用于預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的低分子量生物技術(shù)6-硫酸軟骨素的制作方法
【專利摘要】本申請公開了通過用生物技術(shù)得到的未硫酸化軟骨素骨架的化學(xué)硫酸化和隨后的解聚而生產(chǎn)的低分子量(1000-5000道爾頓)硫酸軟骨素(CS)。所述的CS基本上是單硫酸化的(主要在6-位)，具有非常少量的4-位硫酸化，并且具有與天然CS類似的單/雙硫酸化二糖比率和電荷密度。所述生物技術(shù)6-硫酸軟骨素(C6S)可用于治療和預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎以及急性和慢性炎癥過程。
【專利說明】用于預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的低分子量生物技術(shù)6-硫酸軟骨素
[0001] 發(fā)明簡述
[0002] 本發(fā)明涉及通過生物工程技術(shù)獲得的未硫酸化軟骨素骨架的化學(xué)硫酸化和隨后 解聚而生產(chǎn)的或者通過初始特征為低分子量的生物技術(shù)來源的多糖硫酸化而生產(chǎn)的極低 分子量（1000-5000道爾頓）的硫酸軟骨素（CS)，以及所述CS在治療和預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎以及 急性和慢性炎癥過程中的用途。具體地講，本發(fā)明涉及生物技術(shù)CS，其基本上是被單硫酸 化的（主要在6-位），幾乎沒有或者沒有4-硫酸根，并且就單/雙硫酸化二糖比率、無三 硫酸化和多硫酸化的二糖、電荷密度和所顯示的生物活性方面，其與天然CS是一致的。根 據(jù)本發(fā)明的6-硫酸軟骨素（C6S)具有比源自陸棲動物（牛、豬和鳥）的動物組織提取的特 征為14, 000-26, 000道爾頓分子量的硫酸軟骨素和源自海生動物（鯊魚、烏賊、鰩（skate) 和硬骨魚）的動物組織提取的都具有>50, 000道爾頓分子量的硫酸軟骨素更低的分子量 (1000-5000道爾頓）。根據(jù)本發(fā)明的C6S還具有比已知類型的低分子量CS甚至更低的分 子量。所述特征賦予根據(jù)本發(fā)明的6-硫酸軟骨素更好的生物利用度，并由此賦予其更大的 效力。
[0003] 低分子量生物技術(shù)6-硫酸軟骨素（C6S)在骨關(guān)節(jié)炎的治療和預(yù)防中的用途被其 在通常用于研究關(guān)節(jié)炎和相關(guān)癥狀的眾所周知的動物模型中抗炎活性的試驗(yàn)驗(yàn)證所支持。 所述的低分子量生物技術(shù)C6S還顯示良好的耐受性，如在根據(jù)用于藥品的OECD指南進(jìn)行的 毒理學(xué)研究所證實(shí)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 基于眾多臨床結(jié)果和多種臨床試驗(yàn)的兀分析（meta-analyses)，EULAR(歐洲風(fēng) 濕病防治聯(lián)合會（EuropeanLeagueagainstRheumatism))目前將硫酸軟骨素（CS)推薦 作為骨關(guān)節(jié)炎的癥狀慢作用藥物（SYSAD0A)用于治療膝蓋（JordanKM等人，Ann.Rheum. Dis. 62,1145, 2003)、髖部（JordanKM等人，Ann.Rheum.Dis. 62,1145, 2003)和手（ZhangW 等人，Ann.Rheum.Dis. 66, 377, 2007)的骨關(guān)節(jié)炎。最近臨床試驗(yàn)也已顯示CS修飾人軟骨組 織的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（ReginsterJY，HeraudF，ZegelsB，Bruyere0·MiniRevMedChem7， 1051,2007。KahanA,UebelhartD,DeVathaireF,DelmasPD,ReginsterJY.Arthritis Rheum60, 524, 2009)。CS還單獨(dú)或與其他成分聯(lián)合地廣泛用作營養(yǎng)制品（McAlindonTE 等人，JAMA283,1469, 2000。VolpiN等人，F(xiàn)oodAnalMeth1，195, 2008。VolpiN等人， SeparationSc1,22,2009)〇
[0006] 硫酸軟骨素（CS)是存在于脊椎動物和無脊椎動物中的屬于糖胺聚糖（GAG)類的 天然多糖，其由通過β1-3鍵相互連接并在不同位置硫酸化的交替的葡糖醛酸（GlcA)和 N-乙?；?D-半乳糖胺（GalNAc)殘基形成的二糖序列組成。
[0007]CS存在于動物組織中，具有結(jié)構(gòu)功能和生理學(xué)功能。根據(jù)其來源，CS主要由不同 百分比的在GalNAc的4位或6位單硫酸化的兩種類型的二糖單元（分別為二糖A和C)構(gòu) 成。CS骨架還含有通常少量的未硫酸化的二糖。根據(jù)具體的動物來源，含有通過氧原子在 不同位置例如GlcA的2位和GalNAc的6位（二糖D)、GlcA的2位和GalNAc的4位或者 GalNAc的4位和6位（二糖E)連接的兩個硫酸根基團(tuán)的二硫酸化二糖可以以不同百分比存 在于CS骨架中（VolpiN.J.Pharm.Pharmacol. 61，1271,2009。VolpiN.J.Pharm.Sci. 96， 3168,2007。VolpiN.Curr.PhaimDes12,639, 2006)。GlcA的 3 位硫酸化的存在是可能 的，但是以極少的量；所述存在在陸棲動物來源的CS中是罕見的，并更可能存在于海生動 物來源的高度硫酸化類型中（FongmoonD等人.JBiolChem282, 36895, 2007)。
[0008]CS的重復(fù)二糖單元的化學(xué)式如下：
[0009]
【權(quán)利要求】
1. 具有抗炎和抗關(guān)節(jié)炎生物活性的、具有1000-5000道爾頓分子量的硫酸軟骨素，其 特征為：等于或大于65%百分比的6-單硫酸二糖、〈1%百分比的4-單硫酸二糖、低于或 等于20 %百分比的2, 6-二硫酸二糖、小于5 %百分比的4, 6-二硫酸二糖、〈1 %百分比的 2, 4-二硫酸二糖、〈15%百分比的未硫酸化二糖以及1-1. 25的電荷密度值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素，其如下獲得：在利用水解除去果糖殘基后，將大 腸桿菌莢膜多糖K4化學(xué)硫酸化以及隨后進(jìn)行酸或游離基解聚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素，其通過在利用水解除去果糖殘基后，進(jìn)行大腸 桿菌莢膜多糖K4的低分子量天然流分的化學(xué)硫酸化而得到。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素,其通過大腸桿菌菌株DSM23644生產(chǎn)的本來無果 糖殘基的莢膜多糖（K4-d)的化學(xué)硫酸化以及隨后的酸或游離基解聚而得到。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素,其通過大腸桿菌菌株DSM23644生產(chǎn)的本來無果 糖殘基的莢膜多糖（K4-d)的低分子量流分的化學(xué)硫酸化而得到。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5的硫酸軟骨素，其用于預(yù)防和治療急性或慢性炎癥疾患和/或用 于保持人和動物的肌骨骼健康。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的硫酸軟骨素，其中炎癥疾患是骨關(guān)節(jié)炎。
8. 組合物，其含有作為活性成分的權(quán)利要求1-5所述的硫酸軟骨素，以及藥學(xué)和營養(yǎng) 學(xué)上可接受的賦形劑，和任選的其他活性成分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中其他活性成分選自鹽酸葡糖胺、硫酸葡糖胺、 N-乙酰葡糖胺、透明質(zhì)酸、氨基酸、膠原、水解的膠原、多不飽和脂肪酸類、角蛋白、皮膚素、 甲基-磺酰基甲烷（MSM)、葉酸、還原葉酸、維生素、B族維生素、S-腺苷甲硫氨酸（SAMe)、抗 壞血酸或抗壞血酸錳。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的組合物，其為膠囊、軟凝膠膠囊、片劑、液體形式的飲劑 或待被溶解的粉狀飲劑形式的。
【文檔編號】C08B37/00GK104411363SQ201380026473
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月22日
【發(fā)明者】N·米拉利亞, D·比安基, E·瓦洛蒂, A·特蘭廷, A·特里利, I·布希爾羅, M·阿格斯蒂內(nèi)托, P·巴扎, M·瓦萊蒂 申請人:諾西斯有限公司