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(7S)?3,4?二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛?1,3,5?三烯?7?甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其鹽的合成中的應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):11972124閱讀:238來源:國知局
(7S)?3,4?二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛?1,3,5?三烯?7?甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其鹽的合成中的應(yīng)用與流程
(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其鹽的合成中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域。更具體而言,本發(fā)明涉及酶合成式(I)化合物的方法:還涉及該化合物在式(II)的伊伐布雷定或3-{3-[{[(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]甲基}(甲基)氨基]丙基}-7,8-二甲氧基-1,3,4,5-四氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮、其藥學(xué)上可接受的酸的加成鹽及其水合物的合成中的應(yīng)用:

背景技術(shù):
伊伐布雷定及其與藥學(xué)上可接受的酸的加成鹽(更特別的是其鹽酸鹽)具有非常有價(jià)值的藥理學(xué)和治療特性,特別是具有減慢心率的特性,這使得這些化合物可以用于治療或預(yù)防各種心肌缺血疾病,例如心絞痛、心肌梗塞及相關(guān)心律失常疾病以及與心律失常有關(guān)的各種病理,特別是室上性心律失常疾病和心力衰竭。伊伐布雷定及其藥學(xué)上可接受的酸的加成鹽(特別是其鹽酸鹽)的制備和治療用途已經(jīng)公開于歐洲專利說明書EP0534859。該專利說明書描述了采用式(III)化合物(7S)-1-(3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)N-甲基甲胺作為起始原料的伊伐布雷定鹽酸鹽的合成:式(III)化合物是在伊伐布雷定及其藥學(xué)上可接受的鹽的合成中的關(guān)鍵中間體?,F(xiàn)有技術(shù)公開了獲得式(III)化合物多種方法。專利說明書EP0534859描述了通過下列步驟合成式(III)化合物的方法:首先在四氫呋喃中通過BH3還原式(IV)的腈:隨后加入鹽酸,得到外消旋的式(V)胺的鹽酸鹽:將其與氯代甲酸乙酯反應(yīng),得到式(VI)的氨基甲酸酯:將其通過LiAlH4還原,獲得外消旋的式(VII)的甲基化胺:將其采用樟腦磺酸拆分,獲得式(III)化合物。該方法采用外消旋的式(IV)的腈制備式(III)化合物的缺點(diǎn)在于收率非常低,僅有2-3%。該非常低的收率是由于式(VII)的仲胺的拆分步驟的收率低(4-%)導(dǎo)致的。專利說明書EP2166004描述了通過下述方法獲得式(III)化合物的方法:首先采用手性色譜對(duì)外消旋的式(IV)的腈進(jìn)行光學(xué)拆分,獲得光學(xué)純的式(IX)的腈:將其采用NaBH4還原或者通過水解的氫還原,獲得式(VIII)的伯胺。然后,該伯胺可以采用與上述相同的反應(yīng)順序進(jìn)行甲基化(轉(zhuǎn)化為氨基甲酸酯,然后還原)。因此,采用外消旋的式(IV)的腈作為起始原料,可以通過5步反應(yīng)獲得式(III)化合物,拆分步驟的收率達(dá)到45.6%。為了能夠采用外消旋的式(IV)的腈作為起始原料直接獲得光學(xué)純的式(I)的酸并且從而減少采用外消旋的腈作為原料獲得甲基化的式(III)的胺的步驟數(shù)目,采用水解的腈水解酶(在酶的國際分類中為EC3.5.5.1)似乎具有很好的前景。式(X)的腈已有報(bào)道可以作為獲自Almac公司銷售的NESK-1400篩選試劑盒的腈水解酶的底物:然而,采用這些相同的腈水解酶顯示它們對(duì)式(IV)的腈(參考對(duì)比實(shí)施例A)具有較低的活性并且?guī)缀鯖]有選擇性,在大多數(shù)情況下導(dǎo)致酰胺(腈水合酶活性)和酸的同時(shí)形成,這難以開發(fā)出為了獲得式(III)化合物合成中所需要的中間體的合成方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
因此,本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)能夠采用外消旋的式(IV)的腈作為原料對(duì)映選擇性合成光學(xué)純的式(I)的酸同時(shí)盡可能減少酰胺形成的腈水解酶。本申請(qǐng)人在各種完整微生物中發(fā)現(xiàn)了能夠優(yōu)先形成構(gòu)型為S的式(I)的酸的腈水解酶活性的證據(jù)。在測(cè)試的微生物中,只有玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodocrous)能夠以良好對(duì)映選擇性獲得(S)酸并且不會(huì)形成酰胺(參考對(duì)比實(shí)施例B)。該活性可以通過腈水解酶的過度表達(dá)而提高。令人驚奇的是,采用過度表達(dá)的腈水解酶進(jìn)行的酶的水解對(duì)于式(X)的底物沒有對(duì)映選擇性(參考對(duì)比實(shí)施例C)。更具體地講,本發(fā)明涉及合成光學(xué)純的式(I)化合物的方法:該方法采用在另一種具有活性的生物學(xué)系統(tǒng)的微生物(例如細(xì)菌、酵母菌或真菌)中過度表達(dá)的玫瑰色紅球菌NCIMB11216的腈水解酶通過外消旋的或非光學(xué)純的式(IV)的腈的對(duì)映選擇性酶水解進(jìn)行:該反應(yīng)在有機(jī)溶劑和pH為5-10的水溶液(優(yōu)選pH5-10的緩沖液)的混合物中進(jìn)行,每升溶劑混合物中式(IV)的腈的濃度為1-500g/L,優(yōu)選2-100g/L,E/S的比例為1/1-1/100,反應(yīng)溫度為25℃-40℃。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,所述腈水解酶在包含重排質(zhì)粒的細(xì)菌中過度表達(dá),例如大腸桿菌(Escherichiacoli),優(yōu)選E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)pLysS、E.coliBL21star(DE3)或E.coliJM9(DE3)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,所述有機(jī)溶劑為與水完全混溶或部分混溶的溶劑,例如二甲基亞砜、DMF、丙酮、乙腈、醇(例如乙醇或異丙醇)或醚(例如THF或MTBE)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,所述有機(jī)溶劑不與水混溶,例如烴類,如庚烷或辛烷。水溶液優(yōu)選為pH約為7的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,所述過度表達(dá)腈水解酶的細(xì)菌可以直接在工藝過程中使用,以細(xì)菌漿液或凍干物的形式使用。在細(xì)菌漿液的情況下,所述E/S比例優(yōu)選自1/1至1/10,在凍干物的情況下,該比例優(yōu)選為1/10-1/20。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,所述腈水解酶以純化酶的形式使用。本發(fā)明的酶水解模式如下:方便的話,構(gòu)型為(R)的腈(副反應(yīng)產(chǎn)物)可以通過有機(jī)堿(例如DBU)或無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀或碳酸鈉)的作用從而再循環(huán)到酶水解過程中。當(dāng)外消旋步驟在位進(jìn)行時(shí),本發(fā)明的方法為動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分(DKR)方法,它使得獲得的式(I)的S酸的ee大于98%成為可能。優(yōu)選在一或多個(gè)酶水解循環(huán)后,將式(I)酸從反應(yīng)介質(zhì)中分離。定義光學(xué)純的化合物應(yīng)當(dāng)是指對(duì)映體過量百分?jǐn)?shù)大于或等于90%的化合物。非光學(xué)純的腈應(yīng)當(dāng)是指對(duì)映體過量百分?jǐn)?shù)小于90%的腈。外消旋的腈應(yīng)當(dāng)是指比例為55:45-45:55的兩種對(duì)映體的混合物形式的腈。外消旋的或非光學(xué)純的腈的對(duì)映選擇性水解應(yīng)當(dāng)是指所述對(duì)映體混合物中的一種優(yōu)先水解?;钚陨飳W(xué)系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)是指其基因物質(zhì)通過基因重組修飾后使其能夠產(chǎn)生目標(biāo)重組蛋白的生物學(xué)種屬(宿主細(xì)胞)。為此目的而構(gòu)建的表達(dá)載體(質(zhì)粒)可以使得該目標(biāo)基因的DNA編碼可以轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中,從而可以有效地(過度)表達(dá)功能蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及以僅有兩個(gè)步驟的方法合成式(III)化合物的方法,該方法采用光學(xué)純的式(I)的酸作為原料,將其轉(zhuǎn)化為光學(xué)純的式(XI)的酰胺:將其優(yōu)選通過BH3、NaBH4或LiAlH4還原,獲得式(III)化合物,隨后將式(III)化合物與式(XII)化合物進(jìn)行偶合:其中X代表鹵素原子,優(yōu)選碘原子,或者,在還原劑存在下,將其與式(XIII)化合物進(jìn)行還原胺化反應(yīng):其中R2代表選自CHO和CHR3R4的基團(tuán),其中R3和R4每一個(gè)均代表直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基,或者與攜帶它們的碳一起形成1,3-二氧六環(huán)、1,3-二氧戊環(huán)或1,3-二氧庚環(huán),獲得伊伐布雷定,然后將其轉(zhuǎn)化為藥學(xué)上可接受的酸的加成鹽,所述鹽為無水或水合物形式。在還原胺化反應(yīng)中,式(III)化合物也可以以其藥學(xué)上可接受的酸的加成鹽形式使用,優(yōu)選其鹽酸鹽。在此情況下,伊伐布雷定可以直接以鹽酸鹽的形式獲得。在藥學(xué)上可接受的酸中,可以不加限定提及的是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、抗壞血酸、草酸、甲磺酸、苯磺酸和樟腦酸。在式(III)化合物與式(XIII)化合物的還原胺化反應(yīng)中使用的還原劑中,可以不加限定提及的是氫化物供體化合物(例如三乙?;跖饸浠c或氰基硼氫化鈉)和在催化劑存在下的氫,所述催化劑例如鈀、鉑、鎳、釕、銠或其化合物,特別是它們負(fù)載在載體上或者氧化物形式。優(yōu)選的用于式(III)化合物與式(XIII)化合物的還原胺化反應(yīng)中的還原劑為鈀炭催化的氫。附圖說明附圖1說明采用過度表達(dá)的玫瑰色紅球菌的腈水解酶進(jìn)行的腈的酶水解6小時(shí)后的手性-相HPLC色譜附圖2說明采用NIT115進(jìn)行的腈的酶水解5小時(shí)后的HPLC色譜具體的實(shí)施方式下面的實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明??s寫TFA三氟乙酸TLC薄層色譜DBU二氮雜雙環(huán)十一碳烯DKR動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲基亞砜OD光密度E對(duì)映選擇性系數(shù)ee對(duì)映體過量百分?jǐn)?shù)eq摩爾當(dāng)量HPLC高效液相色譜IPTG異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖酐LB溶源性肉湯培養(yǎng)基MeOH甲醇MTBE甲基叔-丁基醚op光學(xué)或?qū)τ丑w純E/S比例酶/底物的比例,表示為g/gNMR核磁共振(光譜)MS質(zhì)譜THF四氫呋喃TMS四甲基硅烷實(shí)施例1:(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸腈水解酶的過度表達(dá):玫瑰色紅球菌NCIMB11216的腈水解酶蛋白描述于蛋白和基因組數(shù)據(jù)庫。尋找基因(soughtgene)序列列示于EMBL-數(shù)據(jù)庫的ENA(歐洲核苷酸檔案)中的標(biāo)識(shí)(identifier)SVA(序列版本檔案)“EF467367”項(xiàng)下。該序列與UniProtKB/TrEMBL數(shù)據(jù)庫中對(duì)照“A4LA85”一致。采用生產(chǎn)菌株E.coliBL21(DE3),通過表達(dá)載體pET28a-Nit1轉(zhuǎn)化。腈水解酶過度表達(dá)方案描述于AppliedBiochemistryandBiotechnology2010(應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)2010),Vol160(2),第393-400頁。由此轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以直接以細(xì)菌漿液的形式使用,或者在使用前為凍干形式。采用過度表達(dá)的腈水解酶進(jìn)行的酶水解將根據(jù)上述方案轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以5.6×109個(gè)細(xì)胞/mL(OD=1(600nm)的1mL培養(yǎng)基,相當(dāng)于1×109個(gè)細(xì)菌和約10mg的細(xì)菌漿液或1.5mg的凍干物)的濃度攪拌。向250mL的磷酸鹽緩沖液KH2PO4/Na2HPO41/15M(pH7)中加入1g的E.coli凍干物和500mg(c=2g/L,10mM)的3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的2%的DMSO(5mL)溶液。將反應(yīng)混合物保持在30℃,以220rpm的速度旋轉(zhuǎn)攪拌6小時(shí)。在使得待測(cè)定的酸和腈對(duì)映體過量條件下,通過手性-相HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng):ChiralpakIB柱90%正-己烷10%2-PrOH+0.1%TFA1mL/min,30℃,288nm%腈ee(腈)%酸ee(酸)轉(zhuǎn)化率E6小時(shí)49.99450.1970.49>100*對(duì)映選擇性系數(shù)E=ln[1-c(1+ee(酸))]/ln[1-c(1-ee(酸))]6小時(shí)后手性-相HPLC色譜如圖1所示。反應(yīng)6小時(shí)后,反應(yīng)混合物采用1MHCl進(jìn)行酸化從而獲得高酸性pH(pH2),然后采用2×100mL二氯甲烷萃取。吸出有機(jī)相。采用甲苯(2×100mL)二次萃取,使得能夠回收水相中保留的所有產(chǎn)物。有機(jī)相采用飽和的NaCl溶液洗滌,然后經(jīng)無水硫酸鎂干燥。蒸發(fā)溶劑后,獲得粗品產(chǎn)物,將其經(jīng)快速色譜在硅膠柱上于下列條件下純化:柱型:80gSiOHMacherey-Nagel材料和方法:洗脫液:等度洗脫(環(huán)己烷+1%乙酸/乙酸乙酯+1%乙酸75/25)檢測(cè):UV288nm流速:60ml/min結(jié)果:腈(R):收率36%(179mg),ee(R):96%酸(S):收率39%(246mg),ee(S):96%實(shí)施例2:通過(R)腈的外消旋化反應(yīng)制備3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈將100mg的(R)-(3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)腈(0.53mmol)、5mL異丙醇和121mg的DBU(1.5eq.)轉(zhuǎn)移至配備冷凝器和磁力攪拌器的燒瓶中。于65℃加熱2小時(shí),然后使其冷卻至室溫。過濾后獲得目標(biāo)化合物。實(shí)施例3:(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺于室溫下,將實(shí)施例1中獲得的(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸(300mg)懸浮于THF(3ml),然后加入三乙胺(200μl)。向該混合物中緩慢加入氯代甲酸乙酯(150μl)。反應(yīng)混合物沉淀(混合物I)。在另一個(gè)燒瓶中,將甲基胺的2MTHF溶液(2.25ml)與水(1ml)和三乙胺(300μl)一起攪拌。攪拌持續(xù)20分鐘,然后將獲得的混合物加至混合物I中,于室溫下攪拌過夜。然后蒸發(fā)反應(yīng)混合物,經(jīng)制備性HPLC純化。獲得(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺,收率為60%。1HNMR(DMSO-d6,ppm/TMS)=2.61(m;3H);3.16(m;2H);3.71(s;6H);4.05(m;1H);6.78(s;1H);6.81(s;1H);7.78(brs;1H)。實(shí)施例4:(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]N-甲基甲胺將實(shí)施例3中獲得的(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺(450mg)懸浮于四氫呋喃(20mL),然后于室溫下向該反應(yīng)混合物中緩慢加入1.6mL的2MLiAlH4的四氫呋喃溶液。觀察到明顯的氣體溢出,反應(yīng)混合物變得澄清。將反應(yīng)混合物于回流下加熱30分鐘。冷卻至室溫后,水解并用乙酸乙酯萃取。經(jīng)硫酸鎂干燥,然后蒸發(fā)。獲得的殘留物經(jīng)制備性HPLC純化(洗脫液:水/乙腈/三氟乙酸,98/2/0.2-20/80/0.2)30分鐘,得到目標(biāo)產(chǎn)物,收率為46%。1HNMR(DMSO-d6,ppm/TMS)=2.60(m;3H);2.85(m;1H);3.15(m;1H);3.25(dd;1H);3.30(m;1H);3.62(m;1H);3.70(s;6H);6.82(s;1H);6.89(s;1H);8.48(brs;1H)。實(shí)施例5:(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]N-甲基甲胺鹽酸鹽于室溫下,向?qū)嵤├?中獲得的2.2g(10mmol)(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺的45mL四氫呋喃溶液混合物中加入20mL的BH3的四氫呋喃摩爾溶液。攪拌1小時(shí)后,加入10mL的BH3的四氫呋喃溶液。于室溫下攪拌過夜后,滴加20mL乙醇,攪拌混合物直到?jīng)]有氣體溢出(約1小時(shí))。然后滴加20mL鹽酸的乙醇溶液。攪拌4小時(shí)后,過濾獲得的沉淀物(1.2g目標(biāo)產(chǎn)物)。濃縮濾液,將其置于乙酸乙酯/乙醇的80/20混合物中固化,獲得0.65g目標(biāo)產(chǎn)物。合并兩個(gè)沉淀物,獲得1.85g目標(biāo)產(chǎn)物(收率:77%)。實(shí)施例6:伊伐布雷定鹽酸鹽將5.5kg的3-[2-(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)乙基]-7,8-二甲氧基-1,3-二氫-2H-3-苯并氮雜-2-酮、27.5升乙醇和550g鈀炭置于高壓釜中。充入氮?dú)?,然后充入氫氣,?5℃加熱,然后于此溫度下、在5bars壓力下氫化直到理論量的氫被吸收。然后將其冷卻至室溫并對(duì)高壓釜減壓。再加入4kg的(7S)-3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]N-甲基甲胺鹽酸鹽、11升乙醇、5.5升水和1kg鈀炭。充入氮?dú)猓缓蟪淙霘錃?,加熱?5℃,然后于此溫度下、在30bars壓力下氫化直到理論量的氫被吸收。然后再次冷卻至室溫,清空高壓釜,隨后過濾反應(yīng)混合物;濾除溶劑,然后通過通過在甲苯/1-甲基-2-吡咯烷酮混合物中結(jié)晶分離伊伐布雷定鹽酸鹽。由此獲得伊伐布雷定鹽酸鹽,收率為85%,化學(xué)純度大于99%。比較實(shí)施例A:篩選商業(yè)用腈水解酶,用于3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的酶水解稱重待研究的腈水解酶(15mg),為凍干物形式,將其置于試管中,然后加入4mL的0.1MKH2PO4緩沖液(pH=7)和溶于100μlDMSO中的3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈(20mg)。置于28℃和220rpm的培養(yǎng)箱中。24小時(shí)和72小時(shí)后通過HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)化率。24小時(shí)后腈水解酶NIT101、NIT102、NIT103、NIT104、NIT105、NIT106、NIT108、NIT109、NIT111、NIT112和NIT113(Almac)沒有水解該腈(沒有形成酸或酰胺)。采用腈水解酶NIT107、NIT110、NIT114和NIT115(Almac)獲得的結(jié)果如下表所示:分析條件:PhenomenexLUNAHST50*3柱C18(2)2.5μm0%-100%B洗脫8分鐘,流速0.8ml/min,40℃A(1000水+25ACN+1TFA)B(1000ACN+25水+1TFA)然后在另一個(gè)研究中采用腈水解酶NIT115以測(cè)定腈的水解是否為對(duì)映選擇性的。腈水解酶NIT115(12mg;Almac)在6mL[2mg/mL]緩沖液中使用。加入3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈使得其終濃度達(dá)到4mg/mL。采用下列分析條件通過HPLC測(cè)定對(duì)映選擇性:ChiralpakIC250*4.6柱30%無水乙醇+0.1%TFA+70%庚烷+0.1%TFA1ml/min,30℃,288nm注意:在這些條件下分離酸的對(duì)映體而非腈的對(duì)映體。反應(yīng)5小時(shí)后獲得的色譜如圖2所示。結(jié)論:沒有觀察到對(duì)映選擇性。比較實(shí)施例B:篩選用于3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的酶水解的細(xì)菌菌株和真菌菌株的腈水解酶采用多種細(xì)菌誘導(dǎo)物(丙腈、芐腈、4-溴芐腈)進(jìn)行的研究顯示,丙腈對(duì)于腈水解酶對(duì)3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的活性提供了最好的誘導(dǎo)。采用72mM的丙腈對(duì)細(xì)菌菌株誘導(dǎo)72小時(shí),將細(xì)胞置于50mL(兩次濃縮,濃度為每毫升10mg的細(xì)胞)的0.1M磷酸鹽緩沖液KH2PO4/K2HPO4(pH=7.3)中,加入溶于2%的DMSOv/v最終的濃度為10mM的3,4-二甲氧基雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈。真菌菌株采用戊腈誘導(dǎo)。在細(xì)菌情況下,所有反應(yīng)混合物均于30℃以220rpm的轉(zhuǎn)速攪拌,在真菌情況下,于27℃攪拌,根據(jù)下述方法通過反相HPLC和手性-相HPLC監(jiān)測(cè)96小時(shí):反相分析:PhenomenexLUNAHST50*3柱,C18(2)2.5μm0%B-100%B洗脫8mins,0.8ml/min,40℃A(1000水+25ACN+1TFA)B(1000ACN+25水+1TFA)手性-相分析:ChiralpakIC250*4.6柱30%無水乙醇+0.1%TFA+70%庚烷+0.1%TFA1ml/min,30℃,288nm獲得的結(jié)果列示于下表:比較實(shí)施例C:采用過度表達(dá)的玫瑰色紅球菌NCIMB11216的腈水解酶的雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的酶水解在LB+瓊脂+卡那霉素上涂板,于37℃靜態(tài)溫育24小時(shí)(重組E.coli的腈水解酶的株11216)。在5ml的LB+卡那霉素(50mg/l)中預(yù)培養(yǎng),于37℃以180rpm培養(yǎng)過夜。培養(yǎng):將50ml的LB和500μl的預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無擋板的250ml錐形瓶中,于28℃、160rpm培養(yǎng)直到OD等于0.6(即約4小時(shí))。采用IPTG(0.5mM)誘導(dǎo),于17℃、160rpm培養(yǎng)過夜(17小時(shí))?;钚栽囼?yàn):將培養(yǎng)物于4℃、6000rpm離心20分鐘,將漿液再懸浮于10ml的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7)中。加入雙環(huán)并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈(10mM)+2%乙醇。以220rpm于30℃培養(yǎng)。注意:如果離心時(shí)培養(yǎng)物多于50mL,則采用50mL培養(yǎng)物的漿液進(jìn)行活性試驗(yàn)。通過手性色譜于45分鐘和2小時(shí)監(jiān)測(cè)水解。柱:LUNAHST50*3C18(2)2.5μm洗脫液:A+B(0%-100%B,8mins)A:1000水+25ACN+1TFAB:1000ACN+25水+1TFA0.8ml/min-40℃-UV210nm結(jié)果:時(shí)間腈羧酸45分鐘50%50%2小時(shí)0%100%通過手性色譜監(jiān)測(cè)顯示該反應(yīng)不是對(duì)映選擇性的。
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