宿主細(xì)胞”。用于本發(fā)明的優(yōu)選宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞(例如，АТССCRL-9096)、NSO細(xì)胞、COS細(xì)胞(ATCC，例如，CRL-1650、CRL-1651)和Hela(АТССCCL-2)。用于本發(fā)明的另外的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、其它的哺乳動物細(xì)胞和原核細(xì)胞。術(shù)語“IL-17介導(dǎo)的疾病或紊亂”包括與異常的IL-17機(jī)體/組織水平相關(guān)的疾病或紊亂。這些疾病或紊亂可以感染炎癥或自身免疫，可以選自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎(Lymearthritis)、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩氏病(Crohn’sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病、胰島素依賴型糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性病癥、牛皮癬、皮炎、系統(tǒng)性硬化癥、移植物抗宿主病、移植排斥、與器官移植有關(guān)的急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、彌散性血管內(nèi)凝血、川崎病(Kawasakidisease)、格雷夫斯病(Graves’disease)、腎病綜合征、慢性疲勞綜合征、壞死性血管炎(Wegener'sdisease)、過敏性紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、伴有腎損害的顯微鏡下多血管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、感染性休克、中毒性休克綜合征、膿毒癥綜合征、惡病質(zhì)、感染、入侵、獲得性免疫缺陷綜合征、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓舞蹈病(Huntingtonchorea)、帕金森病(Parkinsondisease)、阿爾茨海默病(Alzheimerdisease)、中風(fēng)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心力衰竭、心肌梗死、艾迪生病(Addisondisease)、多腺性自身免疫綜合征I型或II型，施密特氏綜合征(Schmidt'ssyndrome)、急性呼吸窘迫綜合征、脫發(fā)、斑形脫發(fā)、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)病、萊特爾氏綜合征(Reiter'ssyndrome)、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、與潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)的關(guān)節(jié)病、腸病性滑膜炎、與衣原體有關(guān)的關(guān)節(jié)病、脊椎關(guān)節(jié)病、動脈粥樣硬化病、特異反應(yīng)性過敏、自身免疫性大皰病、天皰瘡、落葉狀天皰瘡、類天皰瘡、線狀I(lǐng)gA疾病、自身免疫性溶血性貧血、Coombs陽性溶血性貧血、獲得性惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦脊髓炎、慢性疲勞綜合征、慢性活動性肝炎癥、顱巨細(xì)胞動脈炎、原發(fā)性硬化性肝炎、隱源性自身免疫性肝炎、愛滋病、愛滋病相關(guān)疾病、乙肝、丙肝、常見變異型免疫缺陷病、擴(kuò)張型心肌病、女性不育、卵巢功能不全、過早卵巢衰竭、肺纖維化、隱源性致纖維化性肺泡炎、炎癥后間質(zhì)性肺病、間質(zhì)性肺炎、與間質(zhì)性肺病相關(guān)的結(jié)締組織病、與間質(zhì)性肺病相關(guān)的混合性結(jié)締組織病、與間質(zhì)性肺病相關(guān)的系統(tǒng)性硬皮病、與間質(zhì)性肺病相關(guān)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與肺病相關(guān)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡、與肺病相關(guān)的皮肌炎、與肺病相關(guān)的多發(fā)性肌炎、與肺病相關(guān)的干燥綜合征、與肺病相關(guān)的強(qiáng)直性脊椎炎、彌漫性肺血管炎、與肺病相關(guān)的血鐵質(zhì)、藥物引起的間質(zhì)性肺病、纖維化、輻射誘導(dǎo)的纖維化、閉塞性細(xì)支氣管炎、慢性嗜酸細(xì)胞性肺炎、伴有淋巴細(xì)胞浸潤的肺疾病、感染后間質(zhì)性肺病變、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、I型自身免疫肝炎、II型自身免疫性肝炎、自身免疫性低血糖癥、伴有角質(zhì)肥厚的B型胰島素抵抗、甲狀旁腺機(jī)能減退、急性移植相關(guān)的免疫疾病、慢性移植相關(guān)的免疫疾病、骨關(guān)節(jié)病、原發(fā)性硬化性膽管炎、I型牛皮癬、II型牛皮癬、特發(fā)性白細(xì)胞減少癥、自身免疫性嗜中性白血球減少癥、NOS-腎疾病、腎小球性腎炎、顯微鏡腎下多血管炎、萊姆病(Lymedisease)、盤狀紅斑狼瘡、先天性的NOS男性不育、抗精子免疫、多發(fā)性硬化、交感性眼炎、結(jié)締組織病繼發(fā)的肺動脈高壓癥、肺出血腎炎綜合癥、結(jié)節(jié)性多動脈炎的肺表現(xiàn)、急性風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性脊椎炎、史提爾氏病(Still'sdisease)、系統(tǒng)性硬皮病、干燥綜合征(Sjogren'sSyndrome)、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少癥、自身免疫性甲狀腺病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、自身免疫性甲狀腺機(jī)能減退、萎縮性自身免疫性甲狀腺機(jī)能減退、原發(fā)性粘液水腫、晶狀體抗原性葡萄膜炎、原發(fā)性血管炎、白癜風(fēng)、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘導(dǎo)的肝損傷、膽汁郁積、特質(zhì)性肝疾病，藥物誘導(dǎo)的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏癥、哮喘、B組鏈球菌感染(groupBstreptococcalinfection,GBS)、精神障礙、Th1-或Th2-介導(dǎo)的疾病、急性或慢性疼痛、惡性腫瘤(如：肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌或造血系統(tǒng)惡性腫瘤)、無β脂蛋白血癥、手足發(fā)紺、急性或慢性感染、急性或慢性侵染、急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、急性或慢性細(xì)菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位、AIDS癡呆綜合征、酒精誘導(dǎo)的肝炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥、α-I抗胰蛋白酶缺乏癥、側(cè)向肌萎縮性硬化癥、貧血、心絞痛、前角細(xì)胞變性、抗-CD3治療、抗磷脂綜合征、抗受體的過敏反應(yīng)、主動脈瘤、外周動脈瘤、主動脈夾層、高動脈壓、冠狀動脈硬化、動靜脈瘺、共濟(jì)失調(diào)、恒定或陣發(fā)性心房纖維性顫動、心房撲動、房室阻斷、B-細(xì)胞淋巴瘤、骨移植排斥、骨髓移植排斥、束支傳導(dǎo)阻滯、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、燒傷、心律失常、心肌頓抑綜合征、心臟腫瘤、心肌病、對旁路的炎性應(yīng)答、軟骨移植排斥、腦皮層變性、小腦病癥、混亂或多灶性房性心動過速、化療所致疾病、慢性粒細(xì)胞性白血病、慢性酒精成癮、慢性炎性疾病、慢性淋巴白血病、慢性阻塞性肺病、慢性水楊酸鹽中毒、結(jié)腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結(jié)膜炎、接觸性皮炎、肺心病、冠狀動脈疾病、克雅氏病(Creutzfeldt-JakobDisease)、培養(yǎng)陰性的膿毒癥、囊性纖維化、細(xì)胞因子療法誘導(dǎo)的疾病、拳擊運(yùn)動員的腦病、脫髓鞘病、登革出血熱(denguehemorrhagicfever)、皮炎、皮膚病、多尿癥、糖尿病、糖尿病相關(guān)的動脈粥樣硬化血管疾病、彌漫性雷維小體疾病(diffuseLewybodydisease)、充血性擴(kuò)張型心肌病、基底神經(jīng)節(jié)疾病、中年唐氏綜合征(Down'ssyndromeinmiddleage)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺阻滯劑誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙、藥物敏感性、濕疹、腦脊髓炎、心內(nèi)膜炎、內(nèi)分泌病、會厭炎、EB病毒感染(Epstein-Barrviralinfection)、紅痛病、錐體外系病癥、小腦病癥、家族性嗜血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥、胎兒胸腺移植排斥、弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)(Friedreich'sataxia)、外周動脈疾病、真菌敗血癥、產(chǎn)氣性蜂窩組織炎、胃潰瘍、腎小球性腎炎、任何器官或組織的移植排斥、革蘭氏陰性膿毒癥、革蘭氏陽性膿毒癥、由細(xì)胞內(nèi)生物體引起的肉芽腫、毛細(xì)胞白血病、哈-施病(Hallervorden-Spatzdisease)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥、血色病、血液透析、溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少性紫癜、出血、甲型肝炎、束支心律失常、HIV感染、HIV神經(jīng)病、霍奇金病(Hodgkindisease)、運(yùn)動機(jī)能亢進(jìn)性運(yùn)動疾病、過敏反應(yīng)、過敏性相關(guān)的肺炎、高血壓、運(yùn)動機(jī)能減退的運(yùn)動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸的檢查、特發(fā)性艾迪生氏病(idiopathicAddison'sdisease)、特發(fā)性肺纖維化、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、衰弱、嬰兒肌肉萎縮、主動脈炎癥、流感病毒A、暴露于電離輻射、虹膜睫狀體炎、葡萄膜炎、視神經(jīng)炎、局部缺血、再灌注誘導(dǎo)的疾病、缺血性中風(fēng)、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型脊髓性肌萎縮、卡波濟(jì)氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、腎移植排斥、軍團(tuán)桿菌病、利什曼病、麻風(fēng)病、皮質(zhì)脊髓束損傷、脂肪水腫、肝臟移植排斥、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細(xì)胞病、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血癥、代謝疾病、特發(fā)性疾病、偏頭痛、多系統(tǒng)線粒體疾病、混合性結(jié)締組織病、單克隆丙種球蛋白病、多發(fā)性骨髓瘤、多系統(tǒng)變性癥、重癥肌無力、細(xì)胞內(nèi)鳥結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、骨髓增生異常綜合征、心肌梗塞、心肌缺血性疾病、鼻咽癌、新生兒慢性肺疾病、腎炎、腎病、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)源性肌萎縮、嗜中性粒細(xì)胞減少性發(fā)熱、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、腹部主動脈分支閉塞、動脈阻塞性疾病、OKT3治療、睪丸炎、附睪炎、輸精管吻合術(shù)、器官腫大、骨質(zhì)疏松癥、胰腺移植排斥、胰腺癌、副腫瘤性疾病、腫瘤相關(guān)的高鈣血癥、甲狀旁腺移植排斥、盆腔炎癥性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、外周血管疾病、腹膜炎、惡性貧、卡氏肺囊蟲肺炎、POEMS綜合征、灌注后綜合征、泵頭綜合征、心臟切開后梗塞后綜合征、子癇前期、進(jìn)行性核上性麻痹、原發(fā)性肺動脈高血壓、放射療法、雷諾氏現(xiàn)象或疾病(Raynaud'sphenomenonordisease)、雷諾氏病(Raynoud'sdisease)、雷弗素姆病(Refsum'sdisease)、常規(guī)窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈癥、路易體癡呆(DementiawithLewybodies)、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)炎、休克、鐮狀細(xì)胞病、皮膚同種異體移植排斥、皮膚變化、小腸移植排斥、實(shí)體瘤、特異性心律失常、脊髓性共濟(jì)失調(diào)、脊髓小腦退化、鏈狀球菌肌炎、小腦結(jié)構(gòu)損傷、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管梅毒、全身性過敏反應(yīng)、綜合全身炎癥反應(yīng)綜合征、全身型幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、毛細(xì)管擴(kuò)張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少癥、外傷、出血、III型超敏反應(yīng)、IV型超敏反應(yīng)、不穩(wěn)定心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒感染、真菌感染、病毒性腦炎、無菌性腦膜炎、病毒嗜血細(xì)胞綜合征、韋尼克-科爾薩科夫綜合征(Wernicke-Korsakoffsyndrome)、威爾遜氏病(Wilson'sdisease)、任何器官或組織的異種移植排斥、急性冠狀動脈綜合征、急性特發(fā)性多神經(jīng)炎、急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、急性缺血、成人斯蒂爾病(adult-onsetStillsdisease)、斑形脫發(fā)、過敏性反應(yīng)、抗磷脂抗體綜合征、再生障礙性貧血、冠狀動脈硬化、特應(yīng)性濕疹、特應(yīng)性皮炎、自身免疫皮炎、與鏈球菌感染相關(guān)的自身免疫性疾病、自身免疫性腸病、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰、瞼炎、支氣管擴(kuò)張、大皰性類天皰瘡、心血管疾病、災(zāi)難性抗磷脂綜合征、乳糜瀉、頸椎病、慢性缺血、疤痕性類天皰瘡、多發(fā)性硬化、結(jié)膜炎、兒童期發(fā)作的精神病癥、慢性阻塞性肺病、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、椎間盤突出、椎間盤脫出、藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血、心內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥、眼內(nèi)炎、鞏膜外層炎、紅斑多形物、嚴(yán)重紅斑多形物、妊娠期類天皰瘡、吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barresyndrome，GBS)、枯草熱、休斯綜合癥(Hughessyndrome)、特發(fā)性帕金森病、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血、包涵體肌炎、傳染性眼部炎性疾病、炎性脫髓鞘病、炎癥性心臟病、炎癥性腎病、先天性肺纖維化、常見間質(zhì)性肺炎、虹膜炎、角膜炎、干燥性角結(jié)膜炎、庫斯毛爾病(Kussmaul-Meier病)、蘭德里麻痹(Landrypalsy)、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(Langerhans'cellhistiocytosis)、大理石狀皮膚病、黃斑變性、顯微鏡下多血管炎、Bechterew病、運(yùn)動神經(jīng)元疾病、粘膜類天皰瘡、多發(fā)性器官衰竭、重癥肌無力、脊髓發(fā)育不良綜合征、心肌炎、神經(jīng)根病癥、神經(jīng)病、非A型肝炎、非B型肝炎、視神經(jīng)炎、骨質(zhì)溶解癥、卵巢癌、JIA少關(guān)節(jié)型、外周動脈閉塞性疾病、周圍性血管疾病、周圍動脈疾病、靜脈炎、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動脈炎、多軟骨炎、風(fēng)濕性多肌痛、白發(fā)病、多關(guān)節(jié)型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷、多肌炎、風(fēng)濕性多肌痛、泵后綜合征、原發(fā)性帕金森氏綜合征、前列腺癌、直腸癌、造血系統(tǒng)惡性腫瘤(如：白血病、淋巴瘤)、前列腺炎、單純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、原發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、復(fù)發(fā)性視神經(jīng)脊髓炎、心瓣手術(shù)后的再狹窄、風(fēng)濕性心臟病、滑膜炎、痤瘡、膿皰病、股肥大、骨炎、硬皮病、繼發(fā)性淀粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經(jīng)痛、繼發(fā)性腎上腺機(jī)能不足、硅相關(guān)的結(jié)締組織病、Sneddon-Wilkison病、強(qiáng)直性脊柱炎、Stevens–Johnson綜合征、全身炎癥反應(yīng)綜合征、顱動脈炎、弓形體鼻炎、中毒性表皮壞死松解癥、橫貫性脊髓炎、腫瘤壞死因子受體相關(guān)的周期性綜合征、I型變態(tài)反應(yīng)、II型糖尿病、蕁麻疹、常見間質(zhì)性肺炎、血管炎、春季結(jié)膜炎、病毒性視網(wǎng)膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada綜合征、濕性黃斑變性、傷口愈合相關(guān)的關(guān)節(jié)病、耶爾森氏菌屬相關(guān)的關(guān)節(jié)病、沙門氏菌相關(guān)的關(guān)節(jié)病?？贵w的描述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合IL-17A的抗體或其片段；重鏈的可變區(qū)(VH)包括3個高變區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3：高變區(qū)HCDR1包括SEQIDNO:1；高變區(qū)HCDR2包括SEQIDNO:2；高變區(qū)HCDR3包括SEQIDNO:3；可變區(qū)(VL)包括3個高變區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3：高變區(qū)LCDR1包括SEQIDNO:4；高變區(qū)LCDR2包括SEQIDNO:5；高變區(qū)LCDR3包括SEQIDNO:6。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及含有重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的單克隆抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包括：HCDR1:F-T-F-S-N-Y-A-M-S(SEQIDNO:7)；HCDR2:R-I-E-G-G-I-S-S-T-Y(SEQIDNO:8)；HCDR3:С-А-V-N-Y-Y-G-M-Y-Y(SEQIDNO:9)；而且輕鏈的可變區(qū)(VL)包括：LCDR1:T-G-T-S-E-D-V-G-F-G-N-Y(SEQIDNO:10)；LCDR2:R-V-N-T-R-P-S(SEQIDNO:11)；LCDR3:С-S-S-Y-K-A-G-G-T-Y(SEQIDNO:12)。本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案涉及特異性結(jié)合人IL-17A的單克隆抗體或其片段，或者包含重鏈(VH)或輕鏈(VL)的可變區(qū)的抗體片段，其中所述抗體或它的活性片段包括至少一個下面的可變區(qū)：a)SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)(VH)；b)SEQIDNO:14的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗體可包括與SEQIDNO:15相同的重鏈序列。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是包括氨基酸序列與SEQIDNO:16相同的輕鏈的抗體。本發(fā)明的抗體包括另外的突變M252Y/S254T/T256E、N434W、N434A、N434F、H433K/N434F/Y436H、H433K/N434F/Y436H+M252Y/S254T/T256E、T307A/E380A/N434A、T250Q/M428L。所述的取代沒有導(dǎo)致抗體與IL-17A結(jié)合的能力喪失，但是它們可能導(dǎo)致ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)降低，或者增加抗體的親和力或其它生物學(xué)特性。本發(fā)明的抗體具有改善的生物學(xué)特性，尤其是關(guān)于IL-17A更好的抑制活性(IC50)，以及增強(qiáng)的聚集穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了編碼要求的抗體的DNA構(gòu)建體和含有所述DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，其用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。而且，本發(fā)明提供了包含具有上述DNA的表達(dá)載體的細(xì)胞系。該細(xì)胞系可用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。藥物組合物本發(fā)明的抗體可以包含在適于在患者中施用的藥物組合物中(請參見實(shí)施例14)。本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)施用或者與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑聯(lián)合施用，以單劑量或者多劑量。開發(fā)用于給藥的藥物組合物以滿足選擇的給藥模式；而且正確使用藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體和/或賦形劑，如：分散劑、緩沖液、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等等(請參見實(shí)施例14)。根據(jù)例如Remington，TheScienceandPracticeofPharmacy，第19版，Gennaro，Ed.,MackPublishingCo.,Easton,PA1995中說明的標(biāo)準(zhǔn)方法開發(fā)了所述組合物，其描述了用于制劑生產(chǎn)的常見技術(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)的給藥技術(shù)包括口腔、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肺、經(jīng)皮、肌內(nèi)、鼻、頰、舌下或通過栓劑，可以將包含本發(fā)明的抗IL-17單克隆抗體的藥物組合物施用患者，該患者有本文描述的病理的風(fēng)險或有本文描述的病理。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選包含或者是治療有效量的本發(fā)明的抗體?！爸委熡行Я俊敝斧@得想要的治療效果所需的劑量和時間周期有效的量?？贵w的治療有效量可以根據(jù)這些參數(shù)而改變，如：疾病狀況、年齡、個體的性別和體重，抗體或它的片段在患者中誘導(dǎo)想要的反應(yīng)的能力。治療有效量也是抗體的治療利益超過毒性或副作用的量。“預(yù)防有效量”指獲得想要的預(yù)防效果所需的劑量和時間周期有效的量。由于預(yù)防劑量是在疾病之前或者疾病的早期階段用于個體，所以預(yù)防有效量一般低于治療有效量。治療有效量或預(yù)防有效量至少是保證患者的治療利益所需的最小劑量，但是低于活性組分的中毒劑量。同時，本發(fā)明的抗體的治療有效量是降低哺乳動物，優(yōu)選人類中IL-17的活性(例如，IL-17R結(jié)合)的量，所需哺乳動物中IL-17的存在導(dǎo)致或促進(jìn)任何不利的病理作用，或者如果IL-17的降低導(dǎo)致哺乳動物優(yōu)選人類的治療利益的量。本發(fā)明抗體的給藥途徑可以是口腔、腸胃外、吸入或局部。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以包含在適用于腸胃外投藥的組合物中。如本文中使用的術(shù)語“腸胃外”包括：靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道或腹膜內(nèi)給藥。靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射是優(yōu)選的給藥途徑。用于這種注射的可接受的藥物載體是現(xiàn)有技術(shù)熟知的。如合適的指南中描述的，藥物組合物在生產(chǎn)和儲存在容器中時應(yīng)該是無菌和穩(wěn)定的，其例如以密封小瓶(例如安瓿瓶)或注射器中的形式提供。因此，在制備組合物后可以對藥物組合物進(jìn)行過濾除菌，或者通過任何其它微生物學(xué)合適的方法制備藥物組合物。用于靜脈內(nèi)輸液的典型組合物可包括250-1000mL液體，如：無菌林格氏溶液、生理鹽水、右旋糖溶液或Hank’s鹽溶液，和治療有效量的(例如，1-100mg/mL或更高的)抗體濃縮物。劑量可以根據(jù)疾病類型和嚴(yán)重程度而改變。從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的狀況熟知，用于某個患者的劑量取決于多個因素包括患者的體型、體表面積、年齡、施用的具體化合物、性別、給藥期限和途徑、總體健康狀況以及同事施用的藥物。典型的劑量可以是，例如：0.001-1000μg的范圍；但是低于和高于該示例性范圍的劑量是預(yù)期的，特別是考慮到上述參數(shù)。每天的腸胃外劑量給藥方式可以是從每天0.1μg/kg到100μg/kg體重，優(yōu)選從0.3μg/kg到10μg/kg，更優(yōu)選從1μg/kg到10μg/kg，更優(yōu)選從0.5μg/kg到10μg/kg體重?？梢酝ㄟ^患者的健康狀態(tài)定期評估來監(jiān)控治療過程。對于幾天或更長時間的重復(fù)給藥，根據(jù)患者的狀況，重復(fù)治療直到想要的應(yīng)答或疾病控制。但是，本文沒有描述的其它劑量給藥方式也可以應(yīng)用。可以通過單丸劑或多丸劑劑量給藥，或通過抗體的連續(xù)輸液來施用合適的劑量，這取決于想要的藥物動力學(xué)分解。所述的抗體假定的特性很大程度上取決于醫(yī)生的決定。預(yù)期的效果是選擇合適劑量和方式的關(guān)鍵因素。本文考慮的參數(shù)包括待治療的某種疾病、接受的治療的某種哺乳動物、某個患者的臨床狀況、紊亂起因、給藥位點(diǎn)、某種抗體類型、給藥途徑、給藥模式以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的其它因素。本發(fā)明的治療劑可以是冷凍的或凍干的，并在給藥之前在無菌載體中恢復(fù)。凍干和恢復(fù)會導(dǎo)致抗體活性的某些損失?？梢哉{(diào)節(jié)劑量來補(bǔ)償這種損失。通常，制劑pH從6到8是優(yōu)選的。制品在另一個實(shí)施方案中，提供了含有用于治療或預(yù)防上述紊亂的材料的制品。該制品包括裝有包含抗體的藥物組合物的容器，和標(biāo)簽或包裝說明書。合適的容器包括：例如，小瓶、安瓿瓶、注射器和分析管。容器可以由各種材料制成，如玻璃或塑料。容器包含治療IL-17A介導(dǎo)的疾病或紊亂有效的本發(fā)明的組合物，而且可具有無菌的進(jìn)入孔(例如：容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有皮下注射針可刺穿的塞子的小瓶)。本發(fā)明的抗IL-17A抗體是組合物的活性組分。T標(biāo)簽或包裝說明書標(biāo)明組合物用于治療想要的狀況。而且，制品可包含裝有藥學(xué)上可接受的緩沖液如磷酸緩沖鹽溶液、林格氏溶液和右旋糖溶液的第二容器。它還可包括來自商業(yè)和用戶立場的需要的其它材料，包括其它的緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器和包裝說明書。提供下面實(shí)施例的目的僅僅是為了說明性的目的，而不是試圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1在懸浮的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組抗原和抗體根據(jù)公開的方案，在獲自中國倉鼠卵巢細(xì)胞的已建立細(xì)胞系(CHO-K1)中生產(chǎn)抗體和抗原[BiotechnolBioeng.2005Sep20；91(6):670-677,LiaoMetal.,2004；BiotechnolLett.2006Jun；28(11):843-848；BiotechnolBioeng.2003Nov5；84(3):332-342]。使用組成性表達(dá)EBNA1蛋白(Epstein-Barr病毒核抗原1)的基因的細(xì)胞。使用來自LifeTechnologiesCorporation的無血清培養(yǎng)基，根據(jù)制造商的指南，在定軌振蕩器上，在燒瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。為了瞬時表達(dá)，濃度為2*106/mL的細(xì)胞通過線性聚乙烯亞胺(PEIMAX，Polysciences)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。DNA/PEI比例是1:3-1:10。轉(zhuǎn)染后5-7天中，將細(xì)胞培養(yǎng)物在2000g離心20min，并通過0.22μm過濾器進(jìn)行過濾。通過親合HPLC從培養(yǎng)物液體分離靶蛋白。在ProfinityIMACNi-電荷的樹脂(Bio-Rad)上，從培養(yǎng)物液體分離并純化重組IL-17A蛋白，其C-末端區(qū)含有6個組氨酸。純化過程之前，添加NiCl2到培養(yǎng)物液體達(dá)到濃度為1mM。然后添加5mLProfinityIMACNi-電荷的樹脂到培養(yǎng)物液體中，并在振蕩器上室溫下混合1h。將吸附劑轉(zhuǎn)入到5mLThermoscientific聚丙烯柱上，并用5倍柱體積的PBS洗滌，以除去非特異性結(jié)合的組分。用0.3M咪唑(pH8)和150mMNaCL洗脫結(jié)合的抗原。然后通過蛇皮透析管技術(shù)將蛋白透析到PBS(pH7.4)中，過濾(0.22μm)，轉(zhuǎn)移到管中，并于-70℃儲存。通過SDS-PAGE評估獲得的蛋白的純度(圖1)。在用于親和HPLC的A蛋白柱上，從細(xì)胞培養(yǎng)物分離并純化重組IL-17A-Fc蛋白。澄清的培養(yǎng)物液體通過用PBS(pH7.4)平衡的5mLHiTraprProteinA瓊脂糖凝膠FF柱(GEHealthcare)。然后用5倍體積的PBS洗滌柱子，以除去未結(jié)合的組分。結(jié)合的抗原用0.1M甘氨酸緩沖液pH3洗脫。收集主要的蛋白洗脫峰，并用1MTris-緩沖液(pH8)產(chǎn)生中性pH。整個階段在11-cm/h流速下進(jìn)行。然后使用蛇皮透析管技術(shù)將分離的蛋白透析到PBS(pH7.4)中，過濾，轉(zhuǎn)移到管中，并于-70℃儲存。通過SDS-PAGE評估獲得的蛋白的純度(圖2)。根據(jù)用于IL-17A-Fc的上述過程，在1mLHiTraprProteinAFF柱(GEHealthcare)上純化IgG1抗體。通過SDS-PAGE評估獲得的蛋白的純度(圖3)。實(shí)施例2用人IL-17A免疫接種美洲駝并產(chǎn)生的美洲駝抗體的Fab噬菌體文庫LamaGlama被連續(xù)免疫5次，通過皮下給予抗原材料，所述抗原材料混合有等體積的完全(第一次注射)或不完全(在余下的注射)弗氏佐劑。重組蛋白的混合物(每次注射0.2mg每種蛋白)用作抗原，其中一個是人IL-17A(來自R&DSystems的試劑盒)。第二次注射(免疫接種)階段是在第一次注射后3周進(jìn)行；以2周的間隔進(jìn)行3次更多的免疫接種。從第三次注射開始，每次注射后5天收集血樣(50mL)。用含有1mMEDTA的PBS將血液稀釋2倍。然后35mL稀釋的血液在15mL-1077培養(yǎng)基(Sigma，密度為1.077g/mL)上分層，并在800g下離心20min。從血漿/Histopaque培養(yǎng)基界面區(qū)收集單核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和單細(xì)胞)，并用包含1mMEDTA的PBS洗滌。使用RNeasyMini試劑盒，根據(jù)試劑盒方案(QIAGEN)，分離美洲駝的單核細(xì)胞總RNA。使用Nanovue(GEHealthcare)進(jìn)行RNA濃度分析；通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測分離的RNA的質(zhì)量。使用MMLVRT試劑盒(Evrogen)，根據(jù)推薦的方案，用MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用寡核苷酸試劑盒和方案[JBiolChem.1999Jun25；274(26):18218-30；WO2010/001251]，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物用作二階段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的模板，以獲得兩側(cè)為限制性位點(diǎn)的可變區(qū)基因。另外，通過連續(xù)的酶切、連接和擴(kuò)增反應(yīng)，如圖1中所示方案，將輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因編碼成一個限制性片段。重鏈基因分別與κ和λ輕鏈基因連接。在所有反應(yīng)中的基質(zhì)的分子的計(jì)算量不少于1011。用NheI/Eco91I限制性內(nèi)切酶處理獲得DNA產(chǎn)物(VL-CK-VH)，并連接到原始的噬菌粒pH5。噬菌粒的構(gòu)建如圖2所示。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到根據(jù)[MethodsEnzymol.，2000；328:333-63]中所述方案制備的電感受態(tài)SS320細(xì)胞中。構(gòu)建κ和λ的Fab全文庫分別為5.1*108和3.7*108。根據(jù)以前描述的程序[JMolBiol.1991Dec5；222(3):581-97]制備噬菌體文庫。實(shí)施例3Fab噬菌體抗體文庫的篩選使用重組人IL-17A(來自R&DSystems的試劑盒)，從噬菌體Fab展示文庫分離特異性抗IL-17A噬菌體Fab抗體；如以前(JBiolChem.1999Jun25；274(26):18218-30；NatBiotechnol.1996Mar；14(3):309-14；JMolBiol.1991Dec5；222(3):581-97)所述的進(jìn)行一系列篩選循環(huán)。為了實(shí)施采用panning方法的篩選，使50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中的人IL-17A在HighSorb管(Nunc)表面于4℃吸附過夜，并用PBS(pH7.4)洗滌HighSorb管，然后用含有PBS(pH7.4)-無脂牛奶(0.5％重量/體積)的溶液封閉1h。然后將PBS(pH7.4)-無脂牛奶(0.5％w/vol)中的2-4mL噬菌體溶液(1012噬菌體顆粒/mL)加到帶有抗原的管中，并攪拌孵育1h。通過用PBS(pH7.4)-吐溫20(0.1％vol./vol.)進(jìn)行一系列洗滌循環(huán)除去未結(jié)合的噬菌體。從第一輪到第三輪的洗滌循環(huán)的次數(shù)依次按20-30-40倍增加。余下的結(jié)合的噬菌體顆粒用100mMGly-HCl溶液(pH2.5)在攪拌下洗脫15min，然后用1MTRIS-HCl(pH7.6)中和，用噬菌體感染Е.coliTG1細(xì)菌，接著分離噬菌體，并用于下一輪的篩選循環(huán)。實(shí)施例4嵌合的Fab噬菌體抗體文庫的構(gòu)建使用RNeasyMini試劑盒，根據(jù)其方案(QIAGEN)，從550個人捐獻(xiàn)者的血淋巴細(xì)胞中分離總RNA。使用Nanovue試劑盒(GEHealthcare)進(jìn)行RNA濃度分析，同時通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測分離的RNA的質(zhì)量。使用MMLVRT試劑盒(Evrogen)，根據(jù)推薦的方案，利用MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用寡核苷酸試劑盒和方案[JBiolChem.1999Jun25；274(26):18218-30]，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物用作二階段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的模板，以獲得兩側(cè)為限制性位點(diǎn)的可變區(qū)基因。使用國際公開WO93/06213中描述的技術(shù)，并基于上述的原始噬菌粒pH5，對特異性抗IL-17A的嵌合Fab進(jìn)行工程化。為了該目的，通過連續(xù)的酶切、連接和擴(kuò)增反應(yīng)，如圖6A所示，將人供體輕鏈可變區(qū)基因和美洲駝A1抗體的重鏈可變區(qū)基因連接到一個片段中。類似地，通過連續(xù)的酶切、連接和擴(kuò)增反應(yīng)，如圖6B所示，將美洲駝A1抗體的輕鏈可變區(qū)基因與人供體重鏈可變區(qū)基因和美洲駝抗體A1重鏈可變區(qū)基因結(jié)合到一個限定性片段中。在所有反應(yīng)中的人可變區(qū)基因的基質(zhì)分子的計(jì)數(shù)量不少于1012。用限制性酶NheI/Eco91I處理獲得DNA制品VL-CK-VH，并連接到原始的噬菌粒pH5。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到根據(jù)[MethodsEnzymol.，2000；328:333-63]中所述方案制備的電感受態(tài)SS320細(xì)胞中。基于A1克隆的重鏈和混合人κ和λ鏈的嵌合的Fab全文庫chA1VH/hVL包括2.8*109個轉(zhuǎn)化體。基于A1克隆的輕鏈和人重鏈的嵌合的Fab全文庫chA1VL/hVH包括1.1*1010個轉(zhuǎn)化體。嵌合的Fab噬菌體文庫根據(jù)[JMolBiol.1991Dec5；222(3):581-97]中描述的程序制備。在與上述那些相同的條件下(看Fab噬菌體文庫的篩選)，進(jìn)行嵌合的Fab噬菌體文庫的篩選。在對IL-17A進(jìn)行第二輪篩選后，兩個文庫都證實(shí)顯著的富集A。從富集的嵌合的Fab文庫得到的克隆池用作特異性抗IL-17A的人可變區(qū)基因VH與VK/VL相結(jié)合的來源。實(shí)施例5特異性抗人IL-17A的Fab噬菌體抗體文庫的構(gòu)建為了構(gòu)建特異性抗人IL-17A的Fab噬菌體抗體，從富集的嵌合的Fab文庫得到的克隆池用作特異性抗IL-17A的人可變區(qū)基因VH與VK/VL相結(jié)合的來源。為了此目的，用來自第二輪文庫chA1VH/hVL的富集物的特異性引物擴(kuò)增人的輕鏈基因，并用來自第二輪文庫chA1VL/hVH的富集物的特異性引物擴(kuò)增人的重鏈基因。通過用SfiI限制性酶切、連接和擴(kuò)增，如圖7所示，使人基因池的兩個可變區(qū)相繼結(jié)合。用NheI/Eco91I限制性酶處理獲得VL-CK-VHDNA產(chǎn)物，并連接到原始的噬菌粒pH5中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到根據(jù)[MethodsEnzymol.2000；328:333-63]制備的電感受態(tài)SS320細(xì)胞中?；谌酥劓満洼p鏈的Fab全文庫是8.6*108。嵌合的Fab噬菌體文庫制品的制備是根據(jù)以前[MolBiol.1991Dec5；222(3):581-97]描述的程序。在與上述那些相同的條件下(看Fab噬菌體文庫的篩選)，進(jìn)行嵌合的Fab噬菌體文庫的篩選。在對IL-17A進(jìn)行第二輪篩選后進(jìn)行ELISA分析，結(jié)果顯示多克隆噬菌體產(chǎn)物中顯著富集有A。富集特異性抗IL-17A的人Fab的克隆池是源于再克隆到表達(dá)質(zhì)粒中。實(shí)施例6A特異性結(jié)合人IL-17A-Fc的Fab的分析ELISA用于檢測研究的Fab片段與人IL-17A的結(jié)合。具有公開的AIN457序列(Novartis)的Fab用作陽性對照。用50μL(0.5μg/mL，1X包被碳酸鹽緩沖液中的)IL-17A-Fc包被ELISA平板孔(NuncImmunoMaxisorp)，密封關(guān)閉，并于4℃孵育過夜。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方案，用高性能自動系統(tǒng)如GenetixQ-pix2xt(MolecularDevices)和TecanFreedomEVO200(Tecan)進(jìn)行所有后續(xù)的步驟。通過添加封閉緩沖液BB(PBS中的200μL0.5％無脂牛奶)封閉非特異性結(jié)合基團(tuán)，平板在振蕩器上于室溫下孵育1h。用PBS-吐溫洗滌后，用混有等體積BB的50μL含有檢測Fab的細(xì)胞上清液包被每個孔。平板在振蕩器上于室溫下孵育1h；每個平板孔進(jìn)一步用PBS-吐溫緩沖液洗滌5次。洗滌后，用PBS-吐溫中的抗人FabHRP-共軛的第二抗體(Pierce-ThermoScientific)(1:5000)包被每個孔(50μL/孔)。把平板轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)振蕩器中(室溫下50min)，然后如上所述用PBS-吐溫洗滌5次。通過添加ТМВ(100μL/孔)直到飽和(平均3-5min)獲得比色信號；通過添加終止溶液(100μL/孔，10％硫酸)阻斷進(jìn)一步的顯色。使用合適的Tecan-Sunrise平板讀數(shù)器(Tecan)測定450nm處的吸光度?？贵w結(jié)合與產(chǎn)生的信號成比例。例如，圖8顯示了第二輪篩選后，從具有美洲駝Fab的一個平板獲得的ELISA結(jié)果。該直方圖顯示了具有高于或低于對照Fab(AIN457)的信號的陽性克隆數(shù)(以紅色標(biāo)記)，或沒有與固定化抗原相互作用的克隆數(shù)(0.1-0.2相對單位)。實(shí)施例6B阻斷IL-17A配體與IL-17R受體相互作用的競爭性ELISA分析競爭性ELISA技術(shù)用于檢測前面篩選的特異性抗人IL-17A-Fc的Fab的拮抗能力。具有公開的AIN457序列(Novartis)的Fab用作陽性拮抗劑對照。用50μL/孔IL-17RA-Fc受體(R&DSystems；1X包被碳酸鹽緩沖液中的1μg/mL溶液)包被ELISA平板孔，并于4℃孵育過夜。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方案，用高性能自動系統(tǒng)如GenetixQ-pix2xt(MolecularDevices)和TecanFreedomEVO200(Tecan)進(jìn)行所有后續(xù)的步驟。通過添加封閉緩沖液BB(PBS中的200μL0.5％無脂牛奶)封閉非特異性結(jié)合基團(tuán)，平板在振蕩器上于室溫下孵育1h。平行地，使50μL含有檢測Fab的細(xì)胞緩沖液在96孔平板中與50μLIL-17A-His6-Flag(0.4μg/mL，用PBS-吐溫稀釋的1％牛奶中)混合。平板于37℃在振蕩器上以500rpm孵育1h。含有IL-17RA-Fc受體的平板用BB溶液洗滌后，用FabandIL-17A-His6-Flag的反應(yīng)混合物以每孔90μL的含量對其進(jìn)行包被。平板在室溫下在振蕩器上孵育45min。然后用PBS-吐溫緩沖液將每個孔洗滌5次。進(jìn)一步添加50μL/孔的1μg/mL抗FLAG鼠M2抗體(Singma)，并將平板在室溫下孵育45min。孵育后，每個平板孔用PBS-吐溫洗滌5次，而且每個孔用50μL抗鼠-IgGHRP共軛的第二抗體(Pierce-ThermoScientific)包被，其用PBS-吐溫以1:5000稀釋。平板在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于室溫下孵育45min，并用PBS-吐溫按上述洗滌5次。通過添加ТМВ(100μL/孔)直到飽和(平均3-5min)獲得比色信號；通過添加終止溶液(100μL/孔，10％硫酸)阻斷進(jìn)一步的顯色。使用合適的Tecan-Sunrise平板讀數(shù)器(Tecan)測定450nm處的吸光度?？贵w結(jié)合度與產(chǎn)生的顯色信號成比例。例如，圖9顯示了第二輪篩選后，具有美洲駝Fab的一個平板獲得的ELISA結(jié)果。該直方圖顯示了具有與對照Fab(AIN457，以紅色標(biāo)記)相當(dāng)信號(0.05-0.1相對單位)的陽性克隆數(shù)，或沒有阻斷IL-17A/IL-17R相互作用的克隆數(shù)(信號與用配體-受體直接相互作用的對照相似，以深藍(lán)色標(biāo)記)。實(shí)施例7人抗IL-17AFab候選物的競爭性koff-篩選采用Koff-篩選進(jìn)行抗17AFab候選物的篩選。使用PallForteBioOctetRed96系統(tǒng)進(jìn)行Koff-篩選?？笷ABCH1生物傳感器在含有10mMPBS(pH7.2-7.4)、0.1％吐溫-20和0.1％BSA的工作緩沖液中再水化30min。添加10x工作緩沖液到E.coli上清液的檢測樣品中達(dá)到1x終濃度。然后將抗FABCH1生物傳感器浸入含有候選抗體的Fab片段E.coli上清液中，并在4℃的溫度下孵育12h。將用Fab片段包被的傳感器轉(zhuǎn)移到具有工作緩沖液的孔中，記錄基線(60秒)。然后將傳感器轉(zhuǎn)移到具有分析溶液(IL-17A,30μg/mL)的孔中，以實(shí)現(xiàn)抗原-抗體結(jié)合(300秒)。然后，將傳感器返回到具有工作緩沖液的孔中進(jìn)行進(jìn)一步解離(300秒)。每次檢測后對使用的傳感器進(jìn)行再生：將它們置于再生緩沖液(Gly-HCl,рH1.7)中3次，然后其可用于下面的實(shí)驗(yàn)。使用OctetDataAnalysis(版本7.0)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，利用1:1的相互作用模型分析獲得曲線。圖10顯示了抗人IL-17AFab候選物的koff-篩選獲得的結(jié)果。實(shí)施例8可變區(qū)CDR的掃描誘變和高親和力候選物的篩選通過NNK隨機(jī)技術(shù)[ApplEnvironMicrobiol.2006Feb；72(2):1141-7；MAbs.2012May-Jun；4(3):341-8]，使用位點(diǎn)直接誘變試劑盒(來自NEB)，根據(jù)其方案，插入突變到候選物的CDR的單個位置中。使用A1-Fab-pLL質(zhì)粒作為模板。PCR產(chǎn)物在低熔點(diǎn)瓊脂糖上分級，并在合適的柱子上純化。連接反應(yīng)后，將DNA轉(zhuǎn)化到E.coli表達(dá)菌株BL21gold(Stratagene)中。如上所述，然后在96孔板中通過Fab表達(dá)獲得單個克隆。在上述ELISA分析條件下，使用高性能的自動系統(tǒng)GenetixQ-pix2xt和TecanFreedomEVO200通過ELISA分析含有突變Fab的上清液。固定的IL-17A的濃度是0.2μg/mL。結(jié)合Fab的共軛體用1:5000的山羊抗人IgG(Fab')2(HRP)共軛物(Pierce)稀釋和TMB+H2O2/H2SO4染料進(jìn)行染色；在450nm波長處測定吸光度。表1中呈現(xiàn)了掃描誘變獲得的結(jié)果。該表顯示了CDR區(qū)的取代位置，與野生型序列相比較，其相應(yīng)于突變的Fab/人IL-17A結(jié)合信號減少≤30％。因此，這種單個突變或其任意組合都屬于本發(fā)明的主題。表1.掃描誘變突變位置突變中積極的氨基酸突變位置突變中積極的氨基酸HCDR3LCDR3V99R,N,A,IA91SN100E,L,M,S,T,VS92G,TY101-Y93A,F,IY102F,VR94KG103SA95SM104A,F,L,P,YG96FY105F,H,I,M,S,WG97HY106A,I,N,R,S,VT98-Y99I,L,WHCDR2LCDR2R50G,I,L,M,SR52E,L,MD52D,EV53L,SG53MN54GG54L,R,VT55I,K,L,M,R,WI55LS57L,R,T,WS58T,YT59L,R,S,WY60T,L,KHCDR1LCDR1N31D,K,L,M,P,TE27N,RY32FD28S,TA33G,M,N,S,T,VV29L,RM34IG30VS35G,N,TF31L,S,T,V,YG32L,VN33P,R,SY34A,L,W因此，對耐受其它氨基酸取代的BCD085抗體的CDR區(qū)氨基酸位置進(jìn)行篩選。證實(shí)目前的氨基酸取代對象沒有顯著改變抗體與人IL-17A的結(jié)合力。所述取代對象可用于改善各種候選物的特性。實(shí)施例9穩(wěn)定細(xì)胞系的工程化，抗體的生產(chǎn)和純化通過用包含最佳比例的抗體輕鏈和重鏈的載體轉(zhuǎn)染親本懸浮液CHO-S細(xì)胞系，獲得生產(chǎn)BCD085抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系。使用ClonePixrobotic平臺(MolecularDevices)獲得了高水平的克隆系(超過100mg/L)。通過BiomekFXrobotics(BeckmanCoulter)和OctetRED96自動分析系統(tǒng)(PallLifeSciences)分析所選擇的克隆體的生產(chǎn)力。在不含動物來源蛋白的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)系。用于臨床前研究的BCD085在200L操作體積的HyClone一次性生物反應(yīng)器(Thermoscientific)中積累。培養(yǎng)物液體通過裝有蠕動泵的ZetaPlusMaximizer451670160M02深度過濾器進(jìn)行過濾。在MabSelectProteinA親和基質(zhì)(GEHealthcareLifeSciences)上進(jìn)行抗體的初級純化。通過深度過濾澄清后，將培養(yǎng)物液體用于吸附劑，其用含有50mMHCl-Tris(pH7.5)和150mMNaCL的緩沖液平衡。然后用平衡緩沖液洗滌吸附劑，接著用低傳導(dǎo)性的HCl-Tris洗滌。使用Gly-HCL緩沖液(pH3.5)進(jìn)行蛋白洗脫。為了病毒滅活的目的，將收集的洗脫物暴露于酸性pH30min，然后用1MTris堿中和到pH6.8。當(dāng)達(dá)到合適的pH時，用0.22μm膜(PVDF)，在STERICUP系統(tǒng)上對蛋白溶液進(jìn)行過濾。通過使蛋白溶液在低的傳導(dǎo)性下(<2毫秒/cm2)，流過制備的QSepharoseFF(GEHealthCare)，pH7.0，進(jìn)行最終的純化以除去DNA、宿主細(xì)胞蛋白和釋放的親和吸附劑的配體。純化的蛋白然后在UltiporVF過濾器(PALL)上進(jìn)行除去病毒的過濾，濃縮，并對含有His/HisHCL(pH6.0-6.5)、吐溫-80和海藻糖的最終緩沖液進(jìn)行滲濾。蛋白濃度為50mg/mL或者更高。所獲得的蛋白的純度通過SDS-PAGE評估(圖11)。另外，產(chǎn)物的聚集組合物通過凝膠高效液相色譜評估。使用Agilent1100系統(tǒng)和TosohTSK-GelG3000SWXL7.8mm×30cm柱(Cat.No.08541)與TosohTSKgelGuardSWXL6.0mm×4.0cm預(yù)先柱(particlesof7μm,Cat.No.08543)進(jìn)行色譜分析。在214nm和280nm波長處檢測，在0.5mL/min流速下，用含有50mM磷酸鈉緩沖液和0.3MNaCL(pH7.0)的流動相進(jìn)行等度洗脫。用PBS(pH7.5)稀釋抗體樣品到～1mg/mL的濃度。注射體積為10μL。凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)混合物(Bio-Rad,Cat.No.151-1901)用于在檢測之前對柱子進(jìn)行校準(zhǔn)。圖13呈現(xiàn)了通過凝膠高效液相色譜獲得的結(jié)果。BCD085基質(zhì)中的聚集量是0.312％。實(shí)施例10阻斷IL-17A誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6能力的細(xì)胞檢測IL-17通過人HT1080細(xì)胞(ATCC:CCL-121)誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生的能力用于分析BCD085關(guān)于人重組IL-17的中和能力。細(xì)胞生長于DMEM培養(yǎng)基上，其添加有10％滅活的胎牛血清、慶大霉素和谷氨酰胺。5*104細(xì)胞/孔的等分試樣植于96孔培養(yǎng)板中。允許細(xì)胞附著5h。40ng/mL重組IL-17和20ng/mLTNF-α的混合物用BCD085稀釋液在37℃下孵育1h。然后添加細(xì)胞因子/抗體混合物到細(xì)胞中，并保持過夜。通過HT1080細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生IL-6與添加的IL-17的含量成比例。通過ELISA技術(shù)，使用DuoSetELISADevelopmentSystemHumanIL6(RDSystem,Cat.No.DY206)評估細(xì)胞上清液樣品中釋放的IL-6的量。圖13中顯示了，與AIN457(Novartis的抗IL-17A抗體)相比較，從BCD085候選物的拮抗特性評估獲得的結(jié)果。從一系列實(shí)驗(yàn)獲得的該候選物的平均IC50為40±15pM。實(shí)施例11檢測BCD085對來自不同生物體的IL-17A的親和力在OctetRed96(ForteBio)上分析BCD085結(jié)合人、猴和鼠IL-17A的親和力。根據(jù)制造商的手冊中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案，把BCD085非特異性固定到胺反應(yīng)性第二代傳感器(AR2G)的表面。在30℃的溫度，使用具有0.1％吐溫-20和0.1％BSA的PBS作為工作緩沖液進(jìn)行檢測。用工作緩沖液滴定人、猴和鼠IL-17A，從126nM到2nM的濃度，以2的增量。使用OctetDataAnalysis軟件(版本7.0)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，使用1:1相互作用模型，分析結(jié)合曲線(減去參考信號后)，如圖14A和14B所示結(jié)果。BCD085以皮摩爾親和力結(jié)合人IL-17A，其比與猴IL-17A的納摩爾親和力強(qiáng)1000倍。而且，該候選物不與鼠IL-17A相互作用(沒有提供曲線)。實(shí)施例12檢測BCD085在熱壓下的聚集穩(wěn)定性PBS中的9mg/mL的BCD085制品在50℃的溫度下加熱6h。通過凝膠高效液相色譜評估熱脅迫后的聚集。用TosohTSK-GelG3000SWXL柱(7.8mm×30cm,Cat.No.08541)和TosohTSKgelGuardSWXL預(yù)先柱(6.0mm×4.0cm,7μmparticles,Cat.No.08543)，在Agilent1100系統(tǒng)上進(jìn)行色譜分析。在214nm和280nm波長處檢測，在0.5mL/min流速下，用含有50mM磷酸鈉緩沖液和0.3MNaCL(pH7.0)的流動相進(jìn)行等度洗脫。用PBS(pH7.5)稀釋抗體樣品到～1mg/mL的濃度。注射體積為10μL。凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)混合物(Bio-Rad,Cat.No.151-1901)用于在檢測之前對柱子進(jìn)行校準(zhǔn)。圖15中顯示的結(jié)果表明BCD085在熱壓下是穩(wěn)定的：聚集量低于5％。實(shí)施例13在單劑量皮下施用給猴后，BCD085單克隆抗IL-17A抗體的藥物動力學(xué)研究以40mg/kg的劑量，將單克隆抗IL-17A抗體BCD085單次皮下注射施給獼猴(Macacamulatta)。以規(guī)定的時間間隔(給藥0.5、1、3、6、12、24、36、48、60、72、96、120、168、264、336、432、504、672、840和1008小時后)，選擇動物血液樣品，并通過標(biāo)準(zhǔn)程序獲得血清。通過ELISA，對固定的人IL-17A(R&DSystems)評估BCD085抗體的血清水平，其中使用抗人IgG的Fc片段的多克隆山羊抗體(Pierce-ThermoScientific)檢測結(jié)合的抗體。圖16中顯示了在單劑量皮下施藥給獼猴后，從抗IL-17A單克隆抗體血清濃縮物分析獲得的結(jié)果。這表明BCD085顯示顯著的長期效應(yīng)，也即在血液中循環(huán)很長時間。單劑量皮下給藥后，在72-168小時后觀察到動物血清中抗IL-17A單克隆抗體最高濃度，同時該水平保持400小時，然后僅僅非常緩慢地降低，甚至在1000小時后，BCD085濃度顯著高于基線。單劑量皮下施藥給獼猴后，關(guān)于BCD085的評估的PK參數(shù)列于表2中。能夠看出本發(fā)明的單克隆抗IL-17A抗體的清除(Cl)是0.25±0.08mL/h/kg，其確保了它的長期血液循環(huán)(超過42天)。抗IL-17A單克隆抗體的平均滯留時間和清除半衰期分別是946±374h和632±253h。表2.在單劑量皮下施藥40mg/kg給獼猴后，所要求的抗IL-17A單克隆抗體的主要藥物動力學(xué)參數(shù)實(shí)施例14含有本發(fā)明抗體的藥物組合物實(shí)施例15含有抗體藥物組合物的試劑盒通過將根據(jù)實(shí)施例14獲得的藥物組合物無菌密封到1mL安瓿瓶或注射器中，然后貼標(biāo)簽并裝入到塑料或紙板箱容器中，來生產(chǎn)包括含有抗IL-17抗體的藥物組合物的試劑盒。另外，帶有安瓿瓶的容器還包括包裝說明書。當(dāng)前第1頁1 2 3