一種用于測(cè)定亞精胺/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求在美國(guó)專利商標(biāo)局2012年11月16日提交的臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，其公開的內(nèi)容通過引用的方式并入本申請(qǐng)，并且本申請(qǐng)要求該專利的優(yōu)先權(quán)。

背景技術(shù)：
技術(shù)領(lǐng)域美國(guó)專利號(hào)6,811,967于2004年11月4日頒發(fā)給SITAR等人，其全部公開的內(nèi)容通過引用合并于此。該專利公開了一種利用亞精胺/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的底物，通過檢測(cè)SSAT底物的乙?；问絹?lái)測(cè)定SSAT的活性的方法。SSAT的底物可能包括金剛胺，其中金剛胺產(chǎn)生乙酰化代謝產(chǎn)物N-乙?；饎偘返拇x的發(fā)生在一定程度上由可誘導(dǎo)的酶SSAT的行為引起。還公開了SSAT的活性與病理狀況的相關(guān)性。SSAT普遍分布在哺乳動(dòng)物組織中，并在細(xì)胞中聚胺的分解代謝和消除中起作用。SSAT是一種催化乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到聚胺的氨丙基部分的誘導(dǎo)酶。SSAT的這一行為促進(jìn)了聚胺的降解、排泄以及循環(huán)和/或細(xì)胞內(nèi)循環(huán)。SSAT以這種方式參與維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)聚胺的動(dòng)態(tài)平衡。然而，在正常的或未經(jīng)誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物組織中SSAT以非常低的水平存在?？梢酝ㄟ^不同的藥物、生長(zhǎng)因子、聚胺、聚胺類似物、有毒物質(zhì)、激素和生理刺激誘導(dǎo)SSAT的表達(dá)。雖然所有上述化合物可以誘導(dǎo)SSAT的表達(dá)，但是對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的化合物,誘導(dǎo)發(fā)生的時(shí)間不同。SSAT表達(dá)的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定、mRNA翻譯和蛋白質(zhì)穩(wěn)定的水平發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)艹晒Φ剡M(jìn)行前，為使細(xì)胞中存在足夠的SSAT酶通常需要SSAT的誘導(dǎo)或過表達(dá)或有100,000×g離心的上清液。目前的文獻(xiàn)教導(dǎo)SSAT是一種對(duì)包括精胺和亞精胺或其類似物在內(nèi)的底物特異性乙酰化酶，然而SSAT作用于非精胺/亞精胺底物的SSAT活性、SSAT的酶動(dòng)力學(xué)以及測(cè)定方法還是沒有被理解?，F(xiàn)有量化SSAT活性的方法。然而，這些技術(shù)都依賴于技術(shù)高度熟練的人員和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)方法。更具體地說(shuō)，一直存在對(duì)一種測(cè)定方法的需求，這種測(cè)定方法通過檢測(cè)SSAT的非精胺/亞精胺底物的乙?；问絹?lái)量化SSAT的活性，該方法可用于檢測(cè)各種病理狀況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物中精胺/亞精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)活性的方法，包括步驟：測(cè)定來(lái)自哺乳動(dòng)物的樣本中一種非精胺/亞精胺或其類似物、SSAT底物的乙?；问降乃?。在該方法的第一個(gè)實(shí)施例中，SSAT底物是金剛乙胺，SSAT底物的乙酰化形式是乙?；?金剛乙胺。該方法可以包括在1-10mg/kg，或者可選擇地在3-6mg/kg范圍內(nèi)的特定SSAT底物劑量水平，將SSAT底物和哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞一起孵育。供測(cè)定的樣本可以是來(lái)自于哺乳動(dòng)物的尿液、血液和/或唾液，樣本在底物孵育后的2-24小時(shí)采集，可選擇地在孵育后的2-4小時(shí)。在該方法的第二個(gè)實(shí)施例中，SSAT底物是妥卡尼，SSAT底物的乙?；问绞且阴；?妥卡尼。該方法可以包括在1-10mg/kg，或者可選擇地在3-6mg/kg范圍的內(nèi)的特定SSAT底物劑量水平，將SSAT底物和哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞一起孵育。供測(cè)定的樣本可以是來(lái)自于哺乳動(dòng)物的尿液、血液和/或唾液，樣本在底物孵育后的2-24小時(shí)采集，可選擇地在孵育后的2-4小時(shí)。在該方法的第三個(gè)實(shí)施例中，SSAT的活性在肝細(xì)胞中檢測(cè)，所述方法包括以下步驟：a.獲得肝細(xì)胞并在合適的培養(yǎng)物中孵育該肝細(xì)胞；以及b.用一種非精胺/亞精胺SSAT底物孵育該肝細(xì)胞；c.檢測(cè)從該培養(yǎng)物中獲得的樣本中的一種乙?；x產(chǎn)物；以及d.將該乙酰化代謝產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)，其中該樣本中的乙酰化代謝產(chǎn)物的存在量是哺乳動(dòng)物體內(nèi)SSAT活性的表征。藥物可以是0-220μΜ濃度范圍內(nèi)的金剛乙胺。將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)的步驟包括將該乙酰化代謝產(chǎn)物的量關(guān)聯(lián)至一條標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的SSAT活性水平。在該方法的第四個(gè)實(shí)施例中，SSAT活性在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)測(cè)定。SSAT底物是金剛乙胺，SSAT底物的乙?；问绞且阴；?金剛乙胺。該方法包括以下步驟：a.將從細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的測(cè)試樣本與金剛乙胺接觸；b.測(cè)量產(chǎn)生的乙?；x產(chǎn)物的量；以及c.將產(chǎn)生的乙?；x產(chǎn)物的量與SSAT的活性水平相關(guān)聯(lián)。該細(xì)胞培養(yǎng)物可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)試樣本可以是肝細(xì)胞。將從細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的測(cè)試樣本與藥物接觸的步驟可以包括用底物孵育樣本大約24小時(shí)。在該方法的第五個(gè)實(shí)施例中，SSAT活性在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)。該方法包括以下步驟：a.向哺乳動(dòng)物體內(nèi)引入金剛乙胺b.采集來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物體液樣本c.檢測(cè)該樣本中的一種乙?；x產(chǎn)物；以及d.將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)，其中該樣本中的乙?；x產(chǎn)物的存在量是哺乳動(dòng)物中SSAT活性的表征。該生物體液樣本可以是，但不限于，血液、唾液和尿液。在該方法的第六個(gè)實(shí)施例中，SSAT活性在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)。該方法包括以下步驟：a.向哺乳動(dòng)物體內(nèi)引入金剛乙胺b.采集來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物體液樣本c.檢測(cè)該樣本中的一種乙酰化代謝產(chǎn)物；以及d.將該乙?；x產(chǎn)物的存在量與SSAT活性相關(guān)聯(lián)，其中該樣本中的乙?；x產(chǎn)物的存在水平是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的癌細(xì)胞的表征。該生物體液樣本可以是，但不限于，血液、唾液和尿液。在該方法的各實(shí)施例中，樣本中非精胺/亞精胺底物的相對(duì)水平可以被關(guān)聯(lián)至一條代表已知活性水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且可以通過多種技術(shù)測(cè)定，包括但不限于氣相色譜、放射性標(biāo)記、高壓液相色譜(HPLC)、薄層色譜；質(zhì)譜可以和具有特異性抗體或多種抗體的色譜以及親和色譜聯(lián)用。本文中公開的測(cè)定方法可用于將SSAT活性與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的病理狀況相關(guān)聯(lián)，病理狀況包括但不限于肺癌、胃癌、卵巢癌、急性髓細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌和/或前列腺癌。附圖說(shuō)明通過以下給出的對(duì)具體實(shí)施方式的描述，僅以實(shí)施例的方式，并參照附圖，本發(fā)明將更容易理解，其中：圖1的表格顯示了可接種的凍存原代大鼠肝細(xì)胞中SSAT介導(dǎo)的金剛胺、金剛乙胺、妥卡尼和亞精胺的N-乙?；膮?shù)(Km和Vmax)；圖2的表格顯示了金剛胺被SSATN-乙?；拿竸?dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；圖3的表格顯示了金剛乙胺被SSATN-乙酰化的酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；圖4的表格顯示了妥卡尼被SSATN-乙?；拿竸?dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；圖5的表格顯示了亞精胺被SSATN-乙?；拿竸?dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)；圖6的表格顯示了預(yù)實(shí)驗(yàn)中(二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴代四唑或MTT法測(cè)定的結(jié)果；圖7的表格顯示了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中MTT法測(cè)定的結(jié)果；圖8顯示了金剛胺被SSATN-乙?；拇x產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖9顯示了金剛乙胺被SSATN-乙?；拇x產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖10顯示了妥卡尼被SSATN-乙?；拇x產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖11顯示了亞精胺被SSATN-乙?；拇x產(chǎn)物的形成和Lineweaver-Burk曲線圖；圖12顯示了預(yù)實(shí)驗(yàn)中一次MTT測(cè)定的結(jié)果；圖13顯示了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中一次MTT測(cè)定的結(jié)果；圖14顯示了定量孵育樣本中N-乙酰金剛胺的代表性LC/MS/MS測(cè)定校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖15顯示了定量孵育樣本中N-乙酰金剛乙胺的代表性LC/MS/MS測(cè)定校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖16顯示了定量孵育樣本中N-乙酰妥卡尼的代表性LC/MS/MS測(cè)定校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖17顯示了定量孵育樣本中N-乙酰亞精胺的代表性LC/MS/MS測(cè)定校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖18顯示了孵育樣本中N-乙酰金剛胺的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖19顯示了孵育樣本中N-乙酰金剛乙胺的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖20顯示了孵育樣本中N-乙酰妥卡尼的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖21顯示了孵育樣本中N-乙酰亞精胺的代表性LC/MS/MS色譜圖；圖22是一個(gè)流程圖，它顯示了一種利用本文所公開的測(cè)定SSAT的方法的診斷方法。具體實(shí)施方式本文描述了一種用于在體外和體內(nèi)模型中測(cè)定亞精胺/精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)活性的方法。SSAT是聚胺代謝中的重要酶。SSAT被高度調(diào)節(jié)，已被提出其在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、肥胖、應(yīng)激反應(yīng)和氧平衡中起作用。SSAT利用N1–乙酰精胺作為底物形成N1，N12-二乙酰精胺。在體內(nèi)，SSAT是一種胞質(zhì)酶，而N1–乙酰精胺相對(duì)于精胺是首選的底物，雖然精胺的Km值實(shí)際上比N1–乙酰精胺的低。除了SSAT，芳基胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶(NATs)也是藥物和含有芳香胺和肼基團(tuán)的外源性化學(xué)物質(zhì)的N-乙?；兄匾陌|(zhì)酶。在人類中，已經(jīng)鑒定了兩種功能性NAT的同工酶(NAT1和NAT2)以及該兩種NAT同工酶超過25個(gè)的等位基因。基于來(lái)自過表達(dá)SSAT的CD2F1轉(zhuǎn)基因小鼠的肝勻漿評(píng)估SSAT的活性的體外和體內(nèi)測(cè)定法已經(jīng)公開。同樣地，基于人類肝細(xì)胞溶質(zhì)和人重組NAT1和NAT2同工酶的NAT1和NAT2活性的體外測(cè)定法也已經(jīng)被闡述。在體外SSAT和NAT測(cè)定中，需要乙酰輔酶A(輔助因子)提供激活的乙酰基團(tuán)乙?；钚?。大鼠和人原代肝細(xì)胞體外測(cè)定法也在SSAT和NAT活性的研究中被闡述。由于完整的原代肝細(xì)胞具有所有必需的天然藥物的代謝輔助因子，一種完整的原代肝細(xì)胞測(cè)定法的利用與另一種基于微粒體或亞細(xì)胞胞漿酶組分的體外模型相比，往往能提供更高水平的體外對(duì)應(yīng)體內(nèi)藥物代謝相關(guān)性。凍存的原代大鼠肝細(xì)胞本研究使用以下可接種的原代凍存大鼠肝細(xì)胞：名稱：凍存雌性斯普拉-道來(lái)氏大鼠肝細(xì)胞BRIVAL參考號(hào)：STM-1351(TSY)供應(yīng)商：Celsis批號(hào)：ASM名稱：凍存雌性斯普拉-道來(lái)氏大鼠肝細(xì)胞BRIVAL參考號(hào)：STM-1352(TSY)和STM-1407(TSY)供應(yīng)商：Celsis批號(hào)：SKN兩個(gè)批次都被用了在預(yù)實(shí)驗(yàn)中。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)只用到了批號(hào)SKN。實(shí)驗(yàn)方法先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)用來(lái)篩選底物濃度的合適測(cè)試范圍，并確定可能導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性(相對(duì)存活率<50％)的濃度。在這些初步的結(jié)果的基礎(chǔ)上，用調(diào)整后的底物濃度進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。有顯著細(xì)胞毒性的底物濃度產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不參與酶動(dòng)力學(xué)分析。請(qǐng)參考下表中的測(cè)試濃度。從孵育反應(yīng)物中采集代謝產(chǎn)物用LC/MS/MS進(jìn)行分析。1預(yù)實(shí)驗(yàn)中沒有測(cè)試總體來(lái)說(shuō)，預(yù)實(shí)驗(yàn)方法和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法是一致的。底物溶液的制備精確稱量底物，用合適的溶劑(妥卡尼用10％的二甲亞砜蒸餾水溶液(預(yù)實(shí)驗(yàn))或100％的二甲亞砜(驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))；金剛胺、金剛乙胺和亞精胺用去離子水)溶解并進(jìn)一步稀釋到上表中所列測(cè)試濃度的100倍的一系列溶液。大鼠肝細(xì)胞的制備預(yù)實(shí)驗(yàn)中用到了兩個(gè)批次的雌性大鼠肝細(xì)胞(批號(hào)ASM和SKN；對(duì)應(yīng)BRIVAL編號(hào)分別為：STM-1351(TSY)和STM-1352(TSY))。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中只用到了貨號(hào)SKN(對(duì)應(yīng)BRIVAL編號(hào)：STM-1407(TSY))。預(yù)實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均采用了下文所述的制備過程。即將使用前，將凍存的原代大鼠肝細(xì)胞在37℃水浴中解凍，并在預(yù)熱的InVitroGROTMCP大鼠培養(yǎng)基中重懸。肝細(xì)胞的存活率用臺(tái)盼藍(lán)排斥法確認(rèn)為在70％以上。添加InVitroGROTMCP大鼠培養(yǎng)基調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的濃度，使之達(dá)到0.70×106個(gè)細(xì)胞/mL的目標(biāo)接種濃度。肝細(xì)胞的等分試樣接種于(0.5毫升/孔)24孔CellAffix培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板放置于95％空氣和5％二氧化碳的高濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中37℃恒溫孵育4小時(shí)，以使肝細(xì)胞在用所選的底物溶液劑量處理前貼壁。處理和孵育細(xì)胞貼壁以后，將培養(yǎng)基從各孔中吸出，并替換以預(yù)熱的InVitroGROTMHI大鼠培養(yǎng)基(在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中添加Torpedo抗生素混合物)和適當(dāng)濃度的底物溶液。經(jīng)處理的細(xì)胞再放回孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，各孔中的培養(yǎng)基都被收集到含有冰冷甲醇的1.7毫升的小瓶中并在標(biāo)稱-80℃(-72℃至-88℃)貯存直至進(jìn)行LC/MS/MS分析。對(duì)留在孔中的肝細(xì)胞進(jìn)行MTT測(cè)定來(lái)評(píng)估測(cè)試濃度的底物潛在的細(xì)胞毒性。MTT細(xì)胞毒性測(cè)定收集反應(yīng)培養(yǎng)基后，立即向每孔剩余的肝細(xì)胞中加入等量的0.5毫克/毫升的MTT的KHB溶液，然后孵育約30分鐘。孵育后，用二甲亞砜(DMSO)替代培養(yǎng)基以溶解甲瓚。用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔平底板每個(gè)孔的等分試樣在540nm處的吸光度，并用DMSO作為校正的背景吸光度。穩(wěn)定性對(duì)照測(cè)試了穩(wěn)定性對(duì)照以監(jiān)測(cè)在所采用的實(shí)驗(yàn)條件下任何底物的非酶N-乙?；?。平行于肝細(xì)胞的樣本，一組在InVitroGROTMHI大鼠培養(yǎng)基中僅包括測(cè)試濃度的底物溶液而沒有肝細(xì)胞的穩(wěn)定性對(duì)照，在和肝細(xì)胞樣本相同的條件下孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，收集穩(wěn)定性對(duì)照樣本用于LC/MS/MS分析，分析方法與肝細(xì)胞樣本相同。LC/MS/MS分析采用四種LC/MS/MS測(cè)定法來(lái)分別定量孵育樣本中的四種代謝產(chǎn)物。用于每種代謝產(chǎn)物的測(cè)定參考標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)參見下表。參考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用于制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品。*一些代謝產(chǎn)物的參考標(biāo)準(zhǔn)品不市售；因此，它們相應(yīng)的底物被作為參考標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)校準(zhǔn)孵育樣本中代謝產(chǎn)物的測(cè)定。加入氘代N-乙酰基-d3金剛胺作為所有測(cè)定的內(nèi)標(biāo)。總的來(lái)說(shuō)，不同的代謝產(chǎn)物的測(cè)定采用相同的下述制備步驟：校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品：稀釋參考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液并和等分試樣的甲醇測(cè)定基質(zhì)一起加入空白孵育反應(yīng)緩沖液(1：1v/v)和內(nèi)標(biāo)中，得到一系列進(jìn)行LC/MS/MS分析的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品。孵育樣品：在進(jìn)行LC/MS/MS分析以前，向每個(gè)解凍的孵育樣本的上清液中加入等分試樣的測(cè)定基質(zhì)和等分試樣的內(nèi)標(biāo)。例外：用于N-乙酰妥卡尼和N-乙酰亞精胺測(cè)定的解凍的孵育樣本在按上述方法進(jìn)一步制備前用甲酸(甲酸終濃度在0.5％v/v)酸化。此外，在制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)量控制樣品和孵育樣本時(shí)，還要使用酸化的測(cè)定基質(zhì)。這是為了最小化代謝產(chǎn)物結(jié)合到制備容器上的可能性。用于N-乙酰亞精胺定量的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)量控制樣品和孵育樣本在加內(nèi)標(biāo)和進(jìn)行LC/MS/MS分析前用含0.1％甲酸的去離子水稀釋10倍。分析儀器參數(shù)N-乙酰金剛胺、N-乙酰金剛乙胺和N-乙酰妥卡尼儀器：WatersAcquityTMUPLC系統(tǒng)和MicromassTMUltima采集軟件：MassLynxTM4.1版流動(dòng)相A：含0.1％甲酸的去離子水流動(dòng)相B：含0.1％甲酸的甲醇柱：SYNERGITM4μHydro-RP(BRIVAL編號(hào)：LC-270)進(jìn)樣量：10μL質(zhì)譜模式：ESI正離子MRM模式N-乙酰亞精胺儀器：WatersAcquityTMUPLC系統(tǒng)和MicromassTMUltima采集軟件：MassLynxTM4.1版流動(dòng)相A：含5mM甲酸銨和0.1％甲酸的去離子水流動(dòng)相B：含5mM甲酸銨和0.1％甲酸的乙腈：去離子水(9:1v/v)柱：KinexTM2.6μHILIC(BRIVAL編號(hào)：LC-309)進(jìn)樣量：1μL質(zhì)譜模式：ESI正離子MRM模式數(shù)據(jù)分析軟件MassLynxTM4.1版和微軟Excel2007用于數(shù)據(jù)分析。分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)打印在硬拷貝上并根據(jù)BRIVAL標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程處理。電子數(shù)據(jù)備份根據(jù)BRIVAL標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，用BRIPHARMWindowsServer2008進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)歸檔所有的實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)、相關(guān)文件和研究報(bào)告將按BRIVAL標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的規(guī)定在BRIVAL的檔案庫(kù)(加拿大不列顛哥倫比亞省溫哥華市Heather街103-8898)存檔至少五年。結(jié)果與討論在可接種的凍存原代大鼠肝細(xì)胞上SSAT介導(dǎo)的金剛胺、金剛乙胺、妥卡尼和亞精胺的N-乙酰化的相對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km和Vmax)的匯總?cè)鐖D1所示?；跍y(cè)試濃度范圍的底物經(jīng)24小時(shí)孵育反應(yīng)過程轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰化代謝產(chǎn)物的酶轉(zhuǎn)化率評(píng)估酶動(dòng)力學(xué)。從不同的測(cè)試底物濃度孵育后形成的代謝產(chǎn)物用LC/MS/MS測(cè)定，結(jié)果數(shù)據(jù)構(gòu)建入反應(yīng)速率對(duì)應(yīng)底物濃度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，以估計(jì)SSAT介導(dǎo)的各測(cè)試底物的N-乙?；腒m和Vmax值。從驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中估計(jì)的亞精胺乙?；腒m值為287μΜ，可堪比來(lái)源于的轉(zhuǎn)基因小鼠的胞質(zhì)肝組分中的SSAT的文獻(xiàn)參考值267±46μΜ。Vmax無(wú)法與文獻(xiàn)值相比較，因?yàn)檫@些值用不同的單元表示。從全部的穩(wěn)定性對(duì)照來(lái)看，只觀察到極少量的N-乙?；x產(chǎn)物，這表明非酶N-乙酰化通常不發(fā)生于該實(shí)驗(yàn)條件下。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中每一種底物的結(jié)果都匯總在圖2至圖5中。圖1至圖4顯示了代謝產(chǎn)物的形成對(duì)應(yīng)底物濃度的曲線圖以及相應(yīng)的Lineweaver-Burk曲線圖。觀察到亞精胺乙?；淖畹蚄m值和最高Vmax值分別為287μΜ和7.21pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。因此，在所有測(cè)試的底物中，它具有最高的相對(duì)最大反應(yīng)速率。測(cè)試的其它底物的Km值，按升序排列分別為金剛胺1659μΜ；金剛乙胺1835μΜ；以及與妥卡尼5033μΜ。測(cè)試底物的Vmax值，按降序排列(對(duì)應(yīng)于相對(duì)最大反應(yīng)速率的降序排列)為妥卡尼0.617pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；金剛乙胺0.364pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞和金剛胺0.00197pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。底物對(duì)大鼠肝細(xì)胞的潛在細(xì)胞毒性用MTT細(xì)胞毒性測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。該測(cè)定在預(yù)實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中都進(jìn)行。預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果匯總于圖6和圖12中。顯著細(xì)胞毒性(相對(duì)存活率<50％)在較高濃度的金剛胺和金剛乙胺處理后被觀察到。觀察到的導(dǎo)致廣泛細(xì)胞毒性的底物濃度，金剛胺約為1170μΜ和金剛乙約為胺280μΜ。沒有觀察到妥卡尼的細(xì)胞毒性。基于這些結(jié)果，對(duì)后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的測(cè)試濃度做了相應(yīng)調(diào)整。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的MTT測(cè)定結(jié)果顯示于圖7和圖13。觀察到的導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞毒性的底物濃度，金剛胺約為1140μΜ和金剛乙胺約為220μΜ，驗(yàn)證了預(yù)實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果。在測(cè)試的范圍內(nèi)沒有觀察到妥卡尼和亞精胺的細(xì)胞毒性。會(huì)導(dǎo)致顯著細(xì)胞毒性的底物濃度產(chǎn)生的數(shù)據(jù)被排除在酶動(dòng)力學(xué)分析以外。所有的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品的結(jié)果滿足了按BRIVALSOP-GP-011(7.0版)和SOP-QA-025(l.0版)的一般批量接受標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)FDA生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的建立。例如參見“行業(yè)指南：生物分析方法驗(yàn)證”，美國(guó)健康和人類服務(wù)部、食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、藥品審評(píng)及研究中心(CDER)和獸藥中心(CVM)，2001年5月，其全部公開內(nèi)容通過引用合并于此。所有測(cè)定都用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，除了N-乙酰妥卡，其定量沒有使用內(nèi)標(biāo)物。代表性的校正曲線和LC/MS/MS色譜圖顯示于圖7至圖14中。對(duì)亞精胺/精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)介導(dǎo)的金剛胺、金剛乙胺、妥卡尼和亞精胺N-乙?；拿竸?dòng)力學(xué)參數(shù)(Km和Vmax)進(jìn)行了表征。在受測(cè)的底物中，觀察到亞精胺的乙?；哂凶畹偷腒m值和最高的Vmax值，分別在287μΜ和7.21pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。因此，它具有最高的相對(duì)最大反應(yīng)速率。其它受測(cè)底物的Km值，按升序排列為金剛胺1659μΜ；金剛乙胺1835μΜ；和妥卡尼5033μΜ。其他受測(cè)底物的Vmax值，按降序排列(對(duì)應(yīng)于相對(duì)最大反應(yīng)速率的降序排列)為妥卡尼0.617pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；金剛乙胺0.364pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞和金剛胺0.00197pmol/min/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞?？偨Y(jié)如下，如圖22所示，通過測(cè)定來(lái)自于哺乳動(dòng)物的樣本中的一種非精胺/亞精胺SSAT底物的乙?；问降乃絹?lái)確定哺乳動(dòng)物中精胺/亞精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的活性可以被用于將SSAT活性與哺乳動(dòng)物體中的病理狀況相關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，上述提供的諸多細(xì)節(jié)僅作為示例，而不旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將由權(quán)利要求來(lái)確定。