欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

用于轉(zhuǎn)染目的的線性聚乙烯亞胺(pei)的制造方法和用此方法得到的線性pei的制作方法

文檔序號(hào):3696447閱讀:1785來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:用于轉(zhuǎn)染目的的線性聚乙烯亞胺(pei)的制造方法和用此方法得到的線性pei的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)染用途的線性聚乙烯亞胺(PEI)的制造和質(zhì)量控制。
本發(fā)明還涉及由此制造方法得到的產(chǎn)品,更具體地說(shuō),用于活體應(yīng)用,其包括但不限于基于核酸的治療。
該申請(qǐng)是涉及并要求較早的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)US 60/952993的優(yōu)先權(quán)的非臨時(shí)申請(qǐng)。

背景技術(shù)
聚乙烯亞胺(PEI)是一種具有高陽(yáng)離子電荷密度潛能的有機(jī)大分子。PEI的每隔三個(gè)原子為可質(zhì)子化的氨基氮。PEI能夠誘捕DNA,并且,由于許多連接體氨基的接近的位置,PEI在幾乎任何pH值下保留了大的緩沖能力。
單獨(dú)的PEI是體外和體內(nèi)輸送DNA質(zhì)粒的高效載體。
PEI把DNA緊壓成能夠與陰離子蛋白多糖在細(xì)胞表面相互作用的帶正電的顆粒,并促進(jìn)該顆粒通過內(nèi)吞作用的進(jìn)入。帶正電的顆粒在細(xì)胞表面上粘附在陰離子細(xì)胞表面的蛋白多糖上,之后被自發(fā)吞噬(Boussif等人,1995)。一旦進(jìn)入細(xì)胞,PEI還具有充當(dāng)“質(zhì)子海綿”的獨(dú)特性能,這緩沖了內(nèi)體的pH值并防止DNA降解。質(zhì)子持續(xù)涌入還導(dǎo)致內(nèi)體滲透腫脹和破裂,它為DNA顆粒到細(xì)胞質(zhì)提供了逃逸機(jī)制(Boussif等人,1995;Behr,1997)。
總之,PEI基輸送系統(tǒng)模仿病毒的一些關(guān)鍵特性,如DNA的凝聚/保護(hù)和內(nèi)體逃逸。
存在幾種制造PEI的方法。
這實(shí)際上是因?yàn)檫@樣的聚合物多年來(lái)已被用于多種工業(yè)領(lǐng)域的事實(shí)。
但是,當(dāng)用作轉(zhuǎn)染目的時(shí),這樣的PEI的效率往往不好,即小于10%的生產(chǎn)的產(chǎn)品成功地轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。
特別是高分子量的PEI(即>10,000Da)的效率低。
此外,一旦此類產(chǎn)品將應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域,更特別是具有諸如GMP標(biāo)準(zhǔn)的高制造標(biāo)準(zhǔn)的基因療法,則需要出色的效率和質(zhì)量。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決這個(gè)問題,并得到在大分子量和低多分散性情況下的出色的效率(≥55%)。
為此目的,本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供合成和制備線性聚乙烯亞胺(PEI)的改進(jìn)方法,其使得可以得到比已知的更好的轉(zhuǎn)染效率和可靠性,同時(shí)具有更高的質(zhì)量。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,質(zhì)量是GMP(Good Manufacturing Product)的標(biāo)準(zhǔn)之一。
更確切地說(shuō),本發(fā)明提出一種合成和制備用作轉(zhuǎn)染載體的線性聚乙烯亞胺(PEI)的方法,其包含以下步驟由確定量的純度高于99%的2-乙基-2-噁唑啉單體開始,徹底干燥所述量的單體,并使所述量的單體聚合以獲得聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX),其通過以下步驟進(jìn)行 -徹底干燥預(yù)定量的乙腈以后,將所述的乙腈用作所述量的干燥單體的溶劑,同時(shí)添加預(yù)定量的徹底干燥的聚合反應(yīng)引發(fā)劑,并將它們混合在一起, -通過蒸發(fā)去除所述溶劑來(lái)純化所述的得到的PEOX,同時(shí)用甲醇和二乙醚來(lái)進(jìn)行至少三次相繼的洗滌/沉淀步驟以及相應(yīng)的過濾,安排所述的干燥、聚合和純化操作以獲得(i)通過進(jìn)行1HNMR測(cè)試,正確識(shí)別所述的PEOX聚合物,在<1.0%的水平上確認(rèn)沒有單體且在<5.0%的水平上確認(rèn)沒有溶劑,以及(ii)通過進(jìn)行凝膠滲透色譜,分子量(Mw)的平均值>23,000Da并且所述PEOX的多分散性(Mw/Mn)<1.5, -用鹽酸水解所述PEOX以充分有效地得到所述的PEI,通過進(jìn)行1HNMR測(cè)試,該P(yáng)EI具有<5%的剩余側(cè)鏈或丙酸的量,并確認(rèn)PEI為單峰。
對(duì)于徹底干燥特定量的單體、乙腈或引發(fā)劑,人們應(yīng)該理解為,在使用前,濕度降低到低于10ppm的水,這可以通過用氫化鈣干燥48小時(shí)以上,然后通過在129℃以上的溫度蒸餾并收集單體而得到。
本發(fā)明還提出有利的實(shí)施方案,其包括但不限于一個(gè)和/或多個(gè)下列特征 -PEOX的分子量(Mw)的平均值為40,000Da<Mw<54,000Da; -單體/引發(fā)劑之比為大約500?!按蠹s”應(yīng)理解為±5%; -單體/引發(fā)劑之比為480; -單體純度高于99.95%; -引發(fā)劑在加入單體之前與乙腈混合; -聚合在高于85℃的溫度下進(jìn)行20小時(shí)以上; -聚合溫度高于或等于105℃; -第一次過濾之后,殘余物用溶劑如MeOH大量地洗滌,加入二乙醚之后,聚(2-乙基-2-噁唑啉)自然地以油狀從溶液中分離,倒出全部溶劑,將所述的洗滌和分離重復(fù)至少四次,然后在真空中干燥; -水解步驟包括從反應(yīng)混合物中通過共沸蒸餾去除得到的釋放的丙酸,這定期地進(jìn)行并持續(xù)至少一天,同時(shí)用1HNMR譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程; -將在反應(yīng)過程結(jié)束時(shí)得到的殘余物在水中稀釋并蒸發(fā)至少三次來(lái)去除痕量丙酸,然后,將該殘余物再次溶解在水中并過濾,然后冷凍干燥; -過濾是通過網(wǎng)孔尺寸介于0.20微米和0.25微米之間的無(wú)菌膜,特別是無(wú)菌醋酸纖維素膜進(jìn)行的。
然而,這樣的過濾不是無(wú)菌的,因此不涉及額外費(fèi)用,而這與本領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍看法相反,在他們看來(lái),過濾的無(wú)菌性將是必要的。
無(wú)菌過濾應(yīng)該理解為去除所有的活性細(xì)菌和活性元素,至少低于根據(jù)現(xiàn)行USP確定的值。
本發(fā)明還提出了用上面描述的方法得到的線性PEI。
有利地,本發(fā)明提出了特征在于中間體PEOX具有40,000<Mw<54,000Da的分子量Mw的線性PEI。
在另一有利的實(shí)施方案中,PEOX的分子量Mw為25,000Da左右。“左右”應(yīng)理解為±1800Da。



通過閱讀下面的以非限制性實(shí)例的方式給出且參照附圖的對(duì)具體實(shí)施方案的說(shuō)明,本發(fā)明將得到更好的理解,其中 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案(GMP)的制造線性PEI的方法的示意圖。
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案的方法的步驟圖。
圖3至10顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法獲得的結(jié)果的不同曲線。

具體實(shí)施例方式 在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)實(shí)施方案(具有GMP質(zhì)量)中,在由作為強(qiáng)親電試劑的對(duì)甲苯磺酸甲酯引發(fā)聚合后,由2-乙基-2-噁唑啉(單體)的陽(yáng)離子開環(huán)聚合得到聚(2-乙基-2-噁唑啉)。
噁唑啉環(huán)形成(見此后的開環(huán)聚合的增長(zhǎng)步驟),然后被下一個(gè)單體攻擊。
這樣得到了活性聚合物,并且該聚合通過加入水和碳酸鈉而終止。

噁唑啉環(huán) 活性的聚合物 聚合度受單體/引發(fā)劑之比和合成的產(chǎn)率控制。
從單體/引發(fā)劑之比,可以計(jì)算出理論數(shù)均分子量(Mn)。高度控制的聚合提供了具有接近理論Mn的確定的Mn并具有低的多分散指數(shù)的聚合物。
當(dāng)期望PEOX的分子量從1,000到10,000Da時(shí),經(jīng)典的聚合產(chǎn)率在55至95%的范圍內(nèi)(Hoogenboom等人,2003)。產(chǎn)率向著更高的分子量下降。對(duì)于Mn<10,000Da的低分子量的確定,可以通過使用1H-NMR譜或MALDI-TOF質(zhì)譜來(lái)實(shí)現(xiàn)。
對(duì)于PEOX的>10,000Da的更高分子量,目前使用凝膠滲透色譜(GPC)并且是唯一有效的方法。
本發(fā)明的流程涉及用高度受控聚合來(lái)生產(chǎn)高分子量(10,000Da以上)的線性聚乙烯亞胺的過程的描述。以大約500的單體/引發(fā)劑之比開始聚合,獲得高于90%的產(chǎn)率,使得能夠制造高分子量線性PEI,其具有如GPC測(cè)定和低的確定的多分散性指數(shù)所示的窄分子量分布。
當(dāng)起始原料(單體、引發(fā)劑)和溶劑(乙腈)的質(zhì)量被極好地界定和控制時(shí),完全獲得高度受控的聚合。
試劑來(lái)自美國(guó)公司Aldrich,并按以下規(guī)格獲得 -2-乙基-2-噁唑啉,索引13,745-6,純度規(guī)格>99%,由氣相色譜分析確定的純度99.5-99.7%,沒有關(guān)于含水量的規(guī)格; -對(duì)甲苯磺酸甲酯,索引158992,純度規(guī)格>98%,由氣相色譜分析確定的純度99.9%。
乙腈來(lái)自意大利公司Carlo Erba,索引0063716,HPLC級(jí),純度規(guī)格99.9%且含水量<0.03%。
發(fā)現(xiàn)影響聚合產(chǎn)率的最關(guān)鍵的參數(shù)之一是在引發(fā)和增長(zhǎng)步驟期間的水的存在。
為此,將使用的容器仔細(xì)地干燥并且在開始合成前儲(chǔ)存在氬氣中。
也比較了兩個(gè)起始單體和乙腈的蒸餾要求,因?yàn)槲覀儜岩珊哿克拇嬖谀軌蚪档途酆袭a(chǎn)率(見表1)。
單體和乙腈在使用之前用氫化鈣干燥再在氬氣中蒸餾提純。
乙腈在使用之前蒸餾提純。
結(jié)果清楚地表明,為獲得PEOX>90%的產(chǎn)率,2-乙基-2-噁唑啉和乙腈的蒸餾都是需要的。
此外,顯示出了高程度的重復(fù)性。在這些條件下并且使用500的單體對(duì)引發(fā)劑之比,PEOX聚合物具有同一范圍內(nèi)的分子,51.862+/-1.644,且平均Mw/Mn為1.15+/-0.03。
未蒸餾的試劑或溶劑的使用產(chǎn)生不一致的分子量。
表12-乙基-2-噁唑啉的聚合(單體/引發(fā)劑之比為500) Mw和Mw/Mn(多分散性指數(shù))通過凝膠滲透色譜法得到。
線性PEI(GMP)的分析的憑證在此后的表2中舉例給出。
產(chǎn)品線性聚乙烯亞胺 分子式(純的)(C2H5N)nx(HCl)m 表2

cfu菌落形成單位;RLU相對(duì)光單位;EU內(nèi)毒素單位;NMT不超過 轉(zhuǎn)染測(cè)定 轉(zhuǎn)染前一天,在1毫升完全MEM培養(yǎng)基(具有Earle鹽的Eagle MEM培養(yǎng)基,補(bǔ)充有10%胎牛血清、碳酸氫鈉、2mM glutamaxTM、200單位/毫升青霉素和200毫克/毫升鏈霉素)中的24孔組織培養(yǎng)板的每孔中加入5×104HeLa細(xì)胞(ATCC CCL-2)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天,制備體內(nèi)線性PEI pCMV-Luc配合物。對(duì)于一個(gè)孔,將1微克的DNA(pCMVLuc質(zhì)粒,1毫克/毫升,編碼熒光素酶基因)加入微量管(1.5毫升)中的50微升的150mM NaCl中,再用Vortex混合。將體內(nèi)線性PEI樣本或陽(yáng)性對(duì)照添加到50微升的150mMNaCl中(條件見表),再將該溶液用Vortex混合。將體內(nèi)線性PEI樣本(用水預(yù)稀釋為7.5mM)或線性PEI陽(yáng)性對(duì)照(7.5mM)或50微升的150mM NaCl溶液(條件只有DNA)一起添加到DNA溶液中,再用Vortex混合10秒。將該溶液(100微升)在添加到孔中之前在室溫下培養(yǎng)30分鐘。經(jīng)過輕輕地旋動(dòng)均化之后,將培養(yǎng)板在37℃下在包含5%CO2的加濕的空氣氣氛中培養(yǎng)24小時(shí)。
轉(zhuǎn)染一天后,進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。去除細(xì)胞培養(yǎng)物并且每個(gè)孔用1毫升的PBS清洗。去除PBS以后,添加100微升的溶胞緩沖液(熒光素酶細(xì)胞培養(yǎng)物溶胞緩沖液(5X),Promega),并且將該培養(yǎng)板在室溫下培養(yǎng)30分鐘。將該溶解產(chǎn)物收集在1.5毫升的微型管中,并以14000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。向用于光度計(jì)(LB 960 CENTRO,Berthold Technologies)的96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔添加2微升的上層清液并且測(cè)量自動(dòng)添加50微升的熒光素底物(Promega)之后1秒鐘內(nèi)積分的發(fā)光(RLU,相對(duì)光單位)。結(jié)果表示為RLU/孔。然后計(jì)算RLU/孔的平均值(n=6)±SD。
現(xiàn)在結(jié)合圖1更具體地描述該方法。
從原料1(單體和其他溶劑和試劑)開始,在2中適當(dāng)處理,提供聚合步驟3以獲得中間體產(chǎn)物PEOX 4,它在5中被適當(dāng)識(shí)別,并在步驟6中確定其量。
然后,提供酸性水解7以獲得線性PEI 8,其在9中適當(dāng)識(shí)別并測(cè)試用于轉(zhuǎn)染的樣本(轉(zhuǎn)染測(cè)定10)。
在進(jìn)行最后的冷凍干燥步驟18之前和/或同時(shí),提供下面有關(guān)外觀11、引燃?xì)埩粑?2、重金屬的存在13、殘余有機(jī)化合物的存在14、雜質(zhì)概況15、內(nèi)毒素測(cè)定16以及最后的微生物量(bioburden)(用于確定微生物限量的測(cè)定=以cfu/g為單位的微生物量)17的測(cè)試。
因此在最后的填充步驟20之前,得到冷凍干燥形式的最終產(chǎn)物19。
簡(jiǎn)言之,最后的填充步驟通過體內(nèi)線性PEI本體溶液的制備開始。將本體粉末稱重并溶解于水以獲得150mM氮的最終濃度。該溶液用磁力攪拌器以200轉(zhuǎn)/分的混合速度混合大約1小時(shí),然后在2-8℃下放置24小時(shí)。該溶液在A級(jí)條件的房間中過濾。為進(jìn)行過濾,使用一次性的無(wú)菌硅管和內(nèi)聯(lián)入無(wú)菌專用玻璃容器中的2x Sartobran P過濾器(0.45微米/0.22微米)。測(cè)試了第一過濾器的完整性之后,PEI溶液通過該過濾器慢慢地過濾到無(wú)菌玻璃容器中。在這一步,取樣本做微生物量測(cè)試。過濾后,在層流空氣流中填入DIN 2R瓶并且插入橡膠瓶塞。再在瓶上蓋上13毫米鋁密封。封蓋過程完成之后,將瓶?jī)?chǔ)存在-20℃下。取樣本并檢查重大缺陷。
取其他(隨機(jī)的)樣本進(jìn)行內(nèi)毒素和無(wú)菌測(cè)定。這些瓶在零下20℃儲(chǔ)存直至裝運(yùn)。
在第二個(gè)實(shí)施方案中,體內(nèi)線性PEI的制造和控制分四個(gè)主要步驟進(jìn)行(見圖2) 1)噁唑啉聚合成聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX); 2)PEOX的提純; 3)將PEOX轉(zhuǎn)化為聚乙烯亞胺(線性PEI); 4)和線性PEI的提純。
更確切地說(shuō),制造和控制步驟在此后參照?qǐng)D2說(shuō)明。
從非常純的單體開始。
步驟1該方法從21開始。首先提供聚合步驟1(22)
2-乙基-2-噁唑啉 聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX) 步驟2涉及聚(2-乙基-2-噁唑啉)在乙腈中的提純(23)。
在所述的提純期間,進(jìn)行以下步驟 -用乙醚使聚合物材料沉淀(24)以去除單體; -用甲醇和乙醚進(jìn)行三輪洗滌(25); -蒸發(fā)(26)以去除溶劑; -通過過程(In-Process)質(zhì)量控制來(lái)進(jìn)行控制(27)即,用1H-NMR來(lái)識(shí)別聚合物,用1H-NMR來(lái)確認(rèn)缺少單體,用1H-NMR來(lái)確認(rèn)沒有溶劑<1.0%。
然后得到提純的聚(噁唑啉)(PEOX)沉淀。
步驟3-4將PEOX轉(zhuǎn)化(28)為線性PEI和聚合物的提純(29)。
為了更確切地得到提純的聚(噁唑啉)(PEOX)沉淀,提供了以下步驟。
-在30中,加入37%的HCl和水; -在31中,CH3-CH2-COOH與水共沸蒸餾; -在32中,加入鹽酸以得到CH3-CH2-COOH。
在這個(gè)階段,在33中得到具有HCl的純化線性聚乙烯亞胺的水溶液中。
然后提供下面的步驟。
-在34中,蒸發(fā)水以去除過多的HCl,這能夠得到溶解于無(wú)菌水中的線性PEI,HCl(35),然后 -在36中,冷凍干燥以提供線性PEI,HCl粉末。
然后,在38中過濾之前,在37中使PEI再潮濕以獲得含水的體內(nèi)線性PEI(150mM氮)。
然后進(jìn)行最終本體的體內(nèi)線性PEI質(zhì)量測(cè)試(39和40),即,在輸送PEI以用于轉(zhuǎn)染之前 -1H-NMR識(shí)別和體內(nèi)線性PEI的純度; -1H-NMR殘余側(cè)鏈或丙酸; -體內(nèi)線性PEI的凝膠滲透多分散性; -HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染-生物活性; -內(nèi)毒素水平。
現(xiàn)在進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明上面描述的體內(nèi)線性PEI的制造。
在第一步22中,從乙腈中的兩種起始原料2-乙基-2-噁唑啉和對(duì)甲苯磺酸甲酯開始,通過陽(yáng)離子聚合得到聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)。
第二步23從在甲醇等效物(就其洗滌聚合物的能力而言)(即在該例中為氯仿和乙醚)中多次洗滌25開始,使聚合物PEOX沉淀,并去除單體、溶劑和未反應(yīng)試劑。
對(duì)這一中間體化合物完成過程質(zhì)量測(cè)試27。
這些測(cè)試(過程測(cè)試,見表3)為用核磁共振(NMR)來(lái)識(shí)別PEOX聚合物,用NMR來(lái)確認(rèn)沒有單體,以及用NMR來(lái)確認(rèn)溶劑水平<1.0%(流程CQ-1001)。
凝膠滲透測(cè)定(CQ-1002)確保PEOX的多分散性并確定平均分子量。
第三步28是用37%的鹽酸在水中進(jìn)行酸性水解30使丙酸酯側(cè)鏈裂解,從而將PEOX轉(zhuǎn)化成線性PEI。
線性PEI的提純是通過在水中共沸蒸餾31去除丙酸而實(shí)現(xiàn)的。在水和過量的鹽酸蒸發(fā)34之后,將線性PEI再懸浮在150mM胺的無(wú)菌水(步驟37)中,在38中通過0.22微米纖維素膜過濾到本體容器中。
體內(nèi)線性PEI的識(shí)別和純度通過測(cè)試39、40,主要是NMR測(cè)試(見表3的CQ-1003)確定的。
這些測(cè)試也確保側(cè)鏈的完全去除并檢測(cè)任何殘留丙酸。
然后,用轉(zhuǎn)染測(cè)定(CQ-1004)測(cè)量體內(nèi)線性PEI的生物活性。
最后,用內(nèi)毒素測(cè)定(CQ-1005)測(cè)量?jī)?nèi)毒素水平。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在此更詳細(xì)地進(jìn)行了描述,在整個(gè)體內(nèi)線性PEI的生產(chǎn)過程中遵循批量生產(chǎn)流程。
連同操作人員姓名和日期記錄了儀器、組成、條件和流程等,而過程中和最終本體產(chǎn)品測(cè)試是由合格的技術(shù)人員按照書面流程執(zhí)行的(在此仍見表3)。所有的測(cè)試都有記錄結(jié)果的規(guī)范。
表3.過程中和最后的本體化驗(yàn)
**RLU=相對(duì)光單位 然后為每批產(chǎn)品準(zhǔn)備帶有規(guī)范和測(cè)試結(jié)果的分析證書,如之前在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中指出的,記住在每批體內(nèi)線性PEI委托裝運(yùn)給客戶之前,質(zhì)量保證人對(duì)審查和批準(zhǔn)批量生產(chǎn)記錄和分析證書負(fù)責(zé)。
反應(yīng)方案
在提供的不同的例子中,使用下列初始原料和試劑來(lái)進(jìn)行這樣的操作。
2-乙基-2-噁唑啉,≥99% 單體應(yīng)該非常純,即具有純度≥99%。這里它也可以從美國(guó)公司Aldrich獲得,例如通過蒸餾改善到99.98%的純度(見圖3和4)。
對(duì)甲苯磺酸甲酯具有高純度,即98%。
引發(fā)劑,例如優(yōu)選地為對(duì)甲苯磺酸甲酯,這里也具有高純度,即≥95%,例如98%。
酸有利地是鹽酸,例如,這里也可以是從意大利公司Fluka購(gòu)買的酸度為37%的酸。
其他 乙腈為HPLC級(jí),溶劑甲醇和乙醚為Ph.Eur.級(jí)。加工助劑氫化鈣和碳酸鈉從Fluka購(gòu)買。
更確切地說(shuō),在當(dāng)前的實(shí)施例中,合成聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)的第一步為如下 反應(yīng)
合成 聚(2-乙基-2-噁唑啉)是用對(duì)甲苯磺酸甲酯作為聚合引發(fā)劑從2-乙基-2-噁唑啉開始合成的。反應(yīng)在氬氣下在火焰干燥的反應(yīng)燒瓶中進(jìn)行。將乙腈用作溶劑,反應(yīng)溫度為85℃。
在85℃經(jīng)過24小時(shí)之后,將反應(yīng)混合物冷卻到室溫并用水驟冷并添加碳酸鈉。由此產(chǎn)生的懸浮液在85℃再加熱24小時(shí),冷卻到室溫后過濾(Duran D2燒結(jié)玻璃)以去除固體,用甲醇洗滌濾餅并蒸發(fā)溶劑。
將殘余物溶解于甲醇并再次過濾(玻璃纖維,Whatman B)。將溶劑用油泵蒸發(fā)。再次將殘余物溶解于甲醇,然后通過加入二乙醚來(lái)沉淀。隨后去除溶劑(油泵真空)。進(jìn)行第二次沉淀,然后將PEOX干燥至恒重。
1H-NMR譜必須顯示少于5%的溶劑和少于1%的噁唑啉單體。
現(xiàn)在將描述PEOX和PEI的實(shí)施例,一個(gè)(批次N°1和3)不包含本發(fā)明的所有步驟(即,不包含乙腈蒸餾),其具有不令人滿意的結(jié)果,一個(gè)(批次2和4)包含本發(fā)明的所有步驟,其具有令人滿意的結(jié)果。
實(shí)施的PEOX制備的概述(表4) 成果和分析結(jié)果 批次N°1 遵循上述程序的合成和后處理。
產(chǎn)率40.95克(81.9%)(即,太低) 1H-NMR譜檢測(cè)到已知雜質(zhì)(質(zhì)子化形式,1.78ppm)以及二乙醚的信號(hào)。除了這些信號(hào),還檢測(cè)到具有3.72ppm處的信號(hào)的少量未知雜質(zhì)(圖5)。
GPC(表5) 由500個(gè)單體組成的體內(nèi)線性PEI的期望摩爾質(zhì)量為49,581克/摩爾。平均Mw是用下列設(shè)備通過凝膠滲透色譜確定的泵Shimadzu LC-10AD(0.5毫升/分)、自動(dòng)注射器WISP(Waters)、1個(gè)保護(hù)柱(Shodex OH-pak K3-G,6.0×50毫米),隨后是3個(gè)柱Shodex OH-pak,8.0×300毫米(1個(gè)柱803HQ,1個(gè)柱804HQ,1個(gè)柱806HQ),串連,折射率檢測(cè)器,差分檢測(cè)器Waters R410,以及多角度光散射檢測(cè)器DAWN F,Wyatt Techn。用于走樣本的溶劑為具有0.1M的NaNO3和NaN3的雙蒸餾水。將干燥的PEOX以4-6克/升溶解在GPC溶劑中,并在室溫下攪拌4小時(shí)。注射之前,樣本經(jīng)過0.22微米Dynagard過濾器的過濾。將100微升4-6克/升的PEOX自動(dòng)注入保護(hù)柱,以0.5毫升/分的流速進(jìn)行GPC。GPC的監(jiān)測(cè)是由通過90°光散射信號(hào)和RI信號(hào)(dn/dc)執(zhí)行的。通過結(jié)合散射信號(hào)和RI數(shù)據(jù),聚合物的絕對(duì)摩爾質(zhì)量通過軟件(使用軟件ASTRA)計(jì)算。
批次N°2 遵循上述程序進(jìn)行合成和后處理。
產(chǎn)率43.71克(87.2%)(即,好) 1H-NMR譜除了PEOX,這個(gè)譜顯示了溶劑二乙醚和乙腈。另外發(fā)現(xiàn)了未知雜質(zhì)(3.72ppm)(圖6)。
GPC(表6) 由500個(gè)單體組成的體內(nèi)線性PEI的期望摩爾質(zhì)量是49,581克/摩爾。
第二步驟包括進(jìn)行聚乙烯亞胺的合成(體內(nèi)線性PEI) 反應(yīng)
合成 對(duì)于體內(nèi)線性PEI的合成,以上PEOX中間體的側(cè)鏈通過酰胺鍵在水中用鹽酸的水解去除。將混合物在120℃攪拌。
一天后,反應(yīng)完成。反應(yīng)的進(jìn)展用1H-NMR譜監(jiān)測(cè)。
必須有不超過5%的側(cè)鏈未被裂解。
鹽酸通過蒸發(fā)去除。將殘余物溶解于水/鹽酸并蒸發(fā)兩次以去除痕量的丙酸。
然后,將殘余物溶于水,并通過玻璃纖維過濾器(Whatman B)和0.22微米無(wú)菌醋酸纖維素膜過濾。將該無(wú)色溶液凍干。
NMR分析必須顯示出聚合物、少量的剩余側(cè)鏈和小于5%的殘余丙酸的識(shí)別。
實(shí)施的體內(nèi)線性PEI制備的概述 表7 批次N°3是批次N°1水解后得到的。
批次N°4是批次N°2水解后得到的。
成果和分析結(jié)果 批次N°3 遵循上述程序的合成和后處理。
產(chǎn)率27.61克(87.7%) 1H-NMR譜該譜圖顯示出體內(nèi)線性PEI的單峰(圖9)。
批次N°4 遵循上述程序的合成和后處理。
產(chǎn)率29.43克(87.4%) 1H-NMR譜該譜圖顯示出體內(nèi)線性PEI的單峰(圖10)。
結(jié)論 合成了兩批線性PEI。第二批次的1H-NMR譜純度以及產(chǎn)品產(chǎn)率是可重復(fù)的和令人滿意的,相比之下,第一批次因未使用本發(fā)明的某些步驟而不令人滿意。
PEOX的平均摩爾質(zhì)量通過GPC確定。該規(guī)范已經(jīng)證明是非常敏感的。批次N°1中鏈長(zhǎng)度未達(dá)到預(yù)期值(表5,圖7)。
根據(jù)表8至14及相應(yīng)的圖3至10,現(xiàn)提供下面的結(jié)果。
1.)購(gòu)買的單體2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC(見表8和圖3)。
2.)蒸餾的單體2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC(見表9和圖4)。
3.)批次N°1的1H-NMR譜(見圖5)。
4.)批次N°2的1H-NMR譜(見圖6)。
5.)批次N°1的GPC(見圖7和表11)。
6.)批次N°2的GPC(見圖8和表12)。
7.)批次N°3的1H-NMR譜(見圖9)。
8.)批次N°4的1H-NMR譜(見圖10)。
1.)購(gòu)買的單體2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC 表8 更確切地說(shuō),圖3清楚地顯示,高度(PA)在Oy方向而時(shí)間(分鐘)在Ox方向,在40℃的溫度下,GC氣相色譜觀察到的不同的峰,即提純之前第二個(gè)實(shí)施方案中描述的本發(fā)明方法所用的單體的峰1(41)、峰2(42)、2-乙基-2-噁唑啉的峰43、峰3(44)和峰4(45)。
2.)蒸餾的單體2-乙基-2-噁唑啉(EH-1268.4-2)的GC。
圖4和表9顯示了蒸餾的單體的GC(正好在步驟22之前)。蒸餾這一具體步驟顯示,與市售的原料純度相比,單體的純度增加了(表8和圖3)。
只剩三個(gè)峰,即峰1(46)、峰2(47)和2-乙基-2-噁唑啉的峰(48)。
表9 3,4.)批次1和2的1H-NMR譜 回顧表10(表5和6的組合)
圖5和6分別顯示了批次N°1的PEOX的1H-NMR譜和N°2的PEOX的1H-NMR譜。
更具體地說(shuō),得到的峰50至53和峰55至58意味著確認(rèn)PEOX[1.0-1.3ppm(3H,CH2-CH3),2.0-2.5ppm(2H,CH2-CH3),3.4-3.5ppm(4H,CH2-CH2-N)]。峰49和54代表溶劑(CDCl3)。
5.)批次N°1的GPC(凝膠滲透色譜) 表11和圖7 光散射儀miniDAWN 單元型號(hào)(cell type)K5 激光波長(zhǎng)690.0納米 校準(zhǔn)常數(shù)5.8800e-6l/(Vcm) RI儀Optilab DSP 紫外線儀n/a 溶劑水 折射率1.330 流速0.500毫升/分鐘 質(zhì)量結(jié)果擬合無(wú)(擬合程度n/a) 半徑結(jié)果擬合無(wú)(擬合程度n/a) 峰1 峰的界限(mL)21.513.13.180 dn/de(mL/g) 0.162 A2(mol mL/g2) 0.000 UV ext.(mL/g cm)0.000 模型21mm 擬合程度1 注入質(zhì)量(g) 4.6732e-4 計(jì)算質(zhì)量(g) 4.3112e-4 峰1 多分散性 Mw/Mn1.260(16%) Mz/Mn2.270(56%) 摩爾質(zhì)量矩(moment)(克/摩爾) Mn2.641e+4(16%) Mp3.516e+4(0.9%) Mw3.580e+4(9%) 曲線60(來(lái)自多角度光散射檢測(cè)器MALS的原始數(shù)據(jù))和61(來(lái)自折射率檢測(cè)器RI的原始數(shù)據(jù))明顯地不同,顯示出不令人滿意的較大的多分散性結(jié)果(該曲線的單位,Ox方向?yàn)轶w積(毫升)而OY方向?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度的相對(duì)大小)。
6.)批次N°2的GPC 表12和圖8。
光散射儀miniDAWN 單元型號(hào)K5 激光波長(zhǎng)690.0納米 校準(zhǔn)常數(shù)5.8800e-6l/(Vcm) RI儀Optilab DSP 紫外線儀n/a 溶劑水 折射率1.390 流速0.900毫升/分鐘 質(zhì)量結(jié)果擬合無(wú)(擬合程度n/a) 半徑結(jié)果擬合無(wú)(擬合程度n/a)峰1 峰的界限(mL) 21.891.28.904 dn/de(mL/g) 0.162 A2(mol mL/g2)0.000 UV ext.(mL/g cm) 0.000 模型 21mm 擬合程度 1 注入質(zhì)量(g) 6.7440e-4 計(jì)算質(zhì)量(g)6.1415e-4 峰1 多分散性 Mw/Mn 1.160(16%) Mz/Mn 1.331(22%) 摩爾質(zhì)量矩(克/摩爾) Mn8.721e+4(16%) Mp4.621e+4(0.9%) Mw4.317e+4(9%) Mz4.951e+4(18%) 這里,曲線62(來(lái)自MALS檢測(cè)器的原始數(shù)據(jù))和63(來(lái)自RI檢測(cè)器的原始數(shù)據(jù))幾乎相符,這對(duì)于本發(fā)明是可接受的。
7,8)最后,將分別由批次N°1和2的PEOX得到的批次N°3和N°4的PEI的1H-NMR譜復(fù)制在圖9和圖10上,它們分別顯示了峰64(4.72ppm,D2O)和65(3.46ppm,CH2-CH2-NH,來(lái)自PEI),和66(4.71ppm,D2O),67(3.47ppm,CH2-CH2-NH,來(lái)自PEI)。
最后,下面提供表13 此表顯示,PEOX的質(zhì)量Mw取決于引發(fā)劑/單體的最初比例。
*注在這個(gè)實(shí)施例中,最終的PEI具有>10,000Da的質(zhì)量,并且更確切地說(shuō),在15,000Da左右(即,34,180/99×43=14,846Da)。
PEOX生產(chǎn)的高性能(>85%)使得能通過本發(fā)明方法生產(chǎn)具有接近理論值的質(zhì)量的聚合物,并具有<1.5的低的多分散性。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員,其它優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)是顯而易見的。因此,在更廣泛的方面,本發(fā)明不僅限于在此顯示和描述的具體細(xì)節(jié)、代表性的設(shè)備和列舉的例子。
特別地,它涵蓋了用上面描述的方法獲得的線性PEI。
參考文獻(xiàn) -Behr,J.1997.The proton sponge.A trick to enter cells thevirus did not explain.CHIMIA 5134-36。
-Boussif,O.,Lezoualc′h,M.A.,Zanta,M.D.,et al.1995.Aversatile vector of r gene and oligonucleotide transfer into cellsin culture and in vivopolyethylenimine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.927287-7301. -Hoogenboom,R.,F(xiàn)ijten,M.W.M.,Meier,M.A.R.,&Schubert,U.S.2003.Living cationic polymerizations utilizing an automatedsynthesizerhigh-throughput synthesis of polyoxazolines.Macromol.Rapid Commun.2492-97。
-Nucleic acid containing composition,preparation and uses ofsame-US patent 6,013,240-J-P Behr et al. 現(xiàn)在描述以下的根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)實(shí)施方案。
這種制造體內(nèi)線性PEI的方式以兩步合成進(jìn)行。
從單體(2-乙基-2-噁唑啉)聚合為聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX)的第一步,和從所述的PEOX獲得線性PEI的第二步。
權(quán)利要求
1.一種合成和制備用作轉(zhuǎn)染載體的線性聚乙烯亞胺(PEI)的方法,其包含以下步驟由確定量的純度高于99%的2-乙基-2-噁唑啉單體開始,徹底干燥所述量的單體,并使所述量的單體聚合以獲得聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX),其通過以下步驟進(jìn)行
-徹底干燥預(yù)定量的乙腈以后,將所述的乙腈用作所述量的干燥單體的溶劑,同時(shí)添加預(yù)定量的徹底干燥的聚合反應(yīng)引發(fā)劑,并將它們混合在一起,
-通過蒸發(fā)去除所述溶劑來(lái)純化所述的得到的PEOX,同時(shí)用甲醇和二乙醚來(lái)進(jìn)行至少三次相繼的洗滌/沉淀步驟以及相應(yīng)的過濾,
安排所述的干燥、聚合和純化操作以獲得(i)通過進(jìn)行1H-NMR測(cè)試,正確識(shí)別所述的PEOX聚合物,在<1.0%的水平上確認(rèn)沒有單體且在<5.0%的水平上確認(rèn)沒有溶劑,以及(ii)通過進(jìn)行凝膠滲透色譜,分子量(Mw)的平均值>23,000Da并且所述PEOX的多分散性(Mw/Mn)<1.5,
-用鹽酸水解所述PEOX以充分有效地得到所述的PEI,通過進(jìn)行1H-NMR測(cè)試,該P(yáng)EI具有<5%的剩余側(cè)鏈或丙酸的量,并確認(rèn)PEI為單峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于,中間體PEOX的分子量(Mw)的平均值為40,000Da<Mw<54,000Da。
3.根據(jù)以上權(quán)利要求任意之一的方法,其特征在于,單體/引發(fā)劑之比為大約500。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其特征在于,單體/引發(fā)劑之比為480。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其特征在于,單體純度高于99.95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其特征在于,在加入到單體之前,將引發(fā)劑與乙腈混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其特征在于,該聚合在高于85℃的溫度下進(jìn)行20小時(shí)以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其特征在于,聚合溫度高于105℃。
9.根據(jù)以上權(quán)利要求任意之一的方法,其特征在于,在第一次過濾之后,將殘余物用MeOH大量地清洗,在加入二乙醚后,聚(2-乙基-2-噁唑啉)自然地以油狀從溶液中分離,倒出全部溶劑,將所述洗滌和分離重復(fù)至少四次,然后在真空中干燥。
10.根據(jù)以上權(quán)利要求任意之一的方法,其特征在于,水解步驟包括從反應(yīng)混合物中通過共沸蒸餾去除得到的釋放的丙酸,這定期地進(jìn)行并持續(xù)至少一天,同時(shí)用1H-NMR譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其特征在于,將在反應(yīng)過程結(jié)束時(shí)得到的殘余物在水中稀釋并蒸發(fā)至少三次來(lái)去除痕量丙酸,然后,將該殘余物再次溶解在水中并過濾,然后冷凍干燥。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法,其特征在于,過濾是通過網(wǎng)孔尺寸介于0.20微米和0.25微米之間的無(wú)菌醋酸纖維素膜進(jìn)行的。
13.根據(jù)以上權(quán)利要求1至12任意之一的方法得到的線性PEI,其通過純化中間體產(chǎn)物(PEOX),該中間體產(chǎn)物具有少于1.0%的單體,少于5.0%的溶劑,分子量Mw>23,000Da,多分散性Mw/Mn小于1.5。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的線性PEI,其特征在于,中間體產(chǎn)物PEOX具有40,000<Mw<53,000Da的PEOX分子量Mw。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的線性PEI,其特征在于,中間體產(chǎn)物PEOX具有25,000Da左右的分子量Mw。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種合成和制備用作轉(zhuǎn)染載體的線性聚乙烯亞胺(PEI)的方法,以及用這種方法得到的產(chǎn)品。它包含干燥單體2-乙基-2-噁唑啉和聚合所述單體以獲得聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOX),通過將乙腈用作溶劑,添加干燥的聚合反應(yīng)引發(fā)劑,并將它們混合在一起;通過蒸發(fā)純化所述的得到的PEOX,同時(shí)用甲醇和二乙醚來(lái)進(jìn)行至少三次相繼的洗滌/沉淀步驟以及相應(yīng)的過濾,以獲得(i)通過進(jìn)行1H-NMR測(cè)試,正確識(shí)別所述的PEOX聚合物,在<1.0%的水平上確認(rèn)沒有單體且在<5.0%的水平上確認(rèn)沒有溶劑,以及(ii)通過進(jìn)行凝膠滲透色譜,分子量(Mw)的平均值>23,000Da并且所述PEOX的多分散性(Mw/Mn)<1.5;水解所述PEOX。
文檔編號(hào)C08G73/00GK101821317SQ200880104653
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日
發(fā)明者A·阿迪布, F·斯多克, P·埃爾巴徹 申請(qǐng)人:聚加轉(zhuǎn)染公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
鹤庆县| 印江| 扶沟县| 黑河市| 鹰潭市| 西城区| 三穗县| 凤城市| 兴山县| 临沂市| 宜章县| 青铜峡市| 青铜峡市| 中宁县| 南康市| 固镇县| 九台市| 靖远县| 潞西市| 晋州市| 周宁县| 琼结县| 临沭县| 神农架林区| 瑞金市| 阜南县| 微山县| 鹤峰县| 红河县| 聊城市| 西平县| 盐源县| 屏山县| 河南省| 凤山市| 广州市| 巨野县| 汶上县| 遂川县| 平乡县| 长阳|