本申請涉及男性不育癥檢測領(lǐng)域，尤其涉及非梗阻性無精子癥檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
全球約有10％-15％的育齡夫婦面臨不能生育的問題，其中一半是由于男性不育。原發(fā)性無精子癥是造成男性不育的一個非常重要的原因，約影響1％的成年男性。男性不育發(fā)病因素具有復(fù)雜性和多樣性的特點，包括疾病、營養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂、基因缺陷和環(huán)境因素等，其具體發(fā)病機制尚不明確，但從家族病例報道和小鼠模型的研究成果中可以推斷遺傳因素起了很大作用。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已發(fā)現(xiàn)近200個基因與男性不育癥的發(fā)生密切相關(guān)；采用基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)近400個基因與小鼠精子發(fā)生密切相關(guān)，這些基因的突變、缺失或表達異常，可能是男性不育癥發(fā)生的重要原因。大多數(shù)基因表達異?？墒骨啻浩诎l(fā)育受損，隨后由于下丘腦-垂體對性腺或其基因有重要促進作用的因子缺乏，最終引起男性不育。劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)先天性腎上腺發(fā)育不良基因1(Dosage-sensitivesexreversal,adrenalhypoplasiacriticalregion,onchromosomeXgene1,DAX-1)即屬于下丘腦-垂體-性腺軸上的基因，其編碼的蛋白是核受體家族的成員。DAX-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子對垂體促性腺細胞和腎上腺皮質(zhì)的發(fā)育起非常重要的作用。人類DAX-1基因位于X染色體p21，于1994年克隆成功。該基因編碼的蛋白由470個氨基酸組成，是核受體家族中的一員，主要在下丘腦、垂體、腎上腺以及性腺中表達，對垂體促性腺細胞和腎上腺皮質(zhì)的發(fā)育起非常重要的作用。越來越多的研究表明先天性腎上腺發(fā)育不良(Adrenalhypoplasiacongenital,AHC)和低促性腺激素性性功能不全(Hypogonadotropichypogonadism,HH)的發(fā)病與DAX-1突變有關(guān)。由于DAX-1基因位于Xp上的DSS區(qū)，當(dāng)該區(qū)雙拷貝時常伴有46，XY男性的性反轉(zhuǎn)(女性化)，所以起初DAX-1被認為是卵巢決定基因。但是，隨后的條件敲除研究結(jié)果表明它在調(diào)節(jié)精子發(fā)生中起重要作用，敲除后的雄性小鼠表現(xiàn)為性腺機能減退、睪丸發(fā)育異常、生精障礙等。Holter等人的研究表明，雄激素受體(Androgenreceptor,AR)是DAX-1的一個新的作用靶點，DAX-1通過與AR直接相互作用抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種與非梗阻性無精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明提供一種與非梗阻性無精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其核苷酸序列是DAX-1基因的序列，所述序列的突變位點選自c.152G>A、c.312C>G、c.725C>T、c.766G>C、c.1153G>T、c.1279A>G和c.162G>A中的一個或多個。前6個突變是錯義突變，第7個突變是同義突變。上述突變分別是在DAX-1基因序列的第152位點、312位點、725位點、766位點、1153位點、1279位點和162位點。一種與非梗阻性無精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其核苷酸序列是DAX-1基因的序列，所述序列的突變位點選自c.152G>A、c.312C>G、c.725C>T、c.766G>C、c.1153G>T和c.1279A>G中的一個或多個。所述突變位點是c.1153G>T。檢測所述的遺傳標(biāo)記的引物對，選自primer1、primer2、primer3或primer4引物對，其中，所述primer1引物對的上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，其下游引物的序列如SEQIDNO:2所示；所述primer2引物對的上游引物的序列如SEQIDNO:3所示，其下游引物的序列如SEQIDNO:4所示；所述primer3引物對的上游引物的序列如SEQIDNO:5所示，其下游引物的序列如SEQIDNO:6所示；所述primer4引物對的上游引物的序列如SEQIDNO:7所示，其下游引物的序列如SEQIDNO:8所示。一種非梗阻性無精子癥的檢測試劑盒，能夠特異性識別所述的遺傳標(biāo)記。該遺傳標(biāo)志尤其是c.1153G>T突變。一種所述的遺傳標(biāo)記在制備非梗阻性無精子癥檢測試劑盒上的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：通過大規(guī)模測序在非梗阻性無精子癥病人中篩選出了DAX-1基因7個新的突變位點，構(gòu)建DAX-1野生型及突變體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)進行研究，通過實驗發(fā)現(xiàn)其功能有明顯差異，表明DAX-1的上述突變可能導(dǎo)致非梗阻性無精子癥的發(fā)生，從而能夠通過該突變來實現(xiàn)對男性不育癥(尤其是非梗阻性無精子癥)的診斷檢測。附圖說明圖1是無精子癥患者DAX-1基因的6個錯義突變位點測序圖譜；圖2是免疫共沉淀檢測DAX-1野生型及突變體與AR的結(jié)合的結(jié)果圖；圖3是DAX-1突變體與AR相互作用后對AR下游靶基因MMTV表達的影響的結(jié)果圖。具體實施方式下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。1實驗內(nèi)容1.2.1標(biāo)本的收集本申請人從2007年6月到2011年10月共收集1880例無精子癥病人，其中非梗阻性無精子癥病人為776例，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：1)隨機檢查三次精液中無精子；2)生殖系統(tǒng)或盆腔無阻塞、炎癥和損傷；3)無核型異常和Y染色體微缺失，另將706例正?？捎行?至少育有一個孩子且未行IVF、ICSI、IMSI等人類輔助生殖技術(shù))作為對照進行研究。每例受試者均認真簽署知情同意書，本次研究通過醫(yī)院倫理委員會的審查批準(zhǔn)。1.2.2外顯子測序抽取外周血提取基因組DNA，用枸櫞酸鈉抗凝管收集研究對象的外周血，迅速置于-80℃冰箱中備用，用QIAampDNABloodMiniKit試劑盒提取外周血DNA。取出5ug基因組DNA送華大基因研究中心(深圳)進行外顯子捕獲、測序，在非梗阻性無精子癥患者中篩選出DAX-1基因中的7個新的突變位點，其中6個錯義突變和1個同義突變，與dbSNP135數(shù)據(jù)庫和千人基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，均未發(fā)現(xiàn)此7種突變，而在706例正常男性中也未發(fā)現(xiàn)這7種新的變異。1.2.3驗證錯義突變以提取的外周血基因組DNA為模板，使用設(shè)計合成的4對引物對僅在非梗阻性無精子癥患者(W024，W033，W251，W505，W520，W566，W570，W628，W698)DAX-1基因存在的6個錯義突變位點進行特異性擴增，DAX-1序列從NCBI數(shù)據(jù)庫中查得。引物由Invitrogen公司合成，所合成的4種引物見表1。DAX-1基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號是GeneID:190。采用primer1引物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQIDNO:23所示；采用primer2引物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQIDNO:24所示；采用primer3引物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQIDNO:25所示；采用primer4引物對的PCR產(chǎn)物的序列如SEQIDNO:26所示。表1DAX-1點突變驗證引物PCR擴增條件為：98℃預(yù)變性2min，然后以98℃10s、60℃30s、72℃45s進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。DNA電泳：取3μlPCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠孔中，140V電泳，15min，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察電泳圖，確保單一條帶，其余PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司測序。1.2.4質(zhì)粒構(gòu)建1.2.4.1DAX-1野生型表達質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.4.1.1人DAX-1基因cDNA編碼區(qū)全長序列的獲取將人睪丸組織RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板，設(shè)計含有HindⅢ和BamH1兩種限制性酶切位點的引物，以3’帶HA多肽標(biāo)簽的pcDNA3.1(+)為載體，構(gòu)建野生型DAX-1表達質(zhì)粒。帶有酶切位點的引物序列為：上游：5'-CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC-3'(SEQIDNO:9)下游：5'-CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG-3'(SEQIDNO:10)其中上游引物5’端含有HindⅢ酶切位點，下游引物5’端含有BamH1酶切位點。1.2.4.2DAX-1突變體表達質(zhì)粒的構(gòu)建：以測序正確的pcDNA3.1-DAX1為模板，使用設(shè)計合成的6對點突變引物，構(gòu)建DAX-16種突變體表達質(zhì)粒。引物由Invitrogen公司合成，所合成的6對引物見表2。表2DAX-16對定點突變引物1.2.5雙縈光素酶報告基因?qū)嶒?.2.5.1質(zhì)粒準(zhǔn)備野生型DAX-1表達載體：pcDNA3.1-DAX-1WT(WT組)突變型DAX-1表達載體：pcDNA3.1-DAX-1R51K(R51K組)pcDNA3.1-DAX-1C104W(C104W組)pcDNA3.1-DAX-1A242V(A242V組)pcDNA3.1-DAX-1E256Q(E256Q組)pcDNA3.1-DAX-1V385L(V385L組)pcDNA3.1-DAX-1I427V(I427V組)1.2.5.2HeLa細胞培養(yǎng)將HeLa細胞用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2和95％濕度條件下培養(yǎng)。貼壁細胞在長滿瓶底時，用0.25％胰蛋白酶消化后按比例進行傳代培養(yǎng)。1.2.5.3HeLa細胞瞬時轉(zhuǎn)染將HeLa細胞接種于24孔板，待細胞貼壁后進行轉(zhuǎn)染，方法參考轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染6h后，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔再加入新的1640培養(yǎng)基500μl，減少Lipofectamine2000對細胞的毒性。1.2.5.4雙縈光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子活性1)轉(zhuǎn)染24h后收集細胞，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔加入PBS1ml洗滌2次；2)將5×PassiveLysisBuffer稀釋成1×PassiveLysisBuffer，用移液槍向每孔加入100μlPassiveLysisBuffer；3)室溫下在搖床上裂解細胞15min，用微量移液槍分別吸取每孔細胞裂解液5μl至一個干凈的1.5mL透明EP中；4)在避光環(huán)境中依次向每個EP管中加入19μlLuciferaseAssayⅡBuffer后用單管光度計檢測螢火蟲縈光照度；5)在避光環(huán)境中依次再向每個EP管中加入19μlSTOPBuffer后用單管光度計檢測海腎縈光照度，以螢火蟲縈光來校正海腎縈光減少實驗誤差。測定報告基因的相對活性。1.2.6免疫共沉淀實驗1.2.6.1質(zhì)粒準(zhǔn)備人AR表達質(zhì)粒：pcDNA3.1-AR野生型DAX-1表達載體：pcDNA3.1-DAX-1WT(WT組)突變型DAX-1表達載體：pcDNA3.1-DAX-1R51K(R51K組)pcDNA3.1-DAX-1C104W(C104W組)pcDNA3.1-DAX-1A242V(A242V組)pcDNA3.1-DAX-1E256Q(E256Q組)pcDNA3.1-DAX-1V385L(V385L組)pcDNA3.1-DAX-1I427V(I427V組)1.2.6.2HeLa細胞培養(yǎng)將HeLa細胞用含10％胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2和95％濕度條件下培養(yǎng)。貼壁細胞在長滿瓶底時，用0.25％胰蛋白酶消化后按比例進行傳代培養(yǎng)。1.2.6.3細胞總蛋白的提取用含有10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細胞，放置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，按照無菌操作臺內(nèi)的常規(guī)細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞以3×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，待第二天細胞貼壁后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染步驟，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-3’HA-DAX1WT及6種突變體mut1-mut6(實驗組，2ug)和pcDNA3.1(+)-3’HA空載(對照組，2ug)與hAR的表達載體(2ug)分別共轉(zhuǎn)染到HeLa細胞。轉(zhuǎn)染48h后吸棄培養(yǎng)基，根據(jù)Qiagene公司的哺乳動物蛋白提取試劑盒的提取步驟用1×PBS溶液洗滌2次，加入1ml預(yù)冷的PBS用細胞刮輕輕掛下，轉(zhuǎn)移到1.5ml的Ep管，450×g，4℃離心5min，棄掉上清置于冰上，用100ulLysisBuffer(含0.1UBenzonaseNuclease,1ul100×ProteaseInhibitor)重懸沉淀，4℃旋轉(zhuǎn)5min后，14,000×g,4℃離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。1.2.6.4免疫共沉淀將實驗組與對照組提取的蛋白平均分成4分，其中一份作為Input樣品，加入6.25ul的5×SDSLoadingBuffer(含5％1mMDTT)，混勻后98℃處理10min，-80℃保存。余下3份上清液均加入475ul的LysisBuffer或Co-IPBuffer，補充至每管總體積為500ul，之后分別加入2ugAR抗體，2ugHA抗體，2ugIgG；4℃旋轉(zhuǎn)1h；每管加入50ul預(yù)處理后的ProteinA/GBeads4℃旋轉(zhuǎn)過夜。4℃旋轉(zhuǎn)過夜后12,000×g，4℃瞬時離心20s，棄上清；加入600ulLysisBuffer重懸,12,000×g，4℃離心1min洗滌Beads(不用槍頭吸，用手彈起即可)，共洗滌3次，用槍吸出上清,但不要吸干，注意不能吸到Beads；向Beads中加入15ul的LysisBuffer和等體積2XSDS上樣緩沖液，混勻后98℃處理10min，將蛋白即抗原抗體復(fù)合物從Beads上解離下來，即可用于蛋白電泳。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量15ul，常規(guī)電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含有5％脫脂奶粉的TBS-T緩沖液(0.02MTris-Cl，pH7.6，0.137MNaCl，0.1％Tween-20)室溫封閉1小時后，棄去封閉液。加入一定量適當(dāng)稀釋于含5％脫脂奶粉的TBS-T緩沖液中的識別目的蛋白的一抗(鼠抗人HA和兔抗人AR單克隆抗體，1:2000稀釋)，4℃過夜；棄去一抗，TBS-T緩沖液清洗3次，每次5分鐘。加入一定量適當(dāng)稀釋于含5％脫脂奶粉的TBS-T緩沖液中的二抗(1:10000稀釋)，室溫孵育1小時；棄去二抗，TBS-T緩沖液清洗3次，每次5分鐘。在膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物，然后用X光片曝光，經(jīng)沖片機自動顯影定影。1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析所用統(tǒng)計學(xué)方法來自于SPSS17.0軟件，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均值的比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2實驗結(jié)果2.1非梗阻性無精子癥患者DAX-1基因點突變的鑒定對776例非梗阻性無精子癥患者和706例正?？捎行缘腄AX-1基因的外顯子測序結(jié)果分析，如表3所示：DAX-1基因的7個新突變均為純合突變，突變位點分別為：c.152G>A(p.R51K)、c.312C>G(p.C104W)、c.725C>T(p.A242V)、c.766G>C(p.E256Q)、c.1153G>T(p.V385L)、c.1279A>G(p.I427V)和c.162G>A(p.L54L)，前6個位錯義突變，最后1個為同義突變，與dbSNP135數(shù)據(jù)庫和千人基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，均未發(fā)現(xiàn)有這些突變，而在706例正?？捎行灾幸参窗l(fā)現(xiàn)這些新的變異(如表3所示)。進一步的PCR驗證錯義突變的結(jié)果如圖1所示。表3DAX-1點突變在非梗阻性無精子癥組和正常組中的情況注：病人編號以W開頭，僅編號7為同義突變。2.2DAX-1野生型及突變體與AR在細胞內(nèi)的結(jié)合作用為了進一步檢測DAX-1突變后與AR的相互作用情況，采用免疫共沉淀技術(shù)，在HeLa細胞中分別共轉(zhuǎn)入hAR和DAX-1野生型及突變體表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后收集細胞提取總蛋白，做anti-AR和anti-HA的免疫共沉淀以及anti-AR和anti-HA的WesternBlot檢測蛋白的相互作用和表達情況，結(jié)果顯示與DAX-1野生型相比，僅DAX-1V385L突變體與AR的結(jié)合減弱。2.3DAX-1突變體與AR相互作用后對AR下游靶基因MMTV表達的影響DAX-1作為輔因子與AR相互作用來調(diào)控下游基因的表達，為了進一步檢測DAX-16種突變體與AR相互作用后對AR下游靶基因MMTV表達的影響，采用雙縈光素酶報告基因?qū)嶒?，將AR表達質(zhì)粒和MMTV-LUC與DAX-1野生型及6種突變體質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中，由于AR屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，因此轉(zhuǎn)染后用雄激素進行處理，將檢測到的螢火蟲縈光值/海參縈光值來表示啟動子的活性。與野生型DAX-1一致，DAX-1R51K,C104W,A242V,E256Q,I427V突變體也可以明顯抑制MMTV啟動子的活性，僅DAX-1V385L突變體與野生型有顯著差異，不能抑制MMTV啟動子的活性，如圖3所示。3討論DAX-1基因突變主要表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)發(fā)育不全，伴或不伴有低促性腺激素性性腺功能減退。由于多數(shù)患者首發(fā)癥狀典型，確診并不容易。DAX-1基因為孤兒核受體，在腎上腺皮質(zhì)、性腺、下丘腦和垂體中表達。DAX-1基因含2個外顯子，共編碼470個氨基酸。1994年Muscatelli等首次報道DAX-1單基因突變與AHC和HH突變有關(guān)，上海瑞金醫(yī)院2007年在國內(nèi)首次報道了此病患者。DAX-1基因突變類型的發(fā)生頻率依次為單獨或伴有鄰近基因共同缺失(約40％)、移碼突變(約28％)、無義突變(約18％)和錯義突變(約14％)。多數(shù)突變位點位于推測的配體結(jié)合區(qū)域，致使其轉(zhuǎn)錄功能受損。本實驗研究發(fā)現(xiàn)7個DAX-1基因點突變中有6個為錯義突變，1個為同義突變，且與dbSNP135數(shù)據(jù)庫和千人基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，均未發(fā)現(xiàn)有這些突變。Holter等人的研究表明，雄激素受體AR是DAX-1的一個新的作用靶點，DAX-1通過與AR直接相互作用抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性。本實驗通過構(gòu)建DAX-1野生型及突變體表達質(zhì)粒，研究DAX-1在細胞中的功能。通過測序結(jié)果及功能研究分析DAX-1野生型及突變體表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，DAX-1V385L突變體的功能與DAX-1野生型相比有顯著性差異。DAX-l在下丘腦、垂體、腎上腺和性腺等組織中均有表達。免疫組化證實：從第11.5天開始，DAX-l在胚鼠前腦中表達，第13.5天在垂體前葉中表達，第l4.5天在間腦腹側(cè)表達，第l8天在丘腦下部的腹內(nèi)側(cè)核中表達。且研究證實小鼠性腺發(fā)育的不同時期均有DAX-l的表達：從第9天胚鼠出現(xiàn)尿生殖嵴時開始表達DAX-1；性別分化后，在雄性小鼠睪丸中DAX-l的水平先迅速下降，然后逐漸升高，第l2天在Sertoli細胞和Leydig細胞中達到高峰，推測DAX-l在睪丸發(fā)育晚期可能具有調(diào)控雄性特異性基因的作用；但在雌性小鼠中則不同，第l3.5天時性腺中仍有表達，并持續(xù)到成年，但作用不詳。人DAX-1基因位于Xp2l，人與鼠DAX-1基因同源性為65％。它是不典型的孤核受體家族成員，缺乏DNA結(jié)合域，在脊椎動物孤核受體家族中屬于第0類。DAX-l也有一個保守的LBD，它的N端重疊區(qū)是一個鋅指的保守序列，可與DNA上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)合。核受體通常均有保守的LBD，通過與配體結(jié)合可激活核受體的靶基因。DAX-l可能是進化過程中出現(xiàn)較早的核受體家族，在演變過程中LBD發(fā)生突變，失去與配體結(jié)合的能力，因此雖然DAX-l有LBD，但目前尚未找到它的配體。本實驗通過對臨床資料的收集，利用大規(guī)模測序技術(shù)在非梗阻性無精子癥病人中篩選DAX-1基因的突變位點，功能試驗結(jié)果顯示DAX-1V385L突變體及DAX-1野生型在細胞內(nèi)的功能有顯著差異，提示這個突變位點與非梗阻性無精癥的發(fā)生存在相關(guān)性，DAX-1可能是臨床男性不育一個潛在的診療靶點。4結(jié)論4.1通過大規(guī)模測序篩選出僅在非梗阻性無精子癥患者中DAX-1基因的6個錯義突變，其相應(yīng)的氨基酸改變?yōu)椋篟51K、C104W、A242V、E256Q、V385L、I427V，與dbSNP135數(shù)據(jù)庫和千人基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，均未發(fā)現(xiàn)有這些突變。4.2DAX-1野生型及DAX-1V385L突變體與AR在細胞內(nèi)的結(jié)合作用有顯著差異。4.3DAX-1V385L突變體與AR相互作用后對AR下游靶基因MMTV的表達與DAX-1野生型相比有顯著性差異。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。