本發(fā)明涉及新的基于銥Ir(III)的發(fā)光復(fù)合物、包含這些復(fù)合物作為標(biāo)記的綴合物和它們?cè)诶缁陔娀瘜W(xué)發(fā)光的分析物檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
電致化學(xué)發(fā)光(也稱為電化學(xué)發(fā)光并縮寫為ECL)是在電極處產(chǎn)生的物質(zhì)經(jīng)歷高能電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)以形成發(fā)光的激發(fā)態(tài)的過程。詳細(xì)的ECL研究最初由Hercules和Bard等人在二十世紀(jì)六十年代中期描述。在約40年的研究后，ECL現(xiàn)在已經(jīng)變成非常有力的分析技術(shù)，并在例如免疫測(cè)定、食物和水的測(cè)試和生物戰(zhàn)劑檢測(cè)領(lǐng)域中廣泛使用。對(duì)于在有機(jī)發(fā)光設(shè)備(OLED)中使用，大量的化合物似乎令人感興趣。這些化合物適用于固體材料中或者可溶解在有機(jī)流體中。然而，關(guān)于例如從生物樣品檢測(cè)分析物所需要的它們?cè)诤橘|(zhì)中的效用，還沒有得出結(jié)論。一般而言，基于ECL的檢測(cè)方法是基于使用包含Ru(II+)作為金屬離子的水溶性釕復(fù)合物。盡管歷經(jīng)過去的幾十年作出了顯著改進(jìn)，但是仍非常需要更加靈敏的基于電化學(xué)發(fā)光的體外診斷測(cè)定。現(xiàn)在已經(jīng)意料不到地發(fā)現(xiàn)，某些基于銥Ir(III+)的發(fā)光復(fù)合物代表用于未來高靈敏性的基于ECL的檢測(cè)方法的非常有希望的標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明披露了式I的基于銥的化學(xué)發(fā)光化合物，其中R1-R16為氫、鹵素、氰基-或者硝基-、氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基(sulfodioxide)、膦酸酯基、次膦酸酯基或者R17，其中R17為芳基、取代的芳基、烷基、取代的烷基、支鏈烷基、取代的支鏈烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基，其中所述取代基選自氫、鹵素、氰基-或者硝基-、親水基團(tuán)如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者其中在R1-R12中的兩個(gè)相鄰的R或/和在R13-R16中的兩個(gè)相鄰的R可分別形成芳族環(huán)或者取代的芳族環(huán)，其中所述取代基選自氫、鹵素、氰基-或者硝基-、親水基團(tuán)如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺酰基、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者其中在R1-R12中的兩個(gè)相鄰的R或/和在R13-R16中的兩個(gè)相鄰的R可分別形成脂族環(huán)或者取代的脂族環(huán)，其中所述取代基選自氫、鹵素、氰基-或者硝基-、親水基團(tuán)如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，以及其中R13-R16中的至少一個(gè)為-Q-Y，其中Q表示銜接物以及Y為官能團(tuán)。本發(fā)明還披露了綴合物，其包含上面的化合物和與其共價(jià)結(jié)合的親和結(jié)合劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明披露的化合物或者綴合物在進(jìn)行水溶液中具體地電化學(xué)發(fā)光設(shè)備或者電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中的發(fā)光測(cè)量或者電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的用途。本發(fā)明還披露了通過體外方法測(cè)量分析物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供懷疑或者已知包含所述分析物的樣品，(b)在適于形成分析物綴合物復(fù)合物的條件下，使所述樣品與本發(fā)明綴合物接觸，和(c)測(cè)量步驟(b)中形成的復(fù)合物并由此得到分析物的測(cè)量。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及式I的基于銥的化學(xué)發(fā)光化合物，其中R1-R16為氫、鹵素、氰基-或者硝基-、氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲酰基、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基或者R17，其中R17為芳基、取代的芳基、烷基、取代的烷基、支鏈烷基、取代的支鏈烷基、芳基烷基、取代的芳基烷基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基，其中所述取代基選自氫、鹵素、氰基-或者硝基-、親水基團(tuán)如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺酰基、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者，其中在R1-R12中的兩個(gè)相鄰的R或/和在R13-R16中的兩個(gè)相鄰的R可分別形成芳族環(huán)或者取代的芳族環(huán)，其中所述取代基選自氫、鹵素、氰基-或者硝基-、親水基團(tuán)如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，或者，其中在R1-R12中的兩個(gè)相鄰的R或/和在R13-R16中的兩個(gè)相鄰的R可分別形成脂族環(huán)或者取代的脂族環(huán)，其中所述取代基選自氫、鹵素、氰基-或者硝基-、親水基團(tuán)如氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基、取代的或者未取代的芳基氧基、硫烷基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基，以及其中R13-R16中的至少一個(gè)為-Q-Y，其中Q表示銜接物以及Y為官能團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，式I化合物中的R1-R16中的至少一個(gè)被至少一個(gè)親水基團(tuán)取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，取代的烷基氧基的優(yōu)選的取代基為亞乙基氧基鏈，所述亞乙基氧基鏈包含1-40個(gè)亞乙基氧基單元，或者包含1-20個(gè)亞乙基氧基單元，或者包含1-10個(gè)亞乙基氧基單元。優(yōu)選的親水基團(tuán)為氨基、烷基氨基(烷基表示直鏈如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基鏈，或者支鏈烷基鏈如異丙基、異丁基、叔丁基，優(yōu)選為直鏈烷基鏈如甲基或者乙基)、取代的烷基氨基(這種取代的烷基氨基含有與N原子結(jié)合的一個(gè)或者兩個(gè)例如支鏈或者直鏈，所述與N原子結(jié)合的一個(gè)或者兩個(gè)例如支鏈或者直鏈被另外的親水基團(tuán)如羥基或者磺基取代，優(yōu)選地，這種取代的烷基氨基含有兩個(gè)羥基丙基或者羥基乙基殘基)、芳基氨基(芳基是指芳族殘基，例如苯基，或者萘基，優(yōu)選苯基)、取代的芳基氨基(具有如上面定義的芳基和由親水基團(tuán)形成的另外的殘基)、烷基銨基(烷基如上面所定義，并且烷基銨基優(yōu)選為三甲基銨殘基或者三乙基銨殘基)、取代的烷基銨基、羧基、羧酸酯基(優(yōu)選為烷基酯如甲酯或者乙酯)、氨基甲?；?、羥基、取代的或者未取代的烷基氧基(烷基和取代的烷基如上面所定義)或者芳基氧基或者取代的芳基氧基(芳基和取代的芳基如上面所定義)、硫烷基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、磺基、亞磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基、膦酸酯基、次膦酸酯基。優(yōu)選地，這種親水基團(tuán)選自氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、芳基氨基、取代的芳基氨基、烷基銨基、取代的烷基銨基、羧基、羥基、磺基、次磺酸基、磺酰氨基、亞砜基、砜基和膦酸酯基，在適用的情況下，每個(gè)基團(tuán)優(yōu)選如上段中所定義。在又一實(shí)施方案中，親水基團(tuán)選自磺基、磺酰氨基、砜基。在一個(gè)實(shí)施方案中，式I的基團(tuán)R1-R12中的至少一個(gè)為磺基。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在式I中的苯基菲啶殘基的R1-R12中的至少一個(gè)被至少一個(gè)親水基團(tuán)取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在式I中的苯基菲啶殘基選自下面給出的取代的苯基菲啶。在本發(fā)明的化合物中，銜接物Q優(yōu)選具有1-20個(gè)原子的主鏈長(zhǎng)度。換句話說，在式I的吡啶環(huán)和官能團(tuán)Y之間的最短連接由1-20個(gè)原子組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光復(fù)合物中的銜接物Q為直鏈或者支鏈的、飽和或者不飽和的、未取代或者取代的C1-C20烷基鏈，或者C1-C20芳基烷基鏈(其中，例如，亞苯基環(huán)共計(jì)4個(gè)碳原子的長(zhǎng)度)，或者具有由碳原子和一個(gè)或者多個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子組成的主鏈的1-20個(gè)原子的鏈，或者具有由碳原子和一個(gè)或者多個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子構(gòu)成的包含至少一個(gè)芳基、雜芳基、取代的芳基或者取代的雜芳基的主鏈的1-20個(gè)原子的鏈(其中，例如，亞苯基環(huán)共計(jì)4個(gè)原子的長(zhǎng)度)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明化合物中的銜接物Q為飽和的C1-C12烷基鏈，或者C1-C12芳基烷基鏈，或者具有由碳原子和一個(gè)或者多個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子組成的主鏈的1-12個(gè)原子的鏈，或者具有由碳原子和一個(gè)或者多個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子構(gòu)成的包含至少一個(gè)芳基、雜芳基、取代的芳基或者取代的雜芳基的主鏈的1-20個(gè)原子的鏈(其中，例如，亞苯基環(huán)共計(jì)4個(gè)原子的長(zhǎng)度)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在本發(fā)明的基于銥的復(fù)合物中的官能團(tuán)Y選自羧酸基、N-羥基琥珀酰亞胺酯基、氨基、鹵素、巰基、馬來酰亞氨基、炔基、疊氮基和亞磷酰氨基。綴合物包含本申請(qǐng)?jiān)谏厦媾恫⒍x的式I的基于銥的電化學(xué)發(fā)光化合物和與其共價(jià)結(jié)合的生物物質(zhì)。適合的生物物質(zhì)的實(shí)例為細(xì)胞、病毒、亞細(xì)胞粒子、蛋白質(zhì)、脂蛋白類、糖蛋白類、肽類、多肽類、核酸、肽核酸(PNA)、低聚糖、多糖、脂多糖、細(xì)胞代謝物、半抗原、激素類、藥理學(xué)物質(zhì)、生物堿、甾類、維生素、氨基酸和糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明綴合物(即，與式I化合物共價(jià)結(jié)合)的生物物質(zhì)為親和結(jié)合劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)承認(rèn)的是，在本發(fā)明綴合物中，式I化合物的官能團(tuán)Y用于與親和結(jié)合劑上的基團(tuán)形成共價(jià)鍵。在親和結(jié)合試劑本身不含與基團(tuán)Y結(jié)合或者反應(yīng)的適當(dāng)基團(tuán)的情況下，可將這種基團(tuán)通過依靠已經(jīng)確立的操作容易地引入至親和結(jié)合劑中。不希望被進(jìn)一步限制，但是為清楚起見，親和結(jié)合劑可包含任何以下物質(zhì)：抗原、蛋白質(zhì)、抗體、生物素或者生物素類似物和抗生物素蛋白或者抗生蛋白鏈菌素、糖和凝集素、酶、多肽、氨基、核酸或者核酸類似物和互補(bǔ)核酸、核苷酸、聚核苷酸、肽核酸(PNA)、多糖、金屬離子螯合劑、受體激動(dòng)劑、受體拮抗劑，或者它們的任何組合。例如，親和結(jié)合劑可為特異性結(jié)合對(duì)的一個(gè)配對(duì)體，其中所述結(jié)合對(duì)的其它配對(duì)體與細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)或者是細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上的靶標(biāo)。優(yōu)選地，親和結(jié)合劑為親和結(jié)合對(duì)的配對(duì)體或者成員，或者也被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為特異性結(jié)合對(duì)的配對(duì)體或者成員。親和結(jié)合劑與它的靶標(biāo)(例如，特異性結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員，如抗體與特異性結(jié)合對(duì)的另一成員如它的抗原)具有至少107l/mol的親和性。親和結(jié)合劑與它的靶標(biāo)優(yōu)選具有108l/mol的親和性或者甚至更優(yōu)選具有109l/mol的親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及綴合物，其中所述親和結(jié)合劑選自抗原、抗體、生物素或者生物素類似物、抗生物素蛋白或者抗生蛋白鏈菌素、糖、凝集素、核酸或者核酸類似物和互補(bǔ)核酸、受體和配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及綴合物，其中所述親和結(jié)合劑選自抗體、生物素或者生物素類似物、抗生物素蛋白或者抗生蛋白鏈菌素，和核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物包含共價(jià)連接的本申請(qǐng)?jiān)谏厦媾逗投x的式I化合物和親和結(jié)合劑，所述親和結(jié)合劑為低聚核苷酸或者抗體。生物素類似物為氨基生物素、亞氨基生物素或者脫硫生物素。本申請(qǐng)使用的術(shù)語"低聚核苷酸"或者“核酸”通常是指包含至少8個(gè)核苷酸和至多約1000個(gè)核苷酸的短的、通常單鏈的聚核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，低聚核苷酸的長(zhǎng)度為至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或者30個(gè)核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，低聚核苷酸的長(zhǎng)度為不超過200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或者30個(gè)核苷酸。術(shù)語低聚核苷酸應(yīng)寬泛地理解，并包括DNA和RNA及其類似物和修飾物。核酸類似物可例如含有在標(biāo)準(zhǔn)堿基脫氧腺苷(dA)、脫氧鳥苷(dG)、脫氧胞苷(dC)、脫氧胸苷(dT)、脫氧尿苷(dU)處攜帶取代基的取代的核苷酸。這種取代的核堿基(nucleobases)的實(shí)例為：5-取代的嘧啶如5-甲基dC、氨基烯丙基dU或者dC、5-(氨基乙基-3-丙烯酰亞氨基)-dU、5-丙炔基-dU或者-dC、5-鹵化-dU或者-dC；N取代的嘧啶如N4-乙基-dC；N取代的嘌呤如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG；8-取代的嘌呤如8-[(6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或者-dA、8-鹵化dA或者dG、8-烷基dG或者dA；和2-取代的dA如2-氨基dA。核酸類似物可含有核苷酸或者核苷類似物。即，可通過使用核堿基類似物替換天然存在的核堿基，所述核堿基類似物例如5-硝基吲哚d核苷；3硝基吡咯d核苷、脫氧肌苷(dI)、脫氧黃苷(dX)；7-脫氮-dG、-dA、-dI或者-dX；7-脫氮-8-氮雜-dG、-dA、-dI或者-dX；8-氮雜-dA、-dG、-dI或者-dX；d間型霉素(dFormycin)；擬dU；擬異dC；4-硫dT；6-硫dG；2-硫dT；異dG；5-甲基-異-dC；N8-連接的8-氮雜-7-脫氮-dA；5,6-二氫-5-氮雜-dC；和亞乙烯基-dA或者吡咯-dC(pyrollo-dC)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，在互補(bǔ)鏈中的核堿基不得不以這樣的方式選擇：使得雙鏈體形成為特異性的。例如，如果在一條鏈(例如(a))中使用5-甲基-異-dC，那么異dG不得不在互補(bǔ)鏈(例如(a’))中。在核酸類似物中，低聚核苷酸主鏈可修飾，以含有取代的糖殘基、糖類似物、在核苷間的磷酸酯部分中的修飾，和/或?yàn)镻NA。低聚核苷酸可例如含有具有取代的脫氧核糖如2’-甲氧基、2’-氟、2’-甲基硒基、2’-烯丙氧基、4’-甲基dN(其中N為核堿基，例如，A、G、C、T或者U)的核苷酸。糖類似物例如為木糖；2’,4’橋接的核糖如(2'-O,4'-C亞甲基)-(被稱為L(zhǎng)NA的低聚物)或者(2'-O,4'-C亞乙基)-(被稱為ENA的低聚物)；L-核糖、L-d-核糖、己糖醇(被稱為HNA的低聚物)；環(huán)己烯基(被稱為CeNA的低聚物)；阿卓糖醇(被稱為ANA的低聚物)；三環(huán)核糖類似物，其中C3′和C5′原子通過與環(huán)丙烷環(huán)稠合的亞乙基橋連接(被稱為三環(huán)DNA的低聚物)；丙三醇(被稱為GNA的低聚物)；吡喃葡萄糖(被稱為HomoDNA的低聚物)；carbaribose(具有環(huán)戊烷代替四氫呋喃亞單元)；羥基甲基-嗎啉(被稱為嗎啉代DNA的低聚物)還已知的是，大量的核苷間磷酸酯部分的修飾不干擾雜化性質(zhì)，并且這種主鏈修飾也可與取代的核苷酸或者核苷酸類似物組合。實(shí)例為硫代磷酸酯(phosphorthioate)、二硫代磷酸酯(phosphordithioate)、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯低聚核苷酸。也可使用PNA(具有不含磷酸酯和d-核糖的主鏈)作為DNA類似物。在本發(fā)明的意義上，可將上述修飾的核苷酸、核苷酸類似物以及低聚核苷酸主鏈修飾在低聚核苷酸中按希望組合。術(shù)語"抗體"在本申請(qǐng)中以最寬的意義使用，并且具體涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙重特異性抗體)，和抗體片段，只要它們呈現(xiàn)希望的生物活性即可?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)鑒別并且從天然環(huán)境的組分分離和/或回收的抗體。天然環(huán)境的污染物組分是會(huì)干擾抗體的研究、診斷或者治療用途的物質(zhì)，并且可包括酶、激素類，和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或者非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)例如Lowry法的測(cè)定，超過95wt％的抗體，在一些實(shí)施方案中，超過99wt％的抗體，(2)足以通過使用例如轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下使用例如考馬斯藍(lán)或銀染色的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種組分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備?！疤烊豢贵w”通常為包含兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈的約150,000道爾頓的雜四聚糖蛋白類。每個(gè)輕鏈通過一個(gè)共價(jià)的二硫鍵與重鏈連接，而二硫連接的數(shù)目在具有不同的免疫球蛋白同型的重鏈中不同。每個(gè)重鏈和輕鏈也具有規(guī)則地間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每個(gè)重鏈在一端具有可變域(VH)，接著是眾多恒定域。每個(gè)輕鏈具有在一端的可變域(VL)和在另一端的恒定域；輕鏈的恒定域?qū)?zhǔn)重鏈的第一恒定域，并且輕鏈可變域?qū)?zhǔn)重鏈的可變域。特定氨基酸殘基被認(rèn)為在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。抗體的“可變域”或者“可變區(qū)域”是指抗體的重鏈或者輕鏈的氨基端區(qū)域?？蓪⒅劓湹目勺冇蚍Q為“VH”?？蓪⑤p鏈的可變域稱為“VL”。這些區(qū)域通常為抗體的最可變部分并含有抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語“可變”是指以下事實(shí)：在抗體中，可變域的某些部分在序列方面嚴(yán)重不同，并且用在每一特定抗體對(duì)于它的特定抗原的結(jié)合和特異性中。然而，可變性在抗體的整個(gè)可變域中不平均分布。在輕鏈和重鏈可變域中，它集中在被稱為高度可變域(HVR)的三個(gè)區(qū)段中。將可變域的更加高度保守的部分稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含4個(gè)通過3個(gè)HVR連接的在很大程度上采取β-層構(gòu)型的FR區(qū)，所述3個(gè)HVR連接形成環(huán)路連接，并且在一些情況中，形成β-層結(jié)構(gòu)的一部分。在每個(gè)鏈中的HVR通過FR區(qū)靠近地保持在一起，并且與來自其它鏈的HVR一起促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接牽涉在抗體與抗原的結(jié)合中，但是呈現(xiàn)多種效應(yīng)子功能，例如在抗體依賴性細(xì)胞毒性中抗體的參與?？蓪碜匀魏渭棺祫?dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”指定為被稱為kappa(κ)和lambda(λ)的兩種明確不同類型中的一種，這是基于它們的恒定域的氨基酸序列。取決于它們的重鏈的恒定域的氨基酸序列，可將抗體(免疫球蛋白)指定為不同的種類。具有5種主要的免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG，和IgM，并且這些類別中的數(shù)種可進(jìn)一步分成亞類(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，和IgA2。不同類別的免疫球蛋白的亞單元結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的，并且一般性描述在例如Abbas等人,CellularandMol.Immunology,4thed.,W.B.Saunders,Co.(2000)中?？贵w可為較大融合分子的一部分，所述較大融合分子通過抗體與一種或者多種其它蛋白質(zhì)或者肽類的共價(jià)或者非共價(jià)締合形成。術(shù)語“全長(zhǎng)抗體”、“完整抗體”和“整個(gè)抗體”在本申請(qǐng)中可互換使用，表示呈基本完整形式的抗體，而非下面定義的抗體片段。該術(shù)語具體表示重鏈含有Fc區(qū)的抗體?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選地，包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')2，和Fv片段；雙抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩種相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段(每個(gè)具有單一抗原結(jié)合位點(diǎn))，和殘留“Fc”片段(它的名稱反映出它容易結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處理得到具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab’)2片段并且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈Fv物質(zhì)由緊密的非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)物質(zhì)中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可通過柔性肽銜接物共價(jià)連接，使得輕鏈和重鏈可以以類似于雙鏈Fv物質(zhì)中的結(jié)構(gòu)的“二聚”結(jié)構(gòu)締合。正是以這種構(gòu)型，才使得每個(gè)可變域的3個(gè)HVR相互作用，以在VH-VL二聚體的表面上限定抗原結(jié)合位點(diǎn)。共同地，6個(gè)HVR向抗體給予抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單一可變域(或者對(duì)抗原具有特異性的僅包含3個(gè)HVR的半個(gè)Fv)具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段含有重鏈和輕鏈可變域，并且也含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。通過在重鏈CH1域的羧基端添加幾個(gè)殘基(包括一個(gè)或者多個(gè)來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸)，F(xiàn)ab’片段不同于Fab片段。Fab’-SH是本申請(qǐng)中用于Fab’的符號(hào)名稱，其中恒定域的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基帶有游離巰基。F(ab’)2抗體片段最初作為Fab’片段的對(duì)產(chǎn)生，所述Fab’片段在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的?！皢捂淔v”或者“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL域，其中這些域存在于單一多肽鏈中。通常，scFv多肽還在VH和VL域之間包含多肽銜接物，所述多肽銜接物使得scFv能夠形成抗原結(jié)合所希望的結(jié)構(gòu)。為了回顧scFv，參見，例如，Plueckthun,In:ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,Vol.113,Rosenburg和Moore(eds.),Springer-Verlag,NewYork(1994)pp.269-315。術(shù)語“雙抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，該片段在相同多肽鏈(VH-VL)中包含與輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)。通過使用太短以至于不允許在相同鏈上的兩個(gè)域之間配對(duì)的銜接物，迫使所述域與另一鏈的互補(bǔ)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體可為二價(jià)的或者雙特異性的。雙抗體更詳細(xì)地描述在例如，EP0404097；WO1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,PNASUSA90(1993)6444-6448中。三體(triabody)和四體(tetrabody)也描述在Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134中。本申請(qǐng)使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各抗體個(gè)體是相同的，除了可以以極小量存在的可能的突變?nèi)缣烊淮嬖谕蛔冃问酵?。因此，修飾詞“單克隆”表示抗體的特征為不是離散抗體的混合物。在某些實(shí)施方案中，這種單克隆抗體通常包括包含結(jié)合靶標(biāo)的多肽序列的抗體，其中所述靶標(biāo)結(jié)合多肽序列通過以下方法獲得：所述方法包括從多個(gè)多肽序列選擇單一靶標(biāo)結(jié)合多肽序列。例如，選擇方法可為從多個(gè)克隆如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或者重組DNA克隆的庫中選擇單一克隆。應(yīng)理解的是，可將選擇的靶標(biāo)結(jié)合序列進(jìn)一步改變，例如，改善對(duì)靶標(biāo)的親和性、人源化靶標(biāo)結(jié)合序列、改善它的在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量、降低它的體內(nèi)免疫原性、創(chuàng)造多特異性抗體等，并且包含改變的靶標(biāo)結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與多克隆抗體制品(其通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體)相反，單克隆抗體制品的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體制品的優(yōu)勢(shì)還在于它們通常未被其它免疫球蛋白污染。如上所述，本申請(qǐng)披露的化合物和綴合物具有相當(dāng)有利的性質(zhì)。例如，披露的化合物或者綴合物分別顯示高ECL效力。如果相應(yīng)的測(cè)量在含水系統(tǒng)中實(shí)施，這種高效力也是存在的，相比之下，許多ECL-標(biāo)記僅在有機(jī)溶劑中分析時(shí)顯示高ECL效力。例如，許多OLED染料通常在乙腈中分析，且在水溶液中不溶，或者如果在水溶液中可溶，預(yù)計(jì)不顯示有效的電化學(xué)發(fā)光。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明分別涉及本發(fā)明中披露的化合物或者綴合物在進(jìn)行水溶液中的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的用途。水溶液是包含至少90％水(以重量計(jì))的任何溶液。顯然，這種水溶液可含有另外的成分，例如緩沖劑化合物、洗滌劑和作為ECL反應(yīng)中的電子給體的例如叔胺如三丙基胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分別涉及本發(fā)明中披露的化合物或者綴合物在基于電化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)方法中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分別涉及本發(fā)明中披露的化合物或者綴合物在檢測(cè)分析物中的用途。本發(fā)明的分析物可為任何無機(jī)或者有機(jī)分子，包括感興趣的任何生物物質(zhì)。代表本發(fā)明意義上的分析物的適合生物物質(zhì)的實(shí)例為細(xì)胞、病毒、亞細(xì)胞粒子、蛋白質(zhì)、脂蛋白類、糖蛋白類、肽類、多肽類、核酸、低聚糖、多糖、脂多糖、細(xì)胞代謝物、半抗原、激素類、藥理學(xué)物質(zhì)、生物堿、甾類、維生素、氨基酸和糖。分析物可選自多肽、碳水化合物，和無機(jī)或者有機(jī)藥物分子。多肽或者蛋白質(zhì)是基本上由氨基酸組成并且具有至少兩個(gè)通過肽連接鍵連接的氨基酸的分子。在本申請(qǐng)披露的方法中研究感興趣的分析物的情況中，多肽優(yōu)選由至少5、6、7、8、9、10、12、15、20、25和30個(gè)至最多約10,000個(gè)氨基酸組成。優(yōu)選地，多肽將含有5-2,000個(gè)氨基酸，還優(yōu)選10-1,000個(gè)氨基酸。在分析物為核酸的情況中，這些核酸優(yōu)選為天然存在的DNA或者RNA低聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過體外方法測(cè)量分析物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供懷疑或者已知包含所述分析物的樣品，(b)在適于形成分析物綴合物復(fù)合物的條件下，使所述樣品與本發(fā)明中披露的親和結(jié)合劑和式I化合物的綴合物接觸，(c)步驟(b)中形成的測(cè)量復(fù)合物并由此得到分析物的測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在上面的檢測(cè)分析物的方法中的測(cè)量通過使用基于電化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)操作來實(shí)施。還優(yōu)選的是，所述方法在水溶液中進(jìn)行。提供以下實(shí)施例以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)際范圍在所附權(quán)利要求中闡述。應(yīng)理解的是，可對(duì)所闡述的操作進(jìn)行修飾，而不脫離本發(fā)明的主旨。實(shí)施例1合成取代的苯基菲啶實(shí)施例1.1用于合成取代的2-氨基聯(lián)苯的一般操作：使用在可商購(gòu)得到的2-溴苯胺衍生物和相應(yīng)的芳基硼酸之間的由Youn,S.W.在TetrahedronLett.50(2009)4598-4601中描述的Suzuki-Miyaura偶聯(lián)反應(yīng)，可合成適當(dāng)?shù)?-氨基聯(lián)苯，其為進(jìn)一步反應(yīng)成菲啶所需要。典型操作：a:10mol％PdCl2(PPh3)2,K2CO3,DMF/H2O(5/1),80℃,24小時(shí)其它實(shí)例：實(shí)施例1.2用于合成取代的菲啶的一般操作：向2-芳基苯胺1(0.01mol)在氯仿(20ml)中的冰冷卻的溶液中添加芳基酰氯2(0.01mol)并在惰性條件下在室溫?cái)嚢?0分鐘。接下來，將所得混合物在攪拌下回流2小時(shí)。歷時(shí)60分鐘將反應(yīng)混合物通過滴加吡啶(0.02mol，在10ml氯仿中)處理。將混合物冷卻至室溫，并攪拌過夜。將混合物用0.5MHCl充分洗滌，用MgSO4干燥并真空濃縮。將粗產(chǎn)物通過快速色譜法在硅膠上純化(3:2的己烷/乙酸乙酯)，以66％收率得到純產(chǎn)物3。將苯甲酰氨基-2-聯(lián)苯3(0.01mol)和POCl3(5ml)在20ml甲苯中的溶液在氮?dú)庀禄亓鞑嚢?8小時(shí)，遵循Lion,C.在Bull.Soc.Chim.Belg.98(1989)557-566中所述的操作。將冷卻的反應(yīng)混合物用CH2Cl2(30ml)稀釋，并倒入冰中，用25％NH4OH和蒸餾水洗滌。將有機(jī)層用MgSO4干燥并真空濃縮，然后實(shí)施快速色譜法(硅膠,1:1的己烷/乙酸乙酯)，得到產(chǎn)物4,6-苯基菲啶。收率：52％。白色固體。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.54-7.85(m,9H),8.10(d,J＝8.0Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.67(d,J＝8.4Hz,1H)。使用2-萘-2-基-苯基胺替代2-芳基-苯胺：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(d,J＝9.1Hz,2H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H),8.16(d,J＝8.92Hz,1H),7.92(d,J＝7.48Hz,1H),7.79-7.75(m,2H),7.69(t,J＝14.0,8.2Hz,1H),7.63-7.61(m,2H),7.53-7.46(m,4H),7.19(t,J＝14.3,7.2Hz,1H)。MS:[M+H]+306.3使用萘碳酰氯替代苯基酰氯：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝8.3Hz,1H),8.65(d,J＝8.1Hz,1H),8.27(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(s,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝8.4Hz,1H),7.97-7.94(m,2H),7.90-7.85(m,2H),7.80-7.69(m,2H),7.62(t,J＝14.2,7.1Hz,1H),7.59-7.55(m,2H)。MS:[M+H]+306.3實(shí)施例1.3合成6-(2-磺基苯基)菲啶的操作6-(2-磺基苯基)菲啶可通過以下方法合成：使用Nicolai,E.在Chem.Pharm.Bull.42(1994)1617-1630中所述的操作，將芳基苯胺(0.01mol)與2-磺基苯甲酸環(huán)酸酐(0.01mol)在CH3CN中溫和加熱6小時(shí)。在純化后，可將產(chǎn)物基于實(shí)施例1.2中描述的方法轉(zhuǎn)化成適當(dāng)?shù)姆凄?。?shí)施例1.4合成6-苯基-烷基磺?；凄さ牟僮?-苯基-烷基磺?；凄た赏ㄟ^以下方法合成：使用Lion,C.在Bull.Soc.Chim.Belg.98(1989)557-566中所述的操作，將烷基磺?；?芳基苯胺(0.01mol)與苯甲酰氯(0.01mol)在氯仿中溫和加熱，參見實(shí)施例1.2。在純化后，可將產(chǎn)物基于實(shí)施例1.2中所述的方法轉(zhuǎn)化成適當(dāng)?shù)姆凄ぁ?H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.92(d,J＝8.7Hz,1H),8.75(d,J＝1.9Hz,1H),8.68(d,J＝7.0Hz,1H),8.35(dd,J＝8.7,2.0Hz,1H),8.30(d,J＝7.2Hz,1H),7.89(t,J＝15.3,7.1Hz,1H),7.81-7.73(m,3H),7.64-7.56(m,3H)3.12(s,3H)。MS:[M+H]+334,36-(4-甲基磺基苯基)菲啶也可遵循Cymerman,J.在J.Chem.Soc.(1949)703-707中所述的操作制備。實(shí)施例1.5合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶合成甲苯磺酸2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-醇酯：操作：(JACS,2007,129,13364)向2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-醇(7g,33.6mmol)和三乙胺(4.9ml,35.3mmol)在無水CH2Cl2(100ml)中的溶液中添加4-甲苯磺酰氯(6.7g,35.3mmol)和DMAP(120mg)。將混合物在室溫?cái)嚢?0小時(shí)。將反應(yīng)混合物先后用80mLHCl(1M)和水洗滌。將萃取液用無水MgSO4干燥，過濾并蒸發(fā)濾液。殘留物不經(jīng)進(jìn)一步純化就用于后續(xù)步驟。收率：11.0g(90％)NMR:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.75-7.64(m,2H),7.31-7.26(m,2H),4.16-4.06(m,2H),3.62(m2H),3.59-3.40(m,10H),3.30(s,3H),2.38(s,3H)。13C{1H}NMR(101MHz,CDCl3)δ144.75(s),132.90(s),129.77(s),127.8(s),71.82(s),70.60(s),70.48(s),70.47(s),70.41(s),70.39(s),69.23(s),68.55(s),58.90(s),21.53(s)。合成4-PEG4-苯甲酸乙酯：操作：(JACS,2007,129,13364)將化合物2-乙基-4-甲基苯磺酸2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基酯(8.1g,22.3mmol)、4-羥基苯甲酸乙酯(3.7g,22.3mmol)、K2CO3(15.4g,111.5mmol)和18-冠-6(0.59g,2.2mmol)的混合物在丙酮(120ml)中回流22小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮并用乙酸乙酯萃取。將萃取液用H2O洗滌，用無水MgSO4干燥，并過濾。將濾液蒸發(fā)至干，并通過柱色譜法在硅膠(二氯甲烷/甲醇＝100:1)上純化殘留物，得到化合物(1.93g,88％)。收率：7g(88％)NMR:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.01-7.84(m,2H),6.96-6.85(m,2H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),4.12(dd,J＝5.4,4.3Hz,2H),3.82(dd,J＝5.4,4.2Hz,2H),3.71-3.56(m,10H),3.51-3.45(m,2H),3.32(s,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H)。13C{1H}NMR(101MHz,CDCl3)δ166.29(s),162.47(s),131.45(s),123.01(s),114.11(s),71.90(s),70.84(s),70.60(s),70.59(s),70.58(s),70.48(s),69.51(s),67.54(s),60.57(s),58.98(s),14.35(s)。MS(+):[M+Na+]+＝計(jì)算值379.1727,實(shí)測(cè)值379.1743合成4-PEG4-苯甲酸：操作：(JACS,2007,129,13364)將化合物4-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基氧基)苯甲酸乙酯(7g,19.6mmol)和KOH(2.3g,41.24mmol)在200mLEtOH/H2O(1:1v/v)中的混合物回流過夜。在冷卻后，將混合物用HCl(2N)中和。將所得混合物用EtOAc萃取并蒸發(fā)至干。將所得白色固體在EtOAc/己烷中重結(jié)晶。收率：5.3g(85％)NMR:1HNMR(300MHz,CDCl3)δ11.17(s,1H),8.14-7.89(m,2H),7.03-6.75(m,2H),4.29-4.02(m,2H),3.92-3.81(m,2H),3.78-3.57(m,10H),3.57-3.46(m,2H),3.35(s,3H)。13C{1}NMR(75MHz,CDCl3)δ171.46(s),163.24(s),132.30(s),121.98(s),114.33(s),71.96(s),70.91(s),70.67(s),70.66(s),70.64(s),70.54(s),69.55(s),67.66(s),59.08(s)。MS(-):[M-H]-＝計(jì)算值327.1438,實(shí)測(cè)值327.1456合成N-聯(lián)苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺:操作：在0℃，向4-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基氧基)苯甲酸(3g,9.14mmol)、0.2mLDMF在30mL無水DCM中的溶液中添加草酰氯(1.05mL,12.34mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時(shí)。將溶液濃縮至干。油狀殘留物不經(jīng)進(jìn)一步純化就用于后續(xù)步驟。在惰性氣氛下，將2-苯基苯胺(1.6g)、吡啶(2.4mL)在氯仿(80mL)中的溶液冷卻至0℃。將4-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基氧基)苯甲酰氯(3.1g,9.14mmol)緩慢添加至溶液，并使最終混合物達(dá)到室溫。將溶液回流2小時(shí)，并在室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)混合物用HCl(1M,2x100mL)、NaHCO3(100mL)和水(50mL)萃取。將有機(jī)相用MgSO4干燥并通過色譜法在硅膠中純化(EtOAc/己烷)。收率：4.1(90％)NMR:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(dd,J＝8.3,0.9Hz,1H),7.94(s,1H),7.61-7.35(m,9H),7.33-7.25(m,1H),7.19(m,1H),6.91-6.84(m,2H),4.16-4.10(m,2H),3.85(m,2H),3.77-3.58(m,10H),3.56-3.49(m,2H),3.36(s,3H)。13C{1H}NMR(101MHz,CDCl3)δ164.56(s),161.65(s),138.18(s),135.12(s),132.32(s),129.97(s),129.39(s),129.22(s),128.66(s),128.57(s),128.16(s),127.13(s),124.18(s),121.23(s),114.57(s),71.95(s),70.89(s),70.64(s),70.63(s),70.54(s),69.54(s),67.63(s),59.04(s),53.51(s)。MS(+)[M+H]+＝計(jì)算值480.2386,實(shí)測(cè)值480.2383；[M+Na]+＝計(jì)算值502.2200,實(shí)測(cè)值502.2204合成6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶：操作：將N-聯(lián)苯-2-基-4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯甲酰胺(4g,8.34mmol)、POCl3(10ml)在10ml甲苯中的溶液回流20小時(shí)。將混合物冷卻至室溫，并添加100ml二氯甲烷。將溶液倒入冰中，并用NH4OH(20％)中和混合物。將有機(jī)相相繼用蒸餾水和鹽水萃取并洗滌，并用MgSO4干燥。將所得溶液通過快速色譜法純化(硅膠，在1:1的乙酸乙酯/己烷中，Rf＝0.14)。收率：1g(25％)NMR:1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝8.3Hz,1H),8.59(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),8.23(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),8.15(dd,J＝8.3,0.7Hz,1H),7.84(ddd,J＝8.3,7.1,1.3Hz,1H),7.79-7.57(m,5H),7.15-7.03(m,2H),4.29-4.19(m,2H),3.93-3.90(m,2H),3.80-3.60(m,12H),3.59-3.49(m,2H),3.37(s,3H)。13C{1H}NMR(75MHz,CDCl3)δ160.92(s),159.45(s),143.84(s),133.59(s),131.26(s),130.61(s),130.26(s),129.05(s),128.90(s),127.19(s),126.85(s),125.39(s),123.70(s),122.29(s),122.01(s),114.68(s),72.02(s),70.97(s),70.74(s),70.72(s),70.69,70.62(s),69.80(s),67.68(s),59.15(s)。MS(+)JM358-F5,[M+H]+計(jì)算值＝462,2280,實(shí)測(cè)值462.2275實(shí)施例2用于合成氯-交聯(lián)的二聚體復(fù)合物的一般操作：一般操作由Nonoyama,M.,J.Organomet.Chem.86(1975)263-267公開。銥二聚體如下合成：將IrCl3·3H2O和2.5當(dāng)量的6-苯基菲啶在氮?dú)庀略?-乙氧基乙醇/水混合物(3:1,v/v)中在120℃加熱18小時(shí)。在冷卻至室溫后，將沉淀物過濾并相繼用甲醇和Et2O洗滌，干燥，得到希望的二聚體。實(shí)施例2.1具有未取代苯基菲啶的復(fù)合物[(6-苯基菲啶)2IrCl]2.收率：71％。棕色固體。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ6.45(d,J＝6.8,4H),6.58(t,J＝7.1,13.9Hz,4H),6.95(t,J＝7.1,14.2Hz,4H),7.56(t,J＝7.4,16.0Hz,4H),7.68(t,J＝8.1,16.2Hz,4H),7.93(t,J＝8.0,14.6Hz,4H),8.07-8.13(m,8H),8.80(d,J＝7.3Hz,4H),8.93-9.01(m,12H)。實(shí)施例2.2具有取代的苯基菲啶的復(fù)合物將6-[4-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯基]-菲啶(1g,2.16mmol)、IrCl3·3H2O(346mg,0.98mmol)在16ml2-EtOEtOH:H2O(12:4)中的混合物在氮?dú)鈿夥障禄亓鬟^夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并添加60ml水，得到油狀沉淀物。棄去上清液，并將50ml水添加至殘留物。將混合物攪拌1小時(shí)，得到紅棕色沉淀物。將固體過濾，并用水(50ml)和Et2O(30ml)洗滌。將棕色固體溶解在較小量的二氯甲烷中，并通過添加Et2O沉淀。其不經(jīng)進(jìn)一步純化就用于后續(xù)步驟。收率：550mg(50％)NMR:1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝8.1Hz,4H),8.36(dd,J＝8.0,5.2Hz,8H),7.90(dd,J＝14.7,7.7Hz,8H),7.81(d,J＝9.0Hz,4H),7.79-7.67(m,4H),6.78-6.65(m,4H),6.32(dd,J＝8.8,2.5Hz,4H),5.89-5.83(m,4H),5.28(d,J＝2.5Hz,4H),3.67-3.10(m,100H,PEG鏈,含有一些雜質(zhì))MS(ESI-MS(+)):[M+2Na+]2+計(jì)算值1171.3463,實(shí)測(cè)值1171.3473；[(C^N)2Ir]+＝計(jì)算值1113.3877,實(shí)測(cè)值1113.3892實(shí)施例3A)合成羧基亞烷基氧基-吡啶-2-甲酸衍生物：將3-羥基-2-吡啶羧酸(0.01mol)、4-溴丁酸乙酯或者6-溴己酸乙酯(0.021mol)的混合物，和碳酸鉀(5當(dāng)量)在DMF(20ml)中的混合物在氮?dú)庀略?0℃加熱20小時(shí)。在冷卻后，將反應(yīng)混合物倒入冰-水混合物中，并用二氯甲烷(30ml)萃取三次，用無水MgSO4干燥，過濾并將溶劑蒸干。通過快速色譜法純化(硅膠,3:1的己烷/乙酸乙酯)，得到產(chǎn)物(基于專利US5,219,847)。將形成的酯通過NaOH在MeOH(pH＝10)中水解。然后將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0，并在室溫?cái)嚢柽^夜。真空除去溶劑，并將殘留物從己烷/丙酮結(jié)晶，得到希望的產(chǎn)物。3-(羧基-戊基氧基)-吡啶-2-羧酸。收率：51％?；疑腆w。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.39-1.45(m,2H),1.51-1.57(m,2H),1.67-1.74(m,2H),2.19-2.23(m,2H),4.04-4.07(m,2H),7.47-7.50(m,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),8.13(d,J＝8.1Hz,1H)。B)合成5-[4-(2-羧基-乙基)-苯基]-吡啶-2-羧酸在氬氣氣氛下，向4ml1,2-二甲氧基乙烷中添加5-溴-吡啶-2-羧酸(93mg,0.46mmol)、4-(2-羧基乙基)苯硼酸(106mg,0.55mmol)、0.51ml2M碳酸鈉水溶液和二(三苯基膦)二氯化鈀(II)(20mg,0.03mmol)。將混合物在90℃攪拌過夜，冷卻并用水萃取。添加乙酸乙酯，并將混合物用1M鹽酸調(diào)節(jié)至pH＝2。在用乙酸乙酯三倍萃取后，將合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾，并真空蒸發(fā)。將殘留物通過硅膠色譜法純化(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇5:1)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(d,J＝2Hz,1H),8.25(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.74(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(d,J＝8.2Hz,2H),2.91(t,J＝15,7.5Hz,2H),2.61(t,J＝15.1,7.6Hz,2H)。MS：[M+H]+272.3實(shí)施例4用于合成銥復(fù)合物的一般操作將0.5mmol氯交聯(lián)二聚體復(fù)合物、1.25mmol吡啶-2-甲酸酯(picolinate)和3mmolNa2CO3混合至2-乙氧基乙醇(12ml)中，并在120℃加熱15小時(shí)。向冷卻的混合物中添加蒸餾水(25ml)，然后將粗產(chǎn)物濾出并用水洗滌，然后用數(shù)份正己烷和Et2O洗滌。將產(chǎn)物通過柱色譜法純化(硅膠,正己烷/二氯甲烷)，得到紅色粉末。(基于Lamansky,S.,Inorg.Chem.40(2001)1704-1711)Ir(6-苯基菲啶)2吡啶-2-羧酸：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.17(d,J＝7.8Hz,1H),9.09(d,J＝8.2Hz,1H),8.71(d,J＝8.2Hz,1H),8.62(t,J＝14.8,7.8Hz,2H),8.43-8.33(m,4H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),7.92-7.77(m,4H),7.65(t,J＝15,7.9Hz,2H),7.57-7.46(m,3H),7.36(t,J＝14.8,7.8Hz,1H),7.19-7.16(m,2H),7.10(d,J＝7.8Hz,1H),7.04(t,J＝14.2,6.8Hz,1H),6.92(t,J＝14.1,6.7Hz,1H),6.80(t,J＝13.7,6.8Hz,1H),6.67(t,J＝13.7,6.6Hz,1H),6.51(d,J＝6.8Hz,1H)。MS：[M+H]+826.4Ir(6-苯基菲啶)25-(甲氧基)吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.15(d,J＝8.2Hz,1H),9.09(d,J＝8.2Hz,1H),8.70(d,J＝7.8Hz,1H),8.61(d,J＝8.2Hz,2H),8.44-8.35(m,3H),8.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.97(d,J＝2.7,1H),7.91-7.86(m,2H),7.82-7.80(m,2H),7.68(d,J＝8.6Hz,1H),7.57-7.53(m,3H),7.36(t,J＝15.2,7.2Hz,1H),7.14(t,J＝15.1,7.6Hz,1H),7.08-6.93(m,4H),6.78(t,J＝14.9,7.6Hz,1H),6.65(t,J＝14.8,7.6Hz,1H),6.49(d,J＝7.6Hz,1H),3.63(s,3H)。MS：[M+H]+854.2Ir(6-苯基菲啶)24-(羥基甲基)吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(d,J＝8.1Hz,2H),8.96(d,J＝8.0Hz,1H),8.87(d,J＝7.7Hz,1H),8.73(d,J＝7.7Hz,1H),8,68(d,J＝7.8Hz,1H),8.51(d,J＝8.6Hz,1H),8.37(d,J＝8.2Hz,1H),8.26-8.24(m,2H),8.10(t,J＝14.7,7.3Hz,1H),8.02-7.96(m,3H),7.68(d,J＝8.4Hz,1H),7.62(t,J＝15.2,7.1Hz,1H),7.53-7.48(m,2H),7.39-7.37(m,2H),7.16(t,J＝15.3,7.2Hz,1H),7.10-7.04(m,2H),6.86(d,J＝6.8Hz,1H),6.78(t,J＝14.2,7.1Hz,1H),6.67(t,J＝14.9,7.3Hz,1H),6.35(d,J＝6.8Hz,1H),5.32(s,1H),4.33(s,2H)。MS：[M+H]+854.2Ir(6-苯基菲啶)23-羥基吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.15(d,J＝8.3Hz,1H),9.06(d,J＝8.2Hz,1H),8.65-8.57(m,3H),8.46-8.41(m,2H),8.34(d,J＝8.0Hz,1H),8.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.94-7.78(m,5H),7.72(d,J＝7.8Hz,1H),7.58-7.55(m,2H),7.40(t,J＝14.0,7.0Hz,1H),7.15(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.05-6,95(m,5H),6.77(t,J＝13.7,7.0Hz,1H),6.66(t,J＝13.6,6.4Hz,1H),6.50(d,J＝6.6Hz,1H)。MS：[M+H]+839.2Ir(6-苯基-苯并菲啶)2吡啶-2-羧酸：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.04(m,4H),8.82(m,2H),8.77-8.70(m,1H),8.41(d,J＝8.0Hz,1H),8.29-8.27(m,2H),8.15-8.09(m,4H),7.85(d,J＝8.3Hz,1H),7.78-7.71(m,4H),7.65(d,J＝7.7Hz,1H),7.62-7.553(m,2H),7.45-7.40(m,2H),7.23-7.17(m,1H),7.13-7.05(m,3H),7.05-7.00(m,1H),6.83(dd,J＝10.8,4.0Hz,1H),6.68(dd,J＝10.9,3.8Hz,1H),6.51(dd,J＝7.6,0.9Hz,1H)。MS：[M+H]+924.2Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24(m,1H),9.15(d,J＝8.0Hz,1H),8.97(d,J＝8.4Hz,1H),8.88(d,J＝8.1Hz,1H),8.73(d,J＝7.6Hz,1H),8.68(d,J＝7.4Hz,1H),8.50(d,J＝7.8Hz,1H),8.45(d,J＝7.9Hz,1H),8.34(d,J＝2.0Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.13-8.00(m,4H),7.92(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.63(t,J＝15.2,7.0Hz,2H),7.54-7.42(m,3H),7.35(d,J＝8.2Hz,2H),7.17(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.10-7.06(m,3H),7.02(t,J＝15.7,7.3Hz,1H),6.89(d,J＝6.7Hz,1H),6.77(t,J＝14.0,7.1Hz,1H),6.71(t,J＝14.8,7.0Hz,1H),6.45(d,J＝6.7Hz,1H),2.86(t,J＝15.2,7.5Hz,2H),2.55(t,J＝15.4,7.7Hz,2H)。MS：[M+H]+972.3合成JM360：JM360將Ir二聚體(150mg,0,065mmol)、吡啶-2-甲酸(17mg,0.137mmol)和Na2CO3(70mg,0.65mmol)在20mL二氯甲烷/乙醇(4:1)中的混懸液回流過夜。在冷卻后，將混合物濃縮至干。將殘留物通過快速色譜法在二氯甲烷/MeOH中純化(梯度為100:0-10:1)。將化合物在二氯甲烷/Et2O中重結(jié)晶。收率：30％。NMR：1HNMR(300MHz,CDCl3)δ9.06(d,J＝8.2Hz,1H),8.98(d,J＝8.1Hz,1H),8.61(m,3H),8.46-8.21(m,4H),8.13(d,J＝8.9Hz,1H),7.83(m,4H),7.61(m,2H),7.57-7.41(m,3H),7.30(d,J＝7.2Hz,1H),7.24-7.12(m,1H),6.89(t,J＝7.2Hz,1H),6.76(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.61(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.54(d,J＝2.5Hz,1H),5.99(d,J＝2.6Hz,1H),3.85-3.41(m,32H),3.34(s,3H),3.33(s,3H)。MS：[2M+2Na]2+計(jì)算值1258.4012,實(shí)測(cè)值1258.4030.[M+H]+計(jì)算值1236.4197,實(shí)測(cè)值1236.4227實(shí)施例5使用新的銥復(fù)合物的ECL在分析儀(RocheDiagnosticsGmbH)中評(píng)價(jià)數(shù)種金屬?gòu)?fù)合物的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量在不存在抗生蛋白鏈菌素包衣的順磁性微粒的情況下相似地進(jìn)行。將0.1mg/mlDMSO的每一金屬?gòu)?fù)合物的儲(chǔ)備溶液用PBS緩沖劑稀釋，得到10nM溶液。將10nM溶液作為樣品在分析儀上處理。將20μl樣品與90μl試劑1(ProCell)和90μl試劑2(ProCell)一起在37℃孵育9分鐘，并隨后量化電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。ECL結(jié)果：參照Ru(bpy)3＝10000計(jì)數(shù)，以10nmolar濃度-JM360＝31258計(jì)數(shù)，以10nmolar濃度-RC72＝45512計(jì)數(shù)，以10nmolar濃度RC72實(shí)施例6合成具有用于生物綴合的反應(yīng)性基團(tuán)的銥復(fù)合物將Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸(15mg)溶解在5mL無水乙腈和0.01mL無水吡啶的混合物中。添加碳酸二琥珀酰亞氨基酯(DSC)(1.5當(dāng)量)，并將混合物在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢柽^夜。將溶液添加至氯仿(10mL)，用0.5MHCl(1x2mL)、飽和NaHCO3水溶液(1x2mL)和水(2x5mL)洗滌，用MgSO4干燥，并真空濃縮，得到紅色粉末狀物。Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸N-琥珀酰亞氨基酯：1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.25(m,1H),9.17(d,J＝8.0Hz,1H),8.83(d,J＝8.4Hz,1H),8.75-8.68(m,1H),8.60-8.54(m,3H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.43(d,J＝2.1Hz,1H),8.30(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(t,J＝15.4,7.2Hz,1H),7.97-7.95(m,3H),7.77-7.70(m,2H),7,61(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.52-7.44(m,3H),7.36(d,J＝8.3Hz,2H),7.18(t,J＝15.2,7.0Hz,1H),7.12-7.09(m,3H),7.04-6.98(m,2H),6.78(t,J＝14.9,7.2Hz,1H),6.71(t,J＝14.8,7.5Hz,1H),6.57(d,J＝7.6Hz,1H),3,07-3,01(m,4H),2,80(s,4H)。MS：[M+H]+1069.3實(shí)施例7合成具有生物素的銥復(fù)合物綴合物將Ir(6-苯基菲啶)22-(羧基乙基-苯基)吡啶-2-羧酸NHS酯(12mg)和4mgN-生物素基-3,6-二氧雜辛烷-1,8-二胺三氟乙酸鹽溶解在5mL無水DMF中。添加吡啶(0.016mL，在2mLDMF中)，并將混合物在氮?dú)庀略谑覝財(cái)嚢柽^夜。將溶液添加至氯仿(10mL)，用0.5MHCl(1x2mL)、飽和NaHCO3水溶液(1x2mL)和水(2x5mL)洗滌，用MgSO4干燥，并真空濃縮，得到紅色粉末狀物。將產(chǎn)物通過柱色譜法純化(硅膠,正己烷/乙酸乙酯)，得到紅色粉末狀物。MS：[M+H]+1328.6。