專利名稱：pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種生物可降解的pH/溫度雙重響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物及其制備方法。
背景技術(shù)：
雙親水性嵌段共聚物(DHBCs)是一類新型的兩親性聚合物，包含兩個(gè)具有不同化學(xué)性質(zhì)的水溶性鏈段。在溶液中，DHBCs分別表現(xiàn)為普通的聚合物和聚電解質(zhì)，根本沒有表現(xiàn)出兩親性聚合物的性質(zhì)。但是，溫度、離子強(qiáng)度和pH值的變化以及絡(luò)合作用可以導(dǎo)致其中一個(gè)親水鏈段轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷湺危瑥亩D(zhuǎn)變?yōu)閮捎H性聚合物。這類新型的嵌段聚合物可以根據(jù)特定的用途設(shè)計(jì)合成，使之有可能在眾多領(lǐng)域得到應(yīng)用，例如藥物輸送、基因治療、活性酶的包埋、礦化模板和結(jié)晶生長調(diào)節(jié)劑、合成金屬溶膠的納米反應(yīng)器、脫鹽膜以及兩種互不相溶的聚合物的水包油乳液聚合，等等。
結(jié)構(gòu)精致的雙親水性嵌段共聚物可以通過各種活性聚合方法合成。其中包括活性陰離子聚合、活性陽離子聚合、基團(tuán)轉(zhuǎn)移自由基聚合(GTP)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)、氮氧穩(wěn)定自由基聚合(NMP)、可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)以及氧陰離子引發(fā)的聚合。
當(dāng)DHBCs含有一個(gè)具有低臨界共溶溫度(LCST)的鏈段時(shí)，改變水溶液的溫度，共聚物形成可逆膠束。由于臨界溫度高于室溫，這類聚合物在加熱時(shí)變得不溶解。這些聚合物包括聚甲基乙烯基醚(PMVE)、聚N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯(PDMAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯(PDEAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二異丙基氨基)乙酯(PDPAEMA)和聚甲基丙烯酸-2-(N-嗎啉)乙酯(PMEMA)等等。(Bütün V.；Armes S.P.；Billingham N.C..Synthesis andaqueous solution properties of near-monodisperse tertiary aminemethacrylate homopolymers and diblock copolymers.Polymer，2001，425993-6008.) 由酸性與堿性的鏈段組成的DHBCs中，改變?nèi)芤旱膒H值，當(dāng)酸性的鏈段完全質(zhì)子化，同時(shí)堿性的鏈段完全脫質(zhì)子時(shí)形成膠束。此時(shí)酸性的鏈段親水而堿性的鏈段疏水。這類共聚物由非離子和離子鏈段、或具有不同pKa的酸性和堿性的鏈段組成。
現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于pH響應(yīng)性或溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物主要有 (1)聚環(huán)氧乙烷和聚-2-乙烯基吡啶嵌段共聚物(PEO-b-P2VP)(參見Martin T.J.；Procházka K.；Munk P.；Webber S.E..pH-Dependentmicellization of poly(2-vinylpyridine)-block-poly(ethylene oxide).Macromolecules，1996，296071-6073)； (2)PDMAEMA-b-PDEAEMA嵌段共聚物(參見Bütün V.；Bennett C.E.；Vamvakaki M.；Lowe A.B.；Billingham N.C.；Armes S.P..Selectivebetainisation of tertiary amine methacrylate block copolymers.J.Mater.Chem.，1997，71693-1695.；Webber G.B.；Wanless E.J.；Bütün V.；ArmesS.P.；Biggs S..Self-organized monolayer films of stimulus-responsivemicelles.Nano Lett.，2002，21307-1313.)； (3)PEO-b-PDEAEMA嵌段共聚物(參見Lee A.S.；Bütün V.；VamvakakiM.；Armes S.P.；Pople J.A.；Gast A.P..Structure of pH-dependent blockcopolymer micellesCharge and ionic strength dependence.Macromolecules，2002，358540-8551.)； (4)聚-4-乙烯基苯甲酸鈉(PNaVBA)和聚甲基丙烯酸低聚環(huán)氧乙烷酯(POEGMA)的嵌段共聚物(參見Wang X.S.；Jackson R.A.；Armes S.P..Facile synthesis of acidic copolymers via atom transfer radicalpolymerization in aqueous media at ambient temperature.Macromolecules，2000，33255-257.)； (5)聚環(huán)氧乙烷和聚甲基丙烯酸羥基乙酯形成的嵌段共聚物(PEO-b-PHEMA)以及進(jìn)一步與丁二酸酐的反應(yīng)產(chǎn)物(PEO-b-PSEMA)，形成pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物(參見Bories-Azeau X.；Mérian T.；Weaver J.V.M.；Armes S.P.；van den Haak H.J.W..Synthesis ofnear-monodisperse acidic homopolymers and block copolymers fromhydroxylated methacrylic copolymers using succinic anhydride under mildconditions.Macromolecules，2004，378903-8910.)； (6)4-乙烯基苯甲酸與DEAEMA形成的嵌段共聚物(PVBA-b-PDEAEMA)(參見Liu S.Y.；Armes S.P..Polymeric surfactants for the new millenniumA pH-responsive，zwitterionic，schizophrenic diblock copolymer.Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41(8)1413-1416.)； (7)甲基丙烯酸(MAA)與DEAEMA 形成的嵌段共聚物(PMAA-b-PDEAEMA)(參見Dai S.；Ravi P.；Tam K.C.；Mao B.W.；GanL.H..Novel pH-responsive amphiphilic diblock copolymers with reversiblemicellization properties.Langmuir，2003，195175-5177.)； (8)2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸膽堿(MPC)與DMAEMA、DEAEMA、DPAEMA等單體形成的具有pH響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物PMPC-b-PDMAEMA、PMPC-b-PDEAEMA、PMPC-b-PDPAEMA。(參見Ma Y.；Tang Y.Q.；Billingham N.C.；Armes S.P.；Lewis A.L.；Lloyd A.W.Salvage J.P..Well-defined biocompatible block copolymers via atom transferradical polymerization of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine inprotic media.Macromolecules，2003，363475-3484.)； 近年來的研究表明，聚磷酸酯(polyphosphoesters)是一類具有優(yōu)異生物降解性能的聚合物，由于其主鏈上含有五價(jià)的磷原子，因此，相比于其它常用的生物可降解的聚酯，如聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)等，聚磷酸酯的側(cè)鏈更容易被功能化，可以修飾上很多功能基團(tuán)或是藥物分子，得到側(cè)鏈功能化的聚磷酸酯；此外，值得注意的是，聚乳酸、聚己內(nèi)酯等聚酯降解后有CO2生成，它們?nèi)苡谒畷?huì)使生物體內(nèi)局部的pH值降低，從而會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生一系列的副作用，而聚磷酸酯的降解產(chǎn)物不會(huì)產(chǎn)生這樣的副作用。
眾多的優(yōu)點(diǎn)使得聚磷酸酯的研究成為生物降解材料中的一個(gè)熱點(diǎn)，但直到最近，日本關(guān)西大學(xué)的Iwasaki教授課題組發(fā)表在Macromolecules 40，8136-8138(2007)上的文章才首次報(bào)道了聚磷酸酯的溫度敏感特性，并通過控制聚磷酸酯的側(cè)鏈官能團(tuán)及聚合物組成，可以很容易地調(diào)節(jié)聚磷酸酯的溫度響應(yīng)性質(zhì)，即低臨界溶解溫度(LCST)，且更為關(guān)鍵的是這種溫度敏感性質(zhì)是可逆的。該文的報(bào)道表明，聚磷酸酯有望成為丙烯酰胺類聚合物的替代物，在智能型生物醫(yī)用材料領(lǐng)域?qū)⒋笥凶鳛椤?br>
目前，已有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)報(bào)道了聚磷酸酯嵌段聚合物的合成及應(yīng)用，例如Iwasaki，Y.；Akiyoshi，K.等人發(fā)表在Biomacromolecules 71433-1438(2006)的文章，Wen，J.；Kim，G.J.A.；Leong，K.W.等人發(fā)表在Journal ofControlled Release 9239-48(2003)的文章，Chen，D.P.；Wang，J.等人發(fā)表在Macromolecules 39473-475(2006)上的文章，Yuan，Y.Y.；Wang，Y.C.；Du，J.Z.；Wang，J.等人發(fā)表在Macromolecules 418620-8625(2008)的文章。然而，文獻(xiàn)中已報(bào)道的嵌段共聚物均是兩親性的(既包含親水鏈段，也包含疏水鏈段)。
王均等人申請(qǐng)的中國發(fā)明專利，即申請(qǐng)?zhí)枮?00710198478.X的中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開文件，公開了一種聚磷酸酯與聚己內(nèi)酯形成的三嵌段共聚物及其納米粒子。本發(fā)明人之前申請(qǐng)的中國專利也公開了制備溫度/pH響應(yīng)性聚磷酸酯水凝膠的方法，即申請(qǐng)?zhí)枮?00810022216.2的中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開文件，公開了一種生物可降解的溫度/pH雙重響應(yīng)性水凝膠及其制備方法，采用開環(huán)聚合制備聚磷酸酯分子鏈雙末端帶功能基團(tuán)C＝C的大分子單體，作為交聯(lián)劑，與pH響應(yīng)性單體進(jìn)一步聚合，形成水凝膠。
據(jù)我們的調(diào)研所知，至今還沒有文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道基于可生物降解的聚磷酸酯與pH響應(yīng)性聚合物鏈接，形成pH/溫度響應(yīng)性聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種具有良好生物相容性和生物降解性的pH/溫度響應(yīng)性聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物及其制備方法。
本發(fā)明的總體構(gòu)思是首先以開環(huán)聚合反應(yīng)形成末端含功能基團(tuán)的聚磷酸酯鏈段，作為原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)體系的大分子引發(fā)劑，然后與水溶性單體發(fā)生ATRP聚合，獲得含聚磷酸酯鏈段和pH響應(yīng)的水溶性鏈段的嵌段共聚物；也可以利用大分子引發(fā)劑與水溶性單體的前體先聚合再進(jìn)一步水解或修飾，獲得含聚磷酸酯鏈段和pH響應(yīng)的水溶性鏈段的嵌段共聚物。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物，所述pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如通式(1)或通式(2)所示
式中，w為20～100，y為20～200，z為20～200；X為溴或氯； R1基團(tuán)選自乙基、異丙基、辛基、十二烷基或者聚環(huán)氧乙烷基中的一種；所述聚環(huán)氧乙烷基的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
其中n為2～10； R2基團(tuán)選自 氫(H)、
或
中的一種； R3基團(tuán)選自
或
中的一種； R4基團(tuán)選自
中的一種。
上述技術(shù)方案中，所述pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物的數(shù)均分子量范圍是2000～50000g·mol-1。
上述技術(shù)方案中，所述pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物在結(jié)構(gòu)上含聚磷酸酯鏈段和聚離子電解質(zhì)鏈段，因此具有pH和溫度雙重響應(yīng)性，可作為基因輸送載體或藥物緩釋載體等生物材料；由聚磷酸酯鏈段與聚陰離子電解質(zhì)鏈段組成的雙親水性嵌段共聚物，可以作為藥物輸送載體、納米反應(yīng)器、乳化劑或生物礦化模板等使用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑的分子鏈一端含羥基，另一端含溴或氯取代基，所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
制備上述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑的方法包括以下步驟 (1)制備環(huán)狀含磷單體以R1-OH與
反應(yīng)合成具有R1側(cè)鏈取代基團(tuán)的環(huán)狀含磷單體
其中，R1基團(tuán)選自乙基、異丙基、辛基、十二烷基或者聚環(huán)氧乙烷基中的一種；所述聚環(huán)氧乙烷基的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
其中n為2～10； (2)制備聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑利用帶有端羥基功能基團(tuán)的含溴或氯有機(jī)化合物HO-R4-X，在催化劑辛酸亞錫的存在下對(duì)環(huán)狀含磷單體
進(jìn)行開環(huán)聚合，得到分子鏈末端含溴或氯取代基的聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑； 其中，HO-R4-X選自
中的一種；其中，X選自溴或氯。
利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑與pH敏感單體進(jìn)行ATRP反應(yīng)，或者與pH敏感單體的前體進(jìn)行ATRP反應(yīng)后進(jìn)一步水解或修飾，可以得到相應(yīng)的pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物。按照單體的不同可以分為以下三種情況 (1)當(dāng)以pH敏感單體為反應(yīng)物時(shí)，pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物的制備方法，包括以下具體步驟 利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下，與pH敏感的單體進(jìn)行溶液ATRP反應(yīng)，獲得pH/溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物。
上述技術(shù)方案中，所述pH敏感的單體為具有pH響應(yīng)性的水溶性單體，選自甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二異丙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N-叔丁基氨基)乙酯、2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶中的一種。
(2)當(dāng)以甲基丙烯酸叔丁酯或4-乙烯基苯甲酸叔丁酯為反應(yīng)物時(shí)，pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物的制備方法，包括以下具體步驟 利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下，與甲基丙烯酸叔丁酯或4-乙烯基苯甲酸叔丁酯單體進(jìn)行溶液ATRP反應(yīng)；聚合以后在二氯甲烷和三氟乙酸存在下水解，分別成為聚甲基丙烯酸、或聚4-乙烯基苯甲酸鏈段；獲得pH/溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物。
(3)當(dāng)以甲基丙烯酸-2-羥基乙酯為反應(yīng)物時(shí)，pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物的制備方法，包括以下具體步驟 利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下，與甲基丙烯酸-2-羥基乙酯單體進(jìn)行溶液ATRP反應(yīng)；聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯鏈段中側(cè)基的羥基再與丁二酸酐反應(yīng)，生成側(cè)鏈含羧基的聚合物鏈段，即可獲得pH/溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物。
上述三種情況中，單體[M]與ATRP引發(fā)劑[I]的摩爾比為[M]∶[I]＝10∶1～200∶1；ATRP引發(fā)劑[I]與催化劑[Cat]的摩爾比為[I]∶[Cat]＝0.5∶1～1∶2。
上述技術(shù)方案中，所述ATRP反應(yīng)催化劑選自氯化亞銅(CuCl)或溴化亞銅(CuBr)中的一種，用量為所用單體總質(zhì)量的1.0％～7.5％。
上述技術(shù)方案中，ATRP反應(yīng)的催化劑配體為含氮類有機(jī)化合物，例如聯(lián)吡啶(bpy)、五甲基三亞乙基三胺(PMDETA)、四甲基乙二胺(TMEDA)或六甲基三亞乙基四胺(HMETETA)中的一種。
上述技術(shù)方案中，聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯(PDMAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯(PDEAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二異丙基氨基)乙酯(PDPAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N-叔丁基氨基)乙酯(PtBAEMA)屬于陽離子型鏈段；而2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶屬陰離子型單體；甲基丙烯酸叔丁酯為甲基丙烯酸的單體前體，4-乙烯基苯甲酸丁酯為4-乙烯基苯甲酸的單體前體，對(duì)應(yīng)的聚合物鏈段屬聚陰離子電解質(zhì)；并且，上述聚合物鏈段具有良好生物相容性。
進(jìn)一步的技術(shù)方案中，反應(yīng)完成后進(jìn)行提純處理，所述提純處理包括以下步驟 (1)反應(yīng)完成后，加入四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋(四氫呋喃體積為反應(yīng)體系體積的4～10倍)，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使反應(yīng)終止； (2)待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽； (3)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將濃縮液滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物； (4)最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即所述pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物。
由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下特點(diǎn) 1.本發(fā)明采用了生物降解性能良好的溫敏性聚磷酸酯作為雙親水性嵌段共聚物的一部分，采用具有生物相容性和pH敏感性的化合物為單體，或采用聚合后經(jīng)水解反應(yīng)可形成pH敏感性聚合物鏈段的單體，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)，獲得雙親水性嵌段共聚物，同時(shí)具有pH/溫度雙重敏感性和生物可降解性。
2.本發(fā)明公開的pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物形成膠束的行為和作為基因載體的功能，可以通過控制聚磷酸酯鏈段與pH響應(yīng)性聚合物鏈段的比例來調(diào)節(jié)。
3.本發(fā)明公開的pH/溫度響應(yīng)性聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物，有優(yōu)異的溫度/pH雙重響應(yīng)性、生物相容性、生物可降解性，是一類新型的人工合成的高分子膠束材料，其在生物醫(yī)學(xué)和其它領(lǐng)域具有廣泛的用途，例如可以用作藥物緩釋載體或基因載體等生物醫(yī)用材料及納米反應(yīng)器、乳化劑或生物礦化模板等。
圖1為實(shí)施例一中開環(huán)聚合引發(fā)劑溴代異丁酸-2-羥基乙酯(HEBI)的核磁共振氫譜(1H NMR)譜圖，溶劑為氘代氯仿(CDCl3)； 圖2為實(shí)施例一中聚磷酸酯大分子引發(fā)劑PEEP25-Br的核磁共振氫譜(1HNMR)譜圖，溶劑為CDCl3； 圖3為實(shí)施例三中含聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25的核磁共振表征，其中(A)1H NMR譜圖、(B)13C NMR譜圖、(C)31P NMR譜圖，溶劑均為CDCl3； 圖4(A)為實(shí)施例一中聚磷酸酯大分子引發(fā)劑PEEP25-Br的紅外光譜譜圖； 圖4(B)為實(shí)施例三中PEEP21-b-PDMAEMA25嵌段共聚物的紅外光譜譜圖； 圖5為實(shí)施例三中雙親水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25在不同pH水溶液中自組裝的透射電鏡照片； 圖6為實(shí)施例三中雙親水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25水溶液透光率隨溫度的可逆變化曲線； 圖7為實(shí)施例中雙親水性嵌段共聚物用作DNA載體時(shí)的凝膠阻滯電泳測試結(jié)果(N/P＝6∶1)； 圖8(A)為實(shí)施例中裸質(zhì)粒DNA(Plasmid pUC 18 DNA)粒子透射電子顯微鏡(TEM)照片； 圖8(B)為實(shí)施例中PEEP-b-PDMAEMA/DNA復(fù)合物粒子的TEM照片，pH＝7.4。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明 具有各種分子量的聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物主要以下列方法合成首先以開環(huán)聚合反應(yīng)形成末端含功能基團(tuán)的聚磷酸酯鏈段，以此作為下一步原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)體系的大分子引發(fā)劑，然后與水溶性單體發(fā)生ATRP反應(yīng)，(也可以利用水溶性單體的前體，先聚合再經(jīng)聚合物水解反應(yīng))，獲得含聚磷酸酯鏈段和pH響應(yīng)的水溶性聚合物鏈段的雙親水性嵌段共聚物。
實(shí)施例一聚磷酸酯大分子引發(fā)劑PEEP25-Br的合成方法 (1)環(huán)狀磷酸酯單體2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(EEP)的制備 首先通過三氯化磷(PCl3)與乙二醇反應(yīng)合成2-氯-2-氧代-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(COP)，然后將COP與乙醇反應(yīng)，獲得2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(EEP)，具體的合成方法如下 在裝有磁力攪拌子，滴液漏斗，球型冷凝管，干燥管及尾氣處理裝置的100mL三頸燒瓶中，加入無水二氯甲烷(CH2Cl2，50mL)和新蒸PCl3(22mL，0.25mol)。室溫下攪拌，緩緩滴加乙二醇(14mL，0.25mol)，使回流緩和進(jìn)行。滴加結(jié)束后，停止攪拌。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分CH2Cl2。減壓蒸餾，在30℃/4mmHg條件下獲得無色液體產(chǎn)物2-氯-1，3，2-二氯磷雜環(huán)戊烷(CP，21g)。將產(chǎn)物溶解于苯(200mL)，通入氧氣反應(yīng)48小時(shí)，蒸餾出溶劑苯，再于減壓下(115℃/5mmHg)蒸餾出產(chǎn)物COP(19.6g)，產(chǎn)率79％。
在干燥的1000mL三口燒瓶中，依次加入乙醇(17.3mL，0.3mol)，三乙胺(31mL，0.3mol)和四氫呋喃(500mL)，將體系冷卻到-15℃，攪拌下用恒壓滴液漏斗緩慢加入COP(17.2g，0.154mol)的四氫呋喃溶液(將COP溶于100mL四氫呋喃)，反應(yīng)24小時(shí)。將白色三乙胺鹽酸鹽沉淀物過濾，用水泵抽除四氫呋喃溶劑，減壓蒸餾(130℃/5mmHg)得到產(chǎn)物EEP(15.8g)，產(chǎn)率68％。
(2)溴代異丁酸-2-羥基乙酯(HEBI)的合成。
將5gα-溴代異丁酰溴滴加到31g 乙二醇和2.19g三乙胺的混合液中。冰浴中反應(yīng)4小時(shí)。然后升溫到40℃，反應(yīng)5小時(shí)。停止反應(yīng)后把產(chǎn)物倒入500mL水中，用氯仿抽提3次。然后依次用5％鹽酸溶液，飽和NaHCO3溶液洗滌氯仿層。分液漏斗分液后，用MgSO4干燥。最后經(jīng)減壓蒸餾(70℃/4mmHg)得到產(chǎn)物HEBI(3.9g)，產(chǎn)率85％。產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜(1H NMR)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)，1H NMR譜圖見圖1。
(3)聚磷酸酯大分子引發(fā)劑PEEP25-Br的合成。
預(yù)先將反應(yīng)瓶和攪拌子放在120℃烘箱中至少干燥6h。取出后，用翻口橡皮塞塞緊，再用真空油泵邊抽真空邊充高純氬氣，反復(fù)幾次至反應(yīng)瓶冷卻。用干燥的注射器依次往瓶中注入2.98g單體EEP(19.6mmol)、0.14g引發(fā)劑HEBI(0.66mmol)和0.27g催化劑Sn(Oct)2(0.66mmol)，然后再抽真空并充放高純氬氣三次。最后將反應(yīng)瓶置于預(yù)先設(shè)置好溫度的45℃油浴中，反應(yīng)3h后，打開塞子，停止反應(yīng)。
將反應(yīng)粗產(chǎn)物在無水乙醚中沉淀，過濾，重復(fù)三次，用水泵抽干，再置于30℃真空烘箱中干燥24h，得到2.44g無色透明粘稠狀產(chǎn)物(PEEP-Br)，產(chǎn)率約82％，其分子鏈兩末端分別帶有溴原子(-Br)和羥基(-OH)，產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜(1H NMR)，紅外光譜(FT-IR)和凝膠滲透色譜(GPC)驗(yàn)證其聚合物結(jié)構(gòu)、分子量和分子量分布，聚合物PEEP25-Br的核磁共振譜圖見圖2，紅外光譜譜圖見圖4(A)。
實(shí)施例二聚磷酸酯大分子引發(fā)劑PEEP50-Br的合成方法 (1)環(huán)狀磷酸酯單體2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(EEP)的制備同實(shí)施例一。
(2)溴代異丁酸-2-羥基乙酯(HEBI)的合成同實(shí)施例一。
(3)聚磷酸酯大分子引發(fā)劑PEEP50-Br的合成。
預(yù)先將反應(yīng)瓶和攪拌子放在120℃烘箱中至少干燥6h。取出后，用翻口橡皮塞塞緊，再用真空油泵邊抽真空邊充高純氬氣，反復(fù)幾次至反應(yīng)瓶冷卻。用干燥的注射器依次往瓶中注入5.81g單體EEP(38.4mmol)、0.14g引發(fā)劑HEBI(0.66mmol)和0.54g催化劑Sn(Oct)2(1.32mmol)，然后再抽真空并充放高純氬氣三次。最后將反應(yīng)瓶置于預(yù)先設(shè)置好溫度的85℃油浴中，反應(yīng)10h后，打開塞子，停止反應(yīng)。
將反應(yīng)粗產(chǎn)物在無水乙醚中沉淀，過濾，重復(fù)三次，用水泵抽干，再置于30℃真空烘箱中干燥24h，得到5.0g無色透明粘稠狀產(chǎn)物(PEEP50-Br)，產(chǎn)率約86％，其分子鏈兩端分別帶有溴原子(-Br)和羥基(-OH)，產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜(1H NMR)、紅外光譜(FT-IR)和凝膠滲透色譜(GPC)驗(yàn)證其聚合物結(jié)構(gòu)、分子量和分子量分布，聚合物的核磁共振譜圖與圖2相似。紅外光譜譜圖與圖4(A)相似。
實(shí)施例三含聚磷酸酯的雙親水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25的合成方法。
(1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑(PEEP21-Br)的制備與提純同實(shí)施例一。
(2)將預(yù)先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反應(yīng)瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室溫。將干燥的0.55g引發(fā)劑PEEP21-Br(0.17mmol)和0.05g配體2，2′-聯(lián)吡啶(0.34mmol)加入支管瓶中，攪拌均勻，接著將0.76g親水性單體甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)(0.5mmol)用注射器加入到含有引發(fā)劑和配體的混合物中，攪拌溶解，抽真空，然后通入高純氬氣，反復(fù)三次。用注射器加入5mL的甲醇，抽真空，再?zèng)_入氬氣，攪拌溶解至溶液為透明。最后，將經(jīng)過純化處理的0.024g溴化亞銅(CuBr)(0.17mmol)加入到上述混合體系中，通入高純氬氣保護(hù)。升溫至45℃，并保持此溫度和攪拌速度，反應(yīng)2小時(shí)。
到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，加入50mL四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使反應(yīng)終止。待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將之滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物。最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即聚磷酸酯與親水性單體形成的雙親水性嵌段共聚物。
將上述中提純后的嵌段聚合物進(jìn)行核磁共振(NMR)、紅外光譜(FT-IR)、凝膠滲透色譜(GPC)分析，結(jié)果表明已成功合成雙親水性共聚物。共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25的核磁共振譜圖見圖3，紅外光譜譜圖見圖4(B)。
共聚物的水溶液性質(zhì)通過穩(wěn)態(tài)熒光探針法、透射電鏡(TEM)及紫外-可見分光光度法進(jìn)行表征。利用透射電鏡(TEM)觀察此聚合物在水溶液中的聚集形態(tài)。結(jié)果表明，該嵌段共聚物在不同pH水溶液中能形成不同的自組裝形態(tài)，表現(xiàn)出明顯的pH響應(yīng)性。透射電鏡照片見圖5。利用紫外-可見分光光度法觀察此聚合物溶液在不同溫度下的透光率。結(jié)果表明，該聚合物具有可調(diào)節(jié)的LCST(低臨界共溶溫度)，并且其溫度響應(yīng)性具有可逆性。溶液透光率隨溫度的可逆變化圖見圖6。
實(shí)施例四含聚磷酸酯的雙親水性嵌段共聚物PEEP50-b-PDMAEMA85的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑(PEEP50-Br)的制備與提純同實(shí)施例一。
(2)將預(yù)先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反應(yīng)瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室溫。將干燥的1.29g引發(fā)劑PEEP50-Br(0.17mmol)和0.1g配體2，2′-聯(lián)吡啶(0.68mmol)加入支管瓶中，攪拌均勻，接著將2.58g親水性單體甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)(16.42mmol)用注射器加入到含有引發(fā)劑和配體的混合物中，攪拌溶解，抽真空，然后通入高純氬氣，反復(fù)三次。用注射器加入10mL的甲醇，抽真空，再?zèng)_入氬氣，攪拌溶解至溶液為透明。最后，將經(jīng)過純化處理的0.048g溴化亞銅(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合體系中，通入高純氬氣保護(hù)。升溫至45℃，并保持此溫度和攪拌速度，反應(yīng)2小時(shí)。
到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，加入50mL四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使反應(yīng)終止。待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將之滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物。最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即聚磷酸酯與親水性單體形成的雙親水性嵌段共聚物。
聚合物的表征同實(shí)施例三。圖譜分別與圖3、圖4(B)、圖5、圖6相似。
實(shí)施例五含聚磷酸酯的雙親水性嵌段共聚物PEEP80-b-PDEAEMA80的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑(PEEP50-Br)的制備與提純同實(shí)施例一。
(2)將預(yù)先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反應(yīng)瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室溫。將干燥的2.06g引發(fā)劑PEEP80-Br(0.17mmol)和0.1g配體2，2′-聯(lián)吡啶(0.68mmol)加入支管瓶中，攪拌均勻，接著將3.15g親水性單體甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(DEAEMA)(17mmol)用注射器加入到含有引發(fā)劑和配體的混合物中，攪拌溶解，抽真空，然后通入高純氬氣，反復(fù)三次。用注射器加入15mL的甲醇，抽真空，再?zèng)_入氬氣，攪拌溶解至溶液為透明。最后，將經(jīng)過純化處理的0.028g溴化亞銅(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合體系中，通入高純氬氣保護(hù)。升溫至55℃，并保持此溫度和攪拌速度，反應(yīng)2小時(shí)。
到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，加入50mL四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使反應(yīng)終止。待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將之滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物。最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即聚磷酸酯與親水性單體形成的雙親水性嵌段共聚物。聚合物的表征同實(shí)施例三。
實(shí)施例六含聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物PEEP30-b-PDEAEMA50的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑(PEEP30-Br)的制備與提純同實(shí)施例一。
(2)將預(yù)先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反應(yīng)瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室溫。將干燥的0.77g引發(fā)劑PEEP30-Br(0.17mmol)和0.05g配體2，2′-聯(lián)吡啶(0.34mmol)加入支管瓶中，攪拌均勻，接著將1.83g親水性單體甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(DEAEMA)(9.88mmol)用注射器加入到含有引發(fā)劑和配體的混合物中，攪拌溶解，抽真空，然后通入高純氬氣，反復(fù)三次。用注射器加入20mL的甲醇，抽真空，再?zèng)_入氬氣，攪拌溶解直至混合物溶液為透明。最后，將經(jīng)過純化處理的0.048g溴化亞銅(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合體系中，通入高純氬氣保護(hù)。升溫至60℃，并保持在此溫度和攪拌速度，反應(yīng)2小時(shí)。
到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，加入50mL四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使反應(yīng)終止。待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將之滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物。最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即聚磷酸酯與親水性單體形成的雙親水性嵌段共聚物。
聚合物的表征同實(shí)施例3。
實(shí)施例七含聚磷酸酯雙親水性嵌段共聚物PEEP30-b-PMAA30的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑(PEEP30-Br)的制備與提純同實(shí)施例一。
(2)PEEP30-b-PtBMA30的制備與提純 將預(yù)先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反應(yīng)瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室溫。將干燥的0.77g引發(fā)劑PEEP30-Br(0.17mmol)和0.05g配體2，2′-聯(lián)吡啶(0.34mmol)加入支管瓶中，攪拌均勻，接著將0.81g單體甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)(5.67mmol)用注射器加入到含有引發(fā)劑和配體的混合物中，攪拌溶解，抽真空，然后通入高純氬氣，反復(fù)三次。用注射器加入15mL的無水四氫呋喃，抽真空，再?zèng)_入氬氣，攪拌溶解直至混合物溶液為透明。最后，將經(jīng)過純化處理的0.048g溴化亞銅(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合體系中，通入高純氬氣保護(hù)。升溫至45℃，并保持在此溫度和攪拌速度，反應(yīng)2小時(shí)。
到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，加入50mL四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使得反應(yīng)終止。待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將之滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物。最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即聚磷酸酯與甲基丙烯酸叔丁酯形成的嵌段共聚物PEEP30-b-PtBMA30。
(3)PEEP30-b-PMAA30的制備與提純 將2g PEEP30-b-PtBMA30(0.23mmol)溶解在20mL CH2Cl2溶液中，在0℃條件下，向溶液中緩慢滴加3.89g三氟乙酸(CF3COOH)(34mmol)，滴加完畢后，在室溫的條件下反應(yīng)過夜，使聚甲基丙烯酸叔丁酯鏈段水解為聚甲基丙烯酸鏈段。
反應(yīng)完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗產(chǎn)品用2mL二氯甲烷溶解，在冰的正己烷中沉淀，過濾，重復(fù)三次，用水泵抽干，再置于30℃真空烘箱中干燥24h，得到產(chǎn)物PEEP30-b-PMAA30。
通過上述方法制備的雙親水性嵌段共聚物可以用作基因載體或藥物緩釋載體等生物醫(yī)用材料，用作DNA載體時(shí)，凝膠阻滯電泳測試結(jié)果如圖7所示。通過透射電子顯微鏡分析，可以比較裸質(zhì)粒DNA(Plasmid pUC 18 DNA)粒子和用雙親水性嵌段共聚物PEEP-b-PDMAEMA復(fù)合以后的粒子的形態(tài)，如圖8所示。
權(quán)利要求
1.一種pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物，其特征在于，所述pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如通式(1)或通式(2)所示
式中，w為20～100，y為20～200，z為20～200；X為溴或氯；
R1基團(tuán)選自乙基、異丙基、辛基、十二烷基或者聚環(huán)氧乙烷基中的一種；所述聚環(huán)氧乙烷基的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
其中n為2～10；
R2基團(tuán)選自
氫(H)、
中的一種；
R3基團(tuán)選自
中的一種；
R4基團(tuán)選自
中的一種。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物，其特征在于，所述pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物的數(shù)均分子量范圍是2000～50000g·mol-1。
3.一種聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，其特征在于所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑的分子鏈一端含羥基，另一端含溴或氯取代基，所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
R1基團(tuán)選自乙基、異丙基、辛基、十二烷基或者聚環(huán)氧乙烷基中的一種；所述聚環(huán)氧乙烷基的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
其中n為2～10；
w為20～100；X為溴或氯。
4.權(quán)利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟
(1)制備環(huán)狀含磷單體以R1-OH與
反應(yīng)合成具有R1側(cè)鏈取代基團(tuán)的環(huán)狀含磷單體
其中，R1基團(tuán)選自乙基、異丙基、辛基、十二烷基或者聚環(huán)氧乙烷基中的一種；所述聚環(huán)氧乙烷基的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
其中n為2～10；
(2)制備聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑利用帶有端羥基功能基團(tuán)的含溴或氯有機(jī)化合物HO-R4-X，在催化劑辛酸亞錫的存在下對(duì)環(huán)狀含磷單體
進(jìn)行開環(huán)聚合，得到分子鏈末端含溴或氯取代基的聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑；
其中，HO-R4-X選自
中的一種；其中，X選自溴或氯。
5.權(quán)利要求1所述pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟
利用權(quán)利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下，與pH敏感的單體進(jìn)行溶液ATRP反應(yīng)，獲得pH/溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物；
所述pH敏感的單體為具有pH響應(yīng)性的水溶性單體，選自甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二異丙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N-叔丁基氨基)乙酯、2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶中的一種。
6.權(quán)利要求1所述pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟
利用權(quán)利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下，與甲基丙烯酸叔丁酯或4-乙烯基苯甲酸叔丁酯單體進(jìn)行溶液ATRP反應(yīng)；聚合以后在二氯甲烷和三氟乙酸存在下水解，分別成為聚甲基丙烯酸、或聚4-乙烯基苯甲酸鏈段；獲得pH/溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物。
7.權(quán)利要求1所述pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟
利用權(quán)利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引發(fā)劑，在ATRP催化劑和催化劑配體的存在下，與甲基丙烯酸-2-羥基乙酯單體進(jìn)行溶液ATRP反應(yīng)；再與丁二酸酐反應(yīng)，獲得側(cè)鏈含羧基的聚合物鏈段，獲得pH/溫度響應(yīng)性的雙親水性嵌段共聚物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的制備方法，其特征在于單體[M]與ATRP引發(fā)劑[I]的摩爾比為[M]∶[I]＝10∶1～200∶1；ATRP引發(fā)劑[I]與催化劑[Cat]的摩爾比為[I]∶[Cat]＝0.5∶1～1∶2；
所述ATRP催化劑選自氯化亞銅或溴化亞銅中的一種，用量為所用單體總質(zhì)量的1.0％～7.5％。
9根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的制備方法，其特征在于所述催化劑配體選自聯(lián)吡啶、五甲基三亞乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亞乙基四胺中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的制備方法，其特征在于反應(yīng)完成后進(jìn)行提純處理，所述提純處理包括以下步驟
(1)反應(yīng)完成后，加入四氫呋喃將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋，并在攪拌的條件下與空氣接觸，使反應(yīng)終止；
(2)待溶液變藍(lán)色后，使之通過裝有堿性Al2O3的柱子以除去溶液中的銅鹽；
(3)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液濃縮，再將濃縮液滴入正己烷中，除去未反應(yīng)的單體和均聚物；
(4)最后將所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物質(zhì)，即所述pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，具體公開了一種pH/溫度響應(yīng)的雙親水性嵌段共聚物及其制備方法，本發(fā)明通過開環(huán)聚合得到可降解的溫度響應(yīng)性聚磷酸酯，然后將聚磷酸酯設(shè)計(jì)成大分子ATRP引發(fā)劑，與pH敏感的水溶性單體或聚合以后可水解的單體前體通過ATRP反應(yīng)，獲得pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物。組成嵌段共聚物的兩段均為親水性聚合物，其中一段含具有生物相容性、生物可降解性及溫敏性的聚磷酸酯，另一段為pH響應(yīng)性的親水聚合物，因此，本發(fā)明提出的pH/溫度響應(yīng)性雙親水性嵌段共聚物具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性和pH/溫度敏感性，是一類新型的人工合成的高分子材料，在生物醫(yī)學(xué)和其它方面具有廣泛的用途。
文檔編號(hào)C08F293/00GK101649034SQ20091003447
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者倪沛紅, 旭 劉, 何金林, 張明祖, 朱秀林 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)