本發(fā)明涉及蛋白激酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于棉花的棉花蛋白激酶CIPK1-1及其編碼基因，以及其在培育耐旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
非生物脅迫，如干旱、鹽漬、極端溫度、化學(xué)污染和氧損傷等能夠?qū)χ参锏纳L發(fā)育造成嚴(yán)重的危害，對作物產(chǎn)量造成極大損失，其中干旱對作物產(chǎn)量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當(dāng)于其它災(zāi)害之和，是許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干早、半干早地區(qū)占陸地面積的34％；我國干早、半干旱地區(qū)約占國土面積的52％，年受早面積達(dá)20～270萬公頃，全國灌溉區(qū)每年缺水約30億立方米，因缺水而少收糧食350～40億公斤；特別是我國主要產(chǎn)糧區(qū)如華北、東北和西北，是我國缺水最嚴(yán)重的地區(qū)，春旱頻繁達(dá)到十年九遇。由于植物的耐脅迫性大多屬于數(shù)量性狀，現(xiàn)有可利用的種質(zhì)資源匱乏，采用常規(guī)育種技術(shù)改良植物脅迫耐性的難度相當(dāng)大，培育出真正的耐脅迫品種就尤為困難。近年來，隨著對植物抗逆分子機(jī)理研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗逆研究已經(jīng)從生理水平深入到分子水平，促進(jìn)了植物抗逆基因工程的發(fā)展。當(dāng)植物在受到脅迫時會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，來降低或消除給植株帶來的危害。植物的這種應(yīng)答反應(yīng)是一個涉及多基因、多信號途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過程。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以分為3類：(1)參與信號級聯(lián)放大系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄控制的基因及產(chǎn)物；(2)直接對保護(hù)生物膜和蛋白質(zhì)起作用的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；(3)與水和離子的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)。近年來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對脅迫耐受能力的研究，以及對脅迫具有耐受能力的農(nóng)作物、旱生植物和鹽生植物的研究都取得了顯著的成果，對脅迫相關(guān)基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也有了更進(jìn)一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlowtemperature-responsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestress2responsiveabscisicacidsignaling。PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell.15：63-78.)。但就目前的研究狀況而言，由于其機(jī)制十分復(fù)雜，許多植物對逆境下的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)機(jī)制仍有待深入研究。在抗逆應(yīng)答基因的功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究占多數(shù)，但抗逆相關(guān)的信號傳遞途徑之間的聯(lián)系以及整個信號傳遞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人利用SSH與RACE相結(jié)合的方法克隆出了棉花的一個蛋白激酶(本文命名為CIPK1-1)的編碼基因的DNA序列。并發(fā)現(xiàn)將其導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株后，可明顯改善轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性，而且這些性狀可穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明第一方面提供棉花的一個蛋白激酶CIPK1-1的編碼基因，其序列為SEQIDNO：2。本發(fā)明第二方面提供一種重組表達(dá)載體，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列與所述表達(dá)載體的表達(dá)控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述載體為附圖2所示的rd29A-GhCIPK1-1-2300載體。本發(fā)明第三方面提供一種重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面所述的核苷酸序列或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明第四方面提供一種改善植物耐旱性的方法，包括：將本發(fā)明第一方面所述的核苷酸序列或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物或植物組織并使所述基因表達(dá)；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第五方面提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明第一方面所述的基因、本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體的植物或植物組織；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第六方面提供本發(fā)明第一方面所述的基因、本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體或者本發(fā)明第三方面所述的重組細(xì)胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育種的用途；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第七方面提供發(fā)明第一方面所述的基因編碼的氨基酸序列，如SEQIDNO：1所示。附圖說明圖1是GhCIPK1-1的植物表達(dá)載體(rd29A-GhCIPK1-1-2300)的構(gòu)建流程。圖2是GhCIPK1-1的植物表達(dá)載體(rd29A-GhCIPK1-1-2300)的質(zhì)粒圖。圖3是GhCIPK1-1轉(zhuǎn)基因T1代煙草植株(圖中，T1S4；圖右，T1S7)和作為對照的非轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖左)的耐旱模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4是GhCIPK1-1轉(zhuǎn)基因T1代煙草植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暝谵D(zhuǎn)錄水平上的蛋白表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果。M為Marker，1-8為轉(zhuǎn)基因植株，9-12為對照植株，13為正對照(GhCIPK1-1)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。實(shí)施例1、干旱脅迫下棉花SSH文庫構(gòu)建：具體方法為：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit所示的方法通過抑制差減雜交方法構(gòu)建差減文庫。在實(shí)驗(yàn)過程中以干旱處理的棉花幼苗的葉子的mRNA作為樣本(tester)，以未處理的棉花幼苗的葉子的mRNA作為對照(driver)。具體步驟簡述如下：(1)供試材料：非洲棉(國家棉花中期庫，獲取單位中國棉花研究所，統(tǒng)一編號：ZM-06838)播種到滅過菌的蛭石上，在25℃、光周期16h/8h(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)，每周澆1/2MS培養(yǎng)基(9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。當(dāng)苗株高達(dá)25-30cm時用于實(shí)驗(yàn)。(2)材料處理：將供試幼苗分為2組，每組4盆，每盆1株。第一組為對照組，在25℃、光照培養(yǎng)，正常澆灌。第二組為干旱處理組，25℃、光照培養(yǎng)，停止?jié)补?，處?0天，處理完畢后及時剪取兩組幼苗頂端1/3的葉片，用液氮迅速冷凍后，于-70℃冰箱中保存。(3)總RNA提取：分別取對照組和干旱處理組的棉花葉片0.5g，用植物RNA提取試劑盒(invitrogen)提取棉花的總RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度計(jì)U-2001測定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值為1.8-2.0，表明總RNA純度較高，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA純化試劑盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分離mRNA。(4)抑制消減雜交：按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒所示的方法進(jìn)行抑制差減雜交。應(yīng)用Clontech的PCR-SelectcDNASubtractionKits差減雜交試劑盒，先將Driver和Tester的mRNA分別反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈cDNA，再以2μgTester和2μgDrivercDNA作為起始材料進(jìn)行差減雜交。在37℃水浴下分別將TestercDNA和DrivercDNA用RsaI酶切1.5h，然后將酶切后的TestercDNA分成兩等份，連接上不同的接頭，而DrivercDNA不連接頭。兩種連有不同接頭的TestercDNA分別與過量的Driver混合，進(jìn)行第一次差減雜交。將兩種第一次差減雜交的產(chǎn)物混合，再與新鮮變性的DrivercDNA進(jìn)行第二次差減雜交，通過兩次抑制性PCR擴(kuò)增差異表達(dá)的片段，使其得到富集。(5)cDNA消減文庫的構(gòu)建與初步篩選、克隆、鑒定正向消減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物(QIAquickPCRPurificationKit純化，購自Qiagen)與pGEM-TEasy(購自Promega試劑盒)載體連接，依照pGEM-TEasy試劑盒的程序，具體步驟如下：用200μlPCR管依次加入下列成分：純化的正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物3μl，T4連接酶緩沖液5μl，pGEM-TEasy載體1μl，T4DNA連接酶1μl，于4℃連接過夜。取10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入到100μL感受態(tài)大腸桿菌JMI09(購自TAKARA)中，冰浴30min、熱休克60s、冰浴2min，另加250μLLB培養(yǎng)液(1％Tryptone購自O(shè)XOID，0.5％YeastExtract購自O(shè)XOID，1％NaCl購自國藥)置37℃水浴中，以225r/min振蕩培養(yǎng)30min，取200μL菌液種植于含50μg/mL氨芐青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG購自TAKARA)培養(yǎng)板上，37℃培育18h。計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中直徑＞1mm的清晰白色及藍(lán)色菌落數(shù)，隨機(jī)挑取540個白色菌落(編號：Gh-D2-001至Gh-D2-540)。將所有白色克隆挑于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING)中，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，于-80℃保存?zhèn)溆?。以巢式PCR引物Primer1和Primer2R(Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒自帶)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，得到452個陽性克隆，對所有陽性克隆在送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序(6)差異克隆的cDNA測序分析：將DNA測序結(jié)果去除載體和不明確序列及冗余的cDNA后，共得到405個有效EST(unigene)。實(shí)施例2棉花蛋白激酶類編碼基因GhCIPK1-1的克隆克隆子Gh-D2-057去掉冗余DNA后，序列為SEQIDNO：3，序列分析表明該序列的編碼的氨基酸序列屬于蛋白激酶，本文將克隆子Gh-D2-057編碼的全長基因命名為GhCIPK1-1，對應(yīng)的蛋白命名為CIPK1-1。SEQIDNO：3GhCIPK1-1全長基因的克隆根據(jù)已經(jīng)獲得的Gh-D2-057基因片段，設(shè)計(jì)兩條特異性引物，作為5’RACE的3’端特異性引物。GhCIPK1-1GSP1：SEQIDNO：4：CTTCAAAGATCTCAGCATCTATGhCIPK1-1GSP2：SEQIDNO：5：ATTTCACCTTCCCATCCTTGTTGhCIPK1-1GSP3：SEQIDNO：6：AAGCATTGAAATAACTCGGCCT實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作(5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds試劑盒購自invitrogen公司)。用SEQIDNO：5與5’通用引物AAP(試劑盒自帶)，以mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA(反轉(zhuǎn)錄引物SEQIDNO：4)為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：ExTaq購自TAKARA，50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlmRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：7和AAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33個循環(huán)后，72℃延伸10min。所得的PCR產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍后取2.0μl作為模板，用SEQIDNO：6與3’端引物AUAP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：8和AUAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33個循環(huán)后，72℃延伸10min。第二次PCR產(chǎn)物回收片段約為900bp條帶(GelExtractionKit購自O(shè)MEGA)連接于pGEM-TEasyVector，轉(zhuǎn)化到JM109(具體方法同上)，隨機(jī)挑取10個白色菌落于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆?。SEQIDNO：8與3’端引物AUAP進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上)，得到4個陽性克隆，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序測序，獲得該基因的cDNA的5’端。所得的5’RACE產(chǎn)物克隆測序后，與SEQIDNO：3結(jié)果拼接。獲得GhCIPK1-1的cDNA序列SEQ..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