專利名稱：水溶性自組裝殼聚糖納米顆粒的制備方法和該殼聚糖納米顆粒的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水溶性自組裝殼聚糖納米顆粒的制備方法和該殼聚糖納米顆粒
的應(yīng)用，具體地，涉及一種水溶性o-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法及其制得的
納米顆粒在制備水溶性自組裝Trolox-殼聚糖納米顆粒上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
殼聚糖[e-(l-4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖]是生物界中唯一存在的陽性氨 基多糖，它是由甲殼素在堿性條件下水解脫乙?；玫降?。殼聚糖分子上存在著大量的游 離氨基和羥基，因此它不但具有良好的保濕性和增濕性，而且還可以通過對其進行功能化 修飾，拓展殼聚糖的應(yīng)用范圍；此外，它還具有無生物毒性、良好的成膜性、可生物降解性和 較好的生物相容性等優(yōu)點，因此近年來殼聚糖在保健食品、食品保鮮、化妝品、生物醫(yī)藥、植 物病害的防治等領(lǐng)域顯示了其獨特的應(yīng)用價值。 但是，大分子量的殼聚糖水溶性差，這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。目前高水溶 性殼聚糖的制備途徑主要是通過降解的方法得到低分子量的殼聚糖，然后對其進行化學(xué)修 飾，從而提高殼聚糖的水溶性；其中，氧化降解法是目前應(yīng)用比較多的一種方法。化學(xué)修飾 殼聚糖常用的試劑較多，本發(fā)明用到的環(huán)氧乙烷不但能夠顯著提高殼聚糖的水溶性，且修 飾后的產(chǎn)物無毒無害，適合進一步利用。 近幾年來，水溶性殼聚糖納米顆粒因具有良好的負載能力，被廣泛應(yīng)用于負載基 因、蛋白質(zhì)及藥物等生物活性物質(zhì)。但目前制備的殼聚糖納米顆粒粒徑大多在100nm以上， 而納米顆粒在生物體內(nèi)的吸收利用與其尺寸有一定關(guān)系，粒徑越小越能促進生物活性分子 的有效吸收。因此，制備小粒徑殼聚糖納米顆粒對基于殼聚糖納米顆粒載體的開發(fā)，提高 生物活性分子的利用度具有重要的意義。目前，制備殼聚糖納米顆粒的主要方法有共價 交聯(lián)法、沉淀析出法、自組裝法等；共價交聯(lián)法往往會影響到大分子的釋放，不利于殼聚糖 納米顆粒在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用；沉淀析出法為非均相反應(yīng)，制備條件苛刻。因此，本發(fā) 明采用自組裝法制備殼聚糖納米顆粒，由此得到的殼聚糖納米顆粒粒徑較小，范圍為20 80nm。 Trolox，又稱水溶性維生素E，是一種過氧化物自由基清除劑。由于其具有很好的 膜穿透能力，被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域的抗氧化研究。但Trolox在水溶液中的溶解度較低 (0. 5mg/ml)，通常需要二甲基亞砜或乙醇助溶，從而提高Trolox的工作濃度，但少量的二 甲基亞砜或乙醇不可避免會對細胞或生物體產(chǎn)生一定的毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種尺寸可控的、粒徑較小的水溶性0-羥乙基殼聚 糖納米顆粒的制備方法。 本發(fā)明的另一目的是將制備的水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖納米顆粒作為抗氧化劑
3Trolox載體，在不使用助溶劑的情況下，將Trolox包裹進入殼聚糖納米顆粒，從而增加 Trolox的溶解度，通過緩釋形式延長Trolox的釋放時間，實現(xiàn)RAW264. 7細胞對Trolox的 充分吸收和利用。 本發(fā)明提供的一種水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法，包括如 下步驟 (1)將氧化劑加入到pH值為1 4的殼聚糖酸性水溶液中，升溫至40 80°C ，攪 拌2 9h，；停止攪拌后，加氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至10 12，得低分子量 殼聚糖的堿性水溶液； (2)控溫4 5°C ;攪拌，將環(huán)氧乙烷分多次加入到低分子量殼聚糖的堿性水溶液
中，得水溶性o-羥乙基殼聚糖，其中，加入的總的環(huán)氧乙烷與低分子量殼聚糖的堿性水溶
液的體積比為1 : 8 12 ; (3)控溫40 8(TC;在水溶液中進行自組裝，攪拌40 120h后得水溶性0-羥乙 基殼聚糖自組裝納米顆粒溶液。 其中，步驟(1)中所述殼聚糖酸性水溶液中的酸可以為乙酸或鹽酸。 步驟(1)中所述殼聚糖酸性水溶液中的殼聚糖濃度較佳為5 20g/L。 步驟(1)中，所述氧化劑可以為高硼酸鈉或雙氧水，殼聚糖酸性水溶液中的殼聚
糖與加入的所述氧化劑的重量比12 30 : 1。較佳地，選用高硼酸鈉時，殼聚糖和高硼酸
鈉投料比為150 : 5 150 : 12 ;選用H202時，殼聚糖和H202投料比為30 : 1 15 : 1。 步驟(1) 、 (2)和(3)中攪拌速度可以為200 6000r/min。較佳為500 2000r/
miru 較佳地，步驟(1)和(3)中，反應(yīng)溫度控制在40 80°C ;步驟(2)中，加入環(huán)氧乙 烷時的溫度控制在O 10°C。 較佳地，步驟(1)中，將氧化劑加入到殼聚糖酸性水溶液中，升溫至55 65t:，攪 拌4 6h ;步驟(3)中，控溫55 65°C ;在水溶液中進行自組裝，攪拌65 80h。
本發(fā)明提供的一種水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的制備方法包括以下步驟
取適量上述任一種水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒溶液于透析袋內(nèi)透 析，除去其內(nèi)的氧化劑和鹽分；干燥得殼聚糖納米顆粒，然后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基匿EM溶解殼聚 糖納米顆粒；然后加入Trolox，在N2保護條件下，攪拌0. 25 5h，即得包裹有Trolox的水 溶性殼聚糖納米顆粒，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基匿EM與Trolox的體積質(zhì)量比為3 : 15 22ml/ mg。 較佳地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM中加入的殼聚糖納米顆粒與Trolox的重量比為 20 : 1 2.較佳地，加入Trolox前，以200 6000r/min攪拌溶解了殼聚糖納米顆粒的基礎(chǔ) 培養(yǎng)基DMEM，攪拌時間為4 10min。這樣，使之結(jié)構(gòu)松散或打開，從而使Trolox進入殼聚 糖納米顆粒。攪拌速度較佳為500 2000r/min。
本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)點 1.本發(fā)明水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒在高速攪拌條件下采用氧化 降解和環(huán)氧乙烷修飾的方法，自組裝成納米顆粒，在該反應(yīng)條件下制備的水溶性o-羥乙基 殼聚糖納米顆粒不但具有良好的水溶性，且保留了 -OH和_NH2活性位點，因此該納米顆?？蛇M一步被功能化修飾，有望在生物領(lǐng)域、食品抗氧化劑、醫(yī)藥載體及緩釋劑等領(lǐng)域得到應(yīng) 用。 2.本發(fā)明水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒粒徑較小，尺寸可控，控制方法 簡單易行。 3.本發(fā)明水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒具有良好的生物相容性；通過
對RAW264. 7細胞活力的檢測發(fā)現(xiàn)，殼聚糖納米顆粒不會產(chǎn)生細胞毒性。 4.本發(fā)明制得的水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒作為一種安全而有效的
藥物載體，可以增加藥物的溶解度，通過緩釋、控釋的形式增長藥物的作用時間，從而提高
藥物的生物利用度。


圖1為水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒與殼聚糖的IR光譜。
圖2為水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒與殼聚糖的力-NMR譜圖。
圖3為水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒透射電鏡照片。
圖4為水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的UV圖。
具體實施例方式
本發(fā)明使用氧化劑對殼聚糖進行氧化降解，得到低分子量的殼聚糖，再利用極性 親水基團羥乙基(環(huán)氧乙烷)修飾，獲得水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖；通過調(diào)整溶液濃度、攪拌 速度等因素，水溶性的低分子量殼聚糖經(jīng)自組裝得到尺寸可控的自組裝納米顆粒。
本發(fā)明采用MTT試驗測定了上述制備的水溶性殼聚糖納米顆粒的細胞毒性，其檢 測原理是黃色的四甲基偶氮唑鹽(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，MTT) 能被活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成藍紫色的甲臜顆粒，DMSO(二甲基亞砜)能溶 解該甲臜顆粒，用酶標儀檢測其在490nm處的吸光度值，吸光度值的大小與活細胞數(shù)量呈 正相關(guān)。而死細胞無此功能，故可用此方法間接反應(yīng)細胞的活力。 本發(fā)明制備的水溶性殼聚糖納米顆粒在生物應(yīng)用方面可作為一種性能穩(wěn)定、安全 而有效的藥物載體，使生物活性物質(zhì)避免受到氧化、酶降解和化學(xué)降解等多種因素的干擾， 通過緩釋、控釋的形式釋放藥物，從而提高生物活性分子的利用度。本發(fā)明選用在有氧、常 溫條件下容易被氧化的Trolox(又名水溶性維生素E)，用水溶性殼聚糖納米顆粒對其進 行包裹，以t-BOOH(叔丁基氫過氧化物)氧化損傷RAW264. 7細胞為試驗?zāi)Ｐ停瑴y定水溶性 Trolox-殼聚糖納米顆粒與同濃度的Trolox單體對細胞氧化應(yīng)激的保護效果。
制備水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的反應(yīng)方程式為
NaOH
O 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。 實施例一水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法 取1. 5g殼聚糖，溶于150ml、 pH值為2的乙酸水溶液，攪拌至完全溶解，殼聚糖乙
酸水溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶；加入高硼酸鈉O. 12g，控溫6(TC，高速攪拌，反應(yīng)5h后，加氫氧化
鈉溶液調(diào)整反應(yīng)體系pH值至11，控溫4 5t:，將10ml環(huán)氧乙烷分多次加入反應(yīng)體系，繼
續(xù)控溫60°C ， 1400r/min攪拌反應(yīng)70h，得20 40nm的高水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納
米顆粒。 實施例二水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法 取1. 5g殼聚糖，溶解于150ml、 pH值為2的乙酸水溶液，攪拌至完全溶解，殼聚糖
乙酸水溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶；加入過氧化氫O. lg，控溫6(TC，高速攪拌，反應(yīng)5h后，加氫氧
化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)體系pH值至10 12，控溫4 5t:，將10ml環(huán)氧乙烷分多次加入反應(yīng)
體系，繼續(xù)控溫60°C ， 1200 1500r/m攪拌反應(yīng)60 80h，得20 40nm的水溶性0-羥乙
基殼聚糖自組裝納米顆粒。 實施例三水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法 取3. 0g殼聚糖，溶解于150ml、 pH值為3的乙酸水溶液，攪拌至完全溶解，殼聚糖
乙酸水溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶；加入高硼酸鈉0. 2g，控溫60°C，高速攪拌，反應(yīng)5h后，加氫氧
化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)體系pH值至10 12，控溫4 5t:，將10ml環(huán)氧乙烷分多次加入反應(yīng)
體系，繼續(xù)控溫60°C ， 500 1000r/m攪拌反應(yīng)60 80h，得50 80nm的高水溶性0-羥乙
基殼聚糖自組裝納米顆粒。 實施例四水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法 取3. Og殼聚糖，溶解于150ml、 pH值為3的乙酸水溶液，攪拌至完全溶解，殼聚糖
乙酸水溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶；加入過氧化氫0. 2g，控溫60°C ，高速攪拌，反應(yīng)5h后，加氫氧
化鈉溶液調(diào)整反應(yīng)體系pH值至10 12，控溫4 5t:，將10ml環(huán)氧乙烷分多次加入反應(yīng)
體系，繼續(xù)控溫60°C ， 500 1000r/m攪拌反應(yīng)60 80h，得50 80nm的水溶性0-羥乙基
殼聚糖自組裝納米顆粒。 實施例五水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的制備方法 取20ml實施例一制備的一種高水溶性0_羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒溶液，于 透析袋內(nèi)，攪拌透析12h ;抽干水分；加入2. 5ml DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，加入15mg Trolox， 在N2保護條件下，1500r/min攪拌2h，即得水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒。
實施例二、三、四制得的水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒可以用實施例五 相同的方法制得水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的制備方法。 實施例六水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒對RAW264. 7細胞氧化應(yīng)激的保護作用
6[OO49]RAW264. 7細胞活力的檢測——MTT試驗 將密度為1.0Xl()S個/ml的RAW264. 7細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100ii1 ; 貼壁12h后，棄掉舊培養(yǎng)液，每孔加入lOOiU 5% DMEM完全培養(yǎng)基或含有4mM Trolox單 體、Trolox-殼聚糖納米顆粒的完全培養(yǎng)基；孵育4h后，對照組各孔加入26. 3 iil DMEM基 礎(chǔ)培養(yǎng)基，其余組各孔加入26. 3 iil腦t-B00H，使之終濃度為500 y M ;作用12小時后， 每孔加入20 ii 15mg/ml MTT溶液；孵育4h后，棄掉細胞培養(yǎng)液，每孔加入150 y 1匿SO溶解 甲臜顆粒；于搖床上振蕩10min后，用酶標儀測定各孔在490nm處的吸收值。
RAW264. 7細胞膜脂質(zhì)過氧化程度分析------MDA含量檢測 處理方法同MTT試驗。t-B00H作用12h后，于24孔板上每孔加入100 ii 1細胞裂
解液，裂解30min ;分別用BCA蛋白濃度測定試劑盒和微量MDA(丙二醛)測定試劑盒測定
各樣品的蛋白濃度和MDA濃度，據(jù)試劑盒上提供的公式，計算出各樣品的MDA含量。公式如
下
八^ 測定管OD532 —測定空白管OD532 .蛋白濃度
MDA含量(nM/mg" -X1 OnM +蟲n叫又
標準管OD532—標準空白管OD532 (mg /ml) 下面僅通過對實施例一制得的水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒和實施例
五制得的水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的測定結(jié)果，代表性的說明本發(fā)明的效果。 其中，下面表1、2和3的數(shù)據(jù)都是通過實施例六的方法測得的數(shù)據(jù)。 表1為水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒對細胞活力的影響。 表1水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒對細胞活力的影響
組別MTT reduction(%)對照100±0
殼聚糖納米顆粒96.85±6.85 表中，MTT reduction(% )代表噻唑藍還原法，其檢測原理為活細胞線粒體中的 琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細 胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在 490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。MTT reduCtion(%) 二A樣。。。/A對照。
結(jié)果顯示，該水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒具有良好的生物相容性，不 會產(chǎn)生細胞毒性。 表2為水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒對RAW264. 7細胞活力的保護效果 從表2可以看出，Trolox-殼聚糖納米顆粒與同濃度的Trolox單體相比，表現(xiàn)出
更好的保護RAW264. 7細胞氧化應(yīng)激的作用。 表2水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒對RAW264. 7細胞活力的保護效果 組別 MTT reduction(%)
對照 100±0
500uM t-BOOH 46.95±4.39
500uM t-BOOH + 4mM Trolox 卯.68士3.13
500uM t-BOOH +殼聚糖納米顆粒 45.95±6.52 500uM t-BOOH + 4mM Trolox-殼聚糖納米顆粒 107.7±4.76 **
7
注##與500uM t-BOOH組相比，P < 0. 01 **與500uM t-B00H+4mM Trolox組相比，P < 0. 01 由于Trolox+殼聚糖不僅能完全對抗過氧化物引起的氧化損傷，而且促進了細胞 的生長，所以表2中會有數(shù)值大于100%。 表3為水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒對RAW264. 7細胞膜脂質(zhì)過氧化程度的保 護效果 在Trolox濃度均為4mM的條件下，Trolox-殼聚糖納米顆粒與Trolox單體相比， 能夠顯著降低RAW264. 7細胞膜的脂質(zhì)過氧化程度。 表3水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒對RAW264. 7細胞膜脂質(zhì)過氧化程度的保護 效果
組別
MDA(nM/mg蛋白)
對照 5.14±0.18
500uM t-BOOH 16.85±1.45
500uM t-BOOH + 4mM Trolox 9.52±0.18
500uM t-BOOH +殼聚糖納米顆粒 13.35±0.28
500uM t-BOOH + 4mM Trolox-殼聚糖納米顆粒 ##4.21±0.14 ** 注##與500uM t-BOOH組相比，P < 0. 01 **與500uM t-B00H+4mM Trolox組相比，P < 0. 01 圖1為水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒(a)與殼聚糖(b)的IR光譜。
分別將殼聚糖和O-羥乙基殼聚糖固體粉末樣品通過KBr壓片法制得薄片，用傅立 葉變換紅外光譜儀(Bruker Tensor 27)測定其紅外光譜。 顯然，反應(yīng)前的殼聚糖具有2925cm—1處CH3的伸縮振動吸收峰和1380cm—1處CH3 彎曲振動吸收峰，此外還具有1644cm—1處的乙?；卣魑辗?，都說明反應(yīng)前的殼聚糖具 有甲酰基，脫乙酰度較低，這也與其1569cm—1 S (N-H)不明顯相吻合；反應(yīng)后的0-羥乙基 殼聚糖的紅外譜圖中2925cm—1處的CH3的伸縮振動吸收峰減弱，乙?；卣魑辗鍦p弱， S (N-H)峰變得明顯尖銳，且1380cm—工處-CH3彎曲振動吸收峰消失，都說明了，本發(fā)明的方
法制備o-羥乙基殼聚糖納米微粒采用的堿性介質(zhì)，有利于殼聚糖的進一步脫乙?；?，釋放
更多的NH3活性位點，這也與0-羥乙基殼聚糖紅外譜圖在3300cm—1處0_H的伸縮振動吸收
峰和N-H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰面積及形狀不變相吻合。 圖2為水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒(B)與殼聚糖(A)的力-NMR譜圖。
由圖2對比兩圖譜峰可以得知，水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米微粒在3. 8-4. 0ppm出
現(xiàn)了新峰，該峰應(yīng)為殼聚糖經(jīng)修飾后引入的_CH2的核磁峰。 圖3為水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒透射電鏡照片。 圖3為透射電鏡(hiticth H 800 TEM型)研究水溶性0_羥乙基殼聚糖自組裝納
米微粒的形態(tài)與粒徑。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法制備的水溶性o-羥乙基殼聚糖自組裝
納米微粒，粒徑在20-40nm，微粒具有疏松的結(jié)構(gòu)和較好的球形。
圖4為水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的UV圖。 以未包Trolox的殼聚糖納米顆粒溶液作對照，掃差譜。如圖4所示，在288nm處 有較高的Trolox吸收峰，說明Trolox已被包裹入殼聚糖納米顆粒。
8
權(quán)利要求
一種水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒的制備方法，包括如下步驟(1)將氧化劑加入到pH值為1～4殼聚糖酸性水溶液中，升溫至40～80℃，攪拌2～9h，；停止攪拌后，加氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至10～12，得低分子量殼聚糖的堿性水溶液；(2)控溫4～5℃；攪拌，將環(huán)氧乙烷分多次加入到低分子量殼聚糖的堿性水溶液中，得水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖，其中，加入的總的環(huán)氧乙烷與低分子量殼聚糖的堿性水溶液的體積比為1∶8～12；(3)控溫40～80℃；在水溶液中進行自組裝，攪拌40～120h后得水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述殼聚糖酸性水溶液 中的酸為乙酸或鹽酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述殼聚糖酸性水溶液中的殼聚糖濃度為5 20g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述氧化劑為高硼酸鈉或雙氧水，殼聚糖酸性水溶液中的殼聚糖與加入的所述氧化劑的重量比12 30 : 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1) 、 (2)和(3)中攪拌速度為200 6000r/min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)和(3)中，反應(yīng)溫度控制在 40 80°C ;步驟(2)中，加入環(huán)氧乙烷時的溫度控制在O l(TC。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中，將氧化劑加入到殼聚糖 酸性水溶液中，升溫至55 65t:，攪拌4 6h ;步驟(3)中，控溫55 65 °C ;在水溶液中 進行自組裝，攪拌65 80h。
8. —種水溶性Trolox-殼聚糖納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 取適量權(quán)利要求1 7中任一項所述的水溶性0-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒溶液于透析袋內(nèi)透析，除去其內(nèi)的氧化劑和鹽分；干燥得殼聚糖納米顆粒，然后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基 DMEM溶解殼聚糖納米顆粒；然后加入Trolox，在N2保護條件下，攪拌0. 25 5h，即得包 裹有Trolox的水溶性殼聚糖納米顆粒，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM與Trolox的體積質(zhì)量比為 3 : 15 22ml/mg。
9. 根據(jù)權(quán)利要求書8所述的制備方法，其特征在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基匿EM中加入的殼聚糖 納米顆粒與Trolox的重量比為20 : 1 2。
10. 根據(jù)權(quán)利要求書8所述的制備方法，其特征在于加入Trolox前，以200 6000r/ min攪拌溶解了殼聚糖納米顆粒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM，攪拌時間為4 10min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種粒徑較小的水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖納米顆粒的制備方法，包括以下步驟(1)將氧化劑加入到pH值為1～4的殼聚糖酸性水溶液中，升溫至40～80℃，攪拌2～9h，；停止攪拌后，加氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至10～12，得低分子量殼聚糖的堿性水溶液；(2)控溫4～5℃；攪拌，將環(huán)氧乙烷分多次加入到低分子量殼聚糖的堿性水溶液中，得水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖，其中，加入的總的環(huán)氧乙烷與低分子量殼聚糖的堿性水溶液的體積比為1∶8～12；(3)控溫40～80℃；在水溶液中進行自組裝，攪拌40～120h后得水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖自組裝納米顆粒溶液。本發(fā)明制備的水溶性O(shè)-羥乙基殼聚糖納米顆粒可以作為抗氧化劑Trolox載體，在不使用助溶劑的情況下，增加Trolox的溶解度。
文檔編號C08J3/12GK101696278SQ200910236588
公開日2010年4月21日 申請日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者劉揚, 杜立波, 王廣清, 田秋, 韓璐 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所;