專利名稱：一種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子及其制備方法和應(yīng)用，屬于高分 子化學(xué)、藥物制劑技術(shù)和食品化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米科技與生命醫(yī)學(xué)的結(jié)合，使人類在疾病診斷、治療等方面獲得了新的認(rèn)識 和途徑，納米載藥體系就是其中一個很有生命力的研究方向。一個理想納米藥物載體要 滿足良好生物相容性、靶向輸送、控制釋放等諸多條件。明膠(gelatin)是一類來源于動物結(jié)締組織中膠原蛋白的水解產(chǎn)物，具有良好的 生物相容性、可生物降解性和無免疫抗原性以及優(yōu)良的粘性、膠凝性、成膜性等，被廣 泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)中。明膠納米粒子可以用來吸附或包埋各種不同性質(zhì) 的藥物(如抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素等)或者無機(jī)粒子(如金、氧化鐵等)。由于明膠具有很好的膠凝性，明膠在一定的溫度、濃度、pH等條件下容易得 到可逆凝膠，因此穩(wěn)定的明膠納米粒子的通用制備方法為戊二醛輔助交聯(lián)的兩步去溶劑 法。但戊二醛有一定的細(xì)胞毒性，用作醫(yī)用材料的制備時有一定的局限性。另一方面，普通的明膠納米粒子在生物體內(nèi)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，不具備 長循環(huán)性質(zhì)。經(jīng)過表面親水修飾得明膠納米粒子，可以獲得長循環(huán)明膠納米粒子。目 前關(guān)于明膠納米粒子的表面親水修飾研究較多的為PEG改性法。但文獻(xiàn)報道PEG修 飾明膠或者PEG修飾明膠納米粒子制備過程繁瑣，常常使用到有機(jī)溶劑和有毒化學(xué) 試劑，容易造成污染，給藥品安全帶來威脅，不適應(yīng)體內(nèi)安全要求，也不利于工業(yè)生 產(chǎn){Biomacromolecules 2004，5 202-208}{Journal of PharmaceuticalSciences 96(2) 397-407.丨。最近，有研究報道含葡聚糖等親水性多糖鏈段的納米粒子在體內(nèi)也具有類 似PEG化納米粒子的長循環(huán)性質(zhì)。Chauvierre等發(fā)現(xiàn)在葡聚糖分子鏈末端可引發(fā)氰基 丙烯酸丁酯單體聚合得到葡聚糖_b-聚氰基丙烯酸丁酯嵌段共聚物，由此類葡聚糖嵌段 共聚物制備的納米粒子不僅可以減少血漿蛋白吸附，而且還具備長循環(huán)性質(zhì){Colloid and Polymer Science 282 (9) 1016-1025.}。因此，發(fā)展一種穩(wěn)定的多糖修飾的明膠納米粒子及其制備方法和應(yīng)用具有很好 的應(yīng)用前景。本發(fā)明擬采用球狀蛋白質(zhì)的交聯(lián)和Maillard反應(yīng)來制備一種穩(wěn)定的多糖修 飾明膠納米粒子的研究未見報道。球狀蛋白質(zhì)的加熱凝膠化性質(zhì)，可以用來改善食品質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，得到了很多食 品研究工作者的重視，形成了較完整的理論基礎(chǔ)。在一定的熱變性條件下，球狀蛋白質(zhì) 可以發(fā)生熱變性進(jìn)一步聚集形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通常這種交聯(lián)是不可逆的。對于球狀蛋 白而言，當(dāng)溶液的溫度升高到蛋白質(zhì)變性的溫度以上時，天然態(tài)的球狀蛋白的三級結(jié)構(gòu) 遭到一定程度的破壞，疏水基團(tuán)被暴露到分子的表面，使蛋白分子之間的疏水相互作用 增強(qiáng)而發(fā)生聚集，此時伴隨著二硫鍵的形成、二硫鍵的交換反應(yīng)以及氫鍵的破壞。球狀 蛋白質(zhì)與明膠發(fā)生分子間的相互作用形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，加熱時聚電解質(zhì)復(fù)合物進(jìn)一步聚集形成不可逆的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Maillard反應(yīng)是食品加工和儲藏過程中氨基化合物(氨基酸、多肽和蛋白質(zhì))和 羰基化合物(還原糖類)之間自然發(fā)生的反應(yīng)。關(guān)于蛋白質(zhì)和多糖之間的Maillard反應(yīng)國 際上已有很成熟的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，Maillard反應(yīng)一般在干熱條件下進(jìn)行，不添加其 他化學(xué)試劑，條件溫和，對人體安全無毒。已有文獻(xiàn)報道明膠與單糖或低聚糖的Maillard 反應(yīng)可以改善明膠的凝膠性能，但到目前為止還未見明膠與多糖的Maillard反應(yīng)研究報 道。通過Maillard反應(yīng)制備明膠-多糖共價結(jié)合物，并進(jìn)一步制備多糖修飾明膠納米粒 子的研究也未有研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種具有明膠核_多糖殼結(jié)構(gòu)的納米粒子。本發(fā)明的目的之二是提供一種簡單、高效、安全、穩(wěn)定的多糖修飾的明膠納米 粒子制備方法。本發(fā)明目的之三是提供上述多糖修飾的明膠納米粒子的應(yīng)用方法。一種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子是以明膠為核、多糖為殼的具有交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié) 構(gòu)的單分散的納米粒子。所述的明膠為堿法明膠或酸法明膠，所述的多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、普 魯蘭多糖、麥芽糊精或者其他不帶電荷的具有還原性羥基的水溶性多糖及它們的衍生 物；所述的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)劑為白蛋白、溶菌酶、乳球蛋白、α-乳清蛋白或 者其他具有加熱凝膠性質(zhì)的球狀蛋白質(zhì)。一種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子的制備方法包括以明膠、多糖為原料，利 用Maillard反應(yīng)制備明膠-多糖共價結(jié)合物；然后在加熱條件下，通過交聯(lián)劑使明膠-多 糖共價結(jié)合物形成納米粒子。所述的明膠為堿法明膠或酸法明膠，所述的多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、普 魯蘭多糖或者不帶電荷的具有還原性羥基的水溶性多糖或者它們的衍生物；所述的交聯(lián) 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)劑為白蛋白、溶菌酶或者具有加熱凝膠性質(zhì)的球狀蛋白質(zhì)。所述的多糖的分子量在Ik IOOk之間。所述的明膠與多糖的質(zhì)量比值在1 50-50 1;優(yōu)選1 10-10 1之間。所述的形成明膠-多糖共價結(jié)合物的Maillard反應(yīng)條件是(1)反應(yīng)溫度是40 100°C ；優(yōu)選60°C ；(2)反應(yīng)時間是30min 300h ；優(yōu)選24°C ；(3)反應(yīng)pH是4 11 ；優(yōu)選7 ；(4)反應(yīng)在固相或者液相進(jìn)行。所述的交聯(lián)劑濃度為0.01% 10% ；交聯(lián)劑與明膠的質(zhì)量比為1 10 10 1。所述的多糖修飾明膠納米粒子可用于包埋藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、染料或香料。其通 過直接混合和調(diào)節(jié)pH的方法將藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、染料或香料包裹到納米粒子中。本發(fā)明用天然來源的明膠、多糖、球狀蛋白為原料，不使用有機(jī)溶劑，通過兩 步加熱反應(yīng)制備穩(wěn)定的納米凝膠。
本發(fā)明的第一步，通過Maillard反應(yīng)將多糖共價偶聯(lián)到明膠上，形成明膠-多糖 共價復(fù)合物。Maillard反應(yīng)溫度在40 100°C范圍，反應(yīng)時間在30min 300h，反應(yīng)pH 為4 11，反應(yīng)在固相或者液相中進(jìn)行。一般而言，當(dāng)反應(yīng)在較高溫度進(jìn)行時，所需時 間大大縮短；當(dāng)反應(yīng)在較高pH進(jìn)行時，所需時間大大縮短。優(yōu)化的Maillard反應(yīng)條件 使制備成本降低，本發(fā)明Maillard反應(yīng)通常在60°C，反應(yīng)pH為7，反應(yīng)時間為24h下進(jìn) 行。上述反應(yīng)條件溫和易控，反應(yīng)產(chǎn)物一般不表現(xiàn)明顯的褐色反應(yīng)，水溶性好。另外，通過控制多糖、明膠的投料比以及多糖鏈長，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-多糖共 價復(fù)合物中多糖的含量。明膠與多糖的投料摩爾比在1 50到50 1之間，優(yōu)選1 10 到10 1之間，多糖分子量在Ik到IOOk之間所制備的蛋白質(zhì)-多糖共價復(fù)合物可以形成 納米粒子。本發(fā)明的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物不需要進(jìn)一步分離，可以直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。本發(fā)明的第二步，將第一步制備得到的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物加水溶解后，然后加入 用作交聯(lián)劑的球狀蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值到一定范圍，明膠和球狀蛋白存在 分子間作用力而傾向于相互聚集，此時將混合溶液進(jìn)行加熱。在加熱條件下蛋白質(zhì)發(fā)生 充分變性，生成由分子間的疏水聚集、氫鍵和二硫鍵形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即可得到具 有交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米粒子。該納米粒子具有以蛋白質(zhì)為核(主要成分為明膠)、多糖為 殼的結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)分子主要位于納米粒子的內(nèi)部，而親水性的多糖位于納米粒子的外 部，起著穩(wěn)定界面的作用。本發(fā)明中，多糖為含有還原性端羥基的水溶性多糖，可以是直鏈型多糖和支鏈 型多糖，例如葡聚糖和半乳甘露聚糖。交聯(lián)蛋白質(zhì)為球形蛋白質(zhì)，且具備通過加熱其水 溶液可形成宏觀不可逆凝膠的性質(zhì)，如白蛋白、溶菌酶等。在第二步反應(yīng)中，加熱溫度 和加熱時間的選擇標(biāo)準(zhǔn)是使溶液中的蛋白質(zhì)可以充分變性；加熱時的pH值控制在蛋白質(zhì) 的等電點(diǎn)士3范圍之內(nèi)可以得到穩(wěn)定的納米凝膠；通過控制溶液pH值和蛋白質(zhì)濃度可以 調(diào)節(jié)納米凝膠的尺寸在50 IOOOnm之間變化。利用本發(fā)明獲得的納米粒子，具有很好的單分散性，用動態(tài)光散射測定流體力 學(xué)直徑大約在50 IOOOnm之間(圖1)。所制備的納米粒子可以在水溶液中長期保存， 還可以經(jīng)過冷凍干燥后得到粉末進(jìn)行保存，這種粉末可以重新分散到水溶液中并且保持 原有的粒徑和粒徑分布(圖1)。所制備的納米粒子在水溶液中存放120天以后，其粒徑 分布幾乎沒有變化。通過原子力顯微鏡觀察得到表面光滑的近似球形的納米粒子，粒徑 范圍在50 500nm(圖2)。利用本發(fā)明方法可以得到明膠濃度為10%或者更高的納米粒子水溶液，納米粒 子產(chǎn)率高，產(chǎn)物不需要分離，可以直接進(jìn)行下一步負(fù)載藥物等。明膠分子鏈中含多種疏水和帶電荷氨基酸殘基，可以與多種藥物存在非共價鍵 相互作用力，通過控制溶液條件(比如溶液pH值、溫度、離子強(qiáng)度)即可負(fù)載帶電荷和 疏水性的小分子物質(zhì)如藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、染料、香料等；還可以通過透析擴(kuò)散或者在形 成凝膠的過程中通過直接混合的方法將小分子負(fù)載到納米粒子中。所制備的藥物載體適 合多種給藥途徑，如注射、粘膜、口服給藥。本發(fā)明方法中，與以往的技術(shù)相比，本發(fā)明制備了一種穩(wěn)定的多糖修飾的明膠 納米粒子，這種納米粒子原料來源廣泛，整個制備過程都符合綠色化學(xué)條件，避免使用 對人體有害的化學(xué)試劑，比如戊二醛等，具有更高的安全性，制備工藝簡單易行。親水性的葡聚糖可以提高明膠納米粒子的pH穩(wěn)定性以及生理離子強(qiáng)度下的溶液穩(wěn)定性，賦予 明膠納米粒子作為藥物載體的長循環(huán)性質(zhì)。


圖1為本發(fā)明明膠_葡聚糖納米粒子凍干前后的粒徑分布圖。圖2為本發(fā)明明膠-葡聚糖納米粒子的原子力顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限定。實(shí)施例1.葡聚糖修飾堿法明膠納米粒子葡聚糖修飾堿法明膠納米粒子的制備方法分為兩步進(jìn)行。第一步，將堿法明膠 溶解在去離子水中，配成20mg · mL—1的堿法明膠溶液。加入分子量為62k的葡聚糖到 上述溶液中配制多糖與堿法明膠的混合溶液，并使堿法明膠葡聚糖為1 1(質(zhì)量比)， 攪拌混合溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到8，然后將混合溶液冷凍干燥。將冷凍干燥的固體 放在裝有KBr飽和溶液的密閉容器中(相對濕度為79% )，置于60°C下進(jìn)行Maillard反 應(yīng)24h。將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水溶解，配成堿法明膠-葡聚糖共價復(fù)合物溶液， 使得共價復(fù)合物中堿法明膠濃度為20mg · mL1.第二步，往堿法明膠-葡聚糖共價復(fù) 合物溶液中加入一定量溶菌酶，再加入一定量水，使得堿法明膠濃度、溶菌酶濃度均為 l.Omg · InL10然后用O.lmol · L—1的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10左右，再將溶液 置于80°C的水浴中加熱0.5h，冷卻后即可得到多分散性指數(shù)在0.10左右、粒徑為200nm 穩(wěn)定的納米粒子。圖1為動態(tài)激光光散射測量得到納米粒子的粒徑分布圖平均流體力 學(xué)直徑為200nm，多分散性指數(shù)為0.10。該納米粒子溶液穩(wěn)定性高，在4°C的冰箱內(nèi)存 放3個月無沉淀聚集現(xiàn)象發(fā)生。將上述納米粒子溶液冷凍干燥，然后將所得到的固體粉 末在去離子水中重新溶解，可得到穩(wěn)定的納米粒子溶液，粒徑分布變化不大(圖1)。在不同溶菌酶濃度下進(jìn)行加熱交聯(lián)制備得到葡聚糖修飾堿法明膠納米粒子的光 散射分析結(jié)果如表ι所示，均可得到粒徑在200nm以下的納米粒子。表 1
6溶菌酶濃度光散射分析結(jié)果
(mg-mL-1)粒徑(rnn)多分散性指數(shù)
0.101560.15 0.1251640.11
0.251470.15
0.51480.13
1.02000.10選用牛血清白蛋白為蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，制備得到的葡聚糖修飾堿法明膠納米粒子 (葡聚糖分子量62k，堿法明膠葡聚糖為1 1(質(zhì)量比)，堿法明膠和牛血清白蛋白濃 度均為l.Omg · mL—1;加熱交聯(lián)溫度為80°C，pH為6.0，時間為Ih)亦可得到穩(wěn)定的納 米粒子溶液。用動態(tài)激光光散射測量所得到的納米粒子溶液粒徑為llOnm，多分散性 指數(shù)為0.14。實(shí)施例2.葡聚糖修飾酸法明膠納米粒子酸法明膠和葡聚糖進(jìn)行Maillard反應(yīng)合成酸法明膠-葡聚糖共價復(fù)合物， Maillard反應(yīng)條件同實(shí)施例1。葡聚糖修飾酸法明膠納米粒子的制備方法分為兩步進(jìn)行。 第一步，配制20mg · mL—1的酸法明膠水溶液。分別加入分子量為10k，35k，62k的葡 聚糖到上述溶液中配制不同分子量的多糖與酸法明膠的混合溶液，并使酸法明膠葡聚 糖為1 4 4 1(質(zhì)量比)，攪拌混合溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到8，然后將混合溶液 冷凍干燥。將冷凍干燥的固體放在裝有K&"飽和溶液的密閉容器中(相對濕度為79%)， 置于60°C下進(jìn)行Maillard反應(yīng)24h。將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水溶解，配成酸法明 膠-葡聚糖共價復(fù)合物溶液，使得共價復(fù)合物中酸法明膠濃度為20mg mL—1。第二步， 往酸法明膠-葡聚糖共價復(fù)合物溶液中加入一定量溶菌酶，再加入一定量水，使得酸法 明膠濃度、溶菌酶濃度均為l.Omg · InL10然后用O.lmol · L1的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液 的pH值至10左右，再將溶液置于80°C的水浴中加熱0.5h，冷卻后即可得到穩(wěn)定的葡聚 糖修飾酸法明膠納米粒子。在不同pH條件下制備得到葡聚糖修飾酸法明膠納米粒子的光散射分析結(jié)果，具 體結(jié)果如表2所示，納米粒子的多分散性指數(shù)在0.2左右、粒徑在100 300nm的范圍。 采用不同分子量的葡聚糖和不同的葡聚糖與酸法明膠的質(zhì)量投料比WR(明膠/葡聚糖) 在上述條件所得到的納米粒子，具體結(jié)果如表3所示，納米粒子的多分散性指數(shù)在0.3左 右、粒徑為100 200nm。表2在不同pH條件下制備得到葡聚糖修飾酸法明膠納米粒子的光散射分析 結(jié)果(葡聚糖分子量62k，酸法明膠葡聚糖為1 1(質(zhì)量比)，酸法明膠的濃度為
7l.Omg · mL1,溶菌酶的濃度為l.Omg · mL_1)
表 2
光散射分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子，其特征在于，它是以明膠為核、多糖為殼的 具有交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的單分散的納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖修飾明膠納米粒子，其特征在于，所述的明膠為堿法 明膠或酸法明膠，所述的多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、普魯蘭多糖或者不帶電荷的具 有還原性羥基的水溶性多糖或者它們的衍生物；所述的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)劑為白蛋 白、溶菌酶或者具有加熱凝膠性質(zhì)的球狀蛋白質(zhì)。
3.—種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子的制備方法，其特征在于包括以明膠、多糖 為原料，利用Maillard反應(yīng)制備明膠-多糖共價結(jié)合物；然后在加熱條件下，通過交聯(lián)劑 使明膠_多糖共價結(jié)合物形成納米粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的明膠為堿法明膠或酸法明 膠，所述的多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、普魯蘭多糖或者不帶電荷的具有還原性羥基 的水溶性多糖或者它們的衍生物；所述的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)劑為白蛋白、溶菌酶或 者具有加熱凝膠性質(zhì)的球狀蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述的多糖的分子量在Ik IOOk之間；所述的明膠與多糖的質(zhì)量比值在1 50-50 1之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的明膠與多糖的質(zhì)量比值在 1 10-10 1 之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的形成明膠-多糖共價結(jié)合物 的Maillard反應(yīng)條件是(1)反應(yīng)溫度是40 100°C；(2)反應(yīng)時間是3min 300h；(3)反應(yīng)pH是4 11；(4)反應(yīng)在固相或者液相進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的形成明膠-多糖共價結(jié)合物 的Maillard反應(yīng)條件是(1)反應(yīng)溫度是60°C；(2)反應(yīng)時間是24h;(3)反應(yīng)pH是7；(4)反應(yīng)在固相或者液相進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為 0.01% 10%;交聯(lián)劑與明膠的質(zhì)量比為1 10 10 1。
10.權(quán)利要求1或2所述的多糖修飾明膠納米粒子可用于包埋藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、染料 或香料。
全文摘要
本發(fā)明屬于高分子化學(xué)，藥物制劑技術(shù)和食品化學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一種穩(wěn)定的多糖修飾明膠納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。該納米粒子是以明膠為核，多糖為殼的具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的納米粒子。該納米粒子制備方法主要包括明膠與多糖的Maillard反應(yīng)、球狀蛋白質(zhì)的加熱交聯(lián)等。該納米粒子適合作為小分子物質(zhì)載體，即通過混合擴(kuò)散的方法將藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、香料和染料等負(fù)載到納米粒子中，從而得到負(fù)載藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、香料和染料等物質(zhì)的納米粒子。
文檔編號C08L5/00GK102010513SQ20101050442
公開日2011年4月13日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者劉又年, 劉金鳳, 周輝輝, 周飛艨, 張佩, 李娟 , 林慶斌 申請人:中南大學(xué)