專利名稱：殼聚糖、殼低聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖和殼低聚糖的制備方法。
殼聚糖，學(xué)名聚脫乙酰氨基葡萄糖，廣泛存在于海洋節(jié)肢動(dòng)物如蝦、蟹和昆蟲(chóng)的外殼及真菌微生物的細(xì)胞壁中。殼聚糖在化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，如用于水處理中的絮凝劑、食品添加劑、藥物緩釋劑等。
目前殼聚糖生產(chǎn)主要是以蝦殼為原料，用稀酸將甲殼中的碳酸鈣變成氯化鈣去除，經(jīng)水洗、干燥、粉碎后，再用稀堿溶液漬泡，在100℃處理48小時(shí)，用以除去蛋白質(zhì)，得到甲殼素，一般堿處理需反復(fù)處理5次；甲殼素用濃堿溶液在60-80℃下處理數(shù)小時(shí)，完成脫乙酰基的操作，過(guò)濾去除雜質(zhì)。以蝦殼為原料生產(chǎn)殼聚糖具有以下幾個(gè)缺點(diǎn)①工藝繁瑣，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，難于工業(yè)化，原料有限且受季節(jié)限制，因而成本高；②質(zhì)量不穩(wěn)定，由于各地產(chǎn)的蝦種類不同而導(dǎo)致生產(chǎn)的殼聚糖質(zhì)量差異很大。
80年代后美國(guó)、日本相繼開(kāi)始研究用發(fā)酵法生產(chǎn)殼聚糖，如日本旭硝子公司開(kāi)發(fā)了犁頭霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的工藝，見(jiàn)EP0531991A2專利，但專門(mén)用于生產(chǎn)殼聚糖的這種犁頭霉菌的培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)，一般為一周左右，而且需要消耗大量的培養(yǎng)基，因此這種方法耗時(shí)耗力成本高，因此至今尚未工業(yè)化。
殼低聚糖是指含有2～10個(gè)氨基葡萄糖的寡糖，殼低聚糖具有許多生物醫(yī)藥的功能，如降低血壓、血脂等。通常殼低聚糖是以殼聚糖為原料經(jīng)降解制得。降解的方法有化學(xué)法(酸法)及酶法等幾種方法。見(jiàn)《化工進(jìn)展》1994年1月“殼低聚糖的合成及其應(yīng)用”一文所揭示的，無(wú)論方法如何，其生產(chǎn)原料全是以蝦殼、蟹殼為原料進(jìn)行生產(chǎn)的，因而生產(chǎn)成本較高。
本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡(jiǎn)單、低成本、易于工業(yè)化的制備殼聚糖和殼低聚糖的方法，本發(fā)明以青霉素、檸檬酸或乳酸發(fā)酵后的廢絲狀菌體為原料生產(chǎn)殼聚糖及殼低聚糖，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，不但大大降低了生產(chǎn)成本，而且還變廢為寶，對(duì)環(huán)境保護(hù)也非常有益。
本發(fā)明的要點(diǎn)如下
一種殼聚糖的制備方法，依次包括以下步驟(1)細(xì)胞破碎將絲狀菌體中加入稀堿溶液，所說(shuō)的絲狀菌體為青霉素發(fā)酵的青霉菌、檸檬酸發(fā)酵的黑曲霉菌或乳酸發(fā)酵的根霉菌，所用的稀堿溶液沒(méi)有特別要求，可以是氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀，重量百分濃度最好在1-10％，加入量使堿與絲狀菌體的重量比為0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，攪拌10分鐘-4小時(shí)，收集菌體，可以采用離心或過(guò)濾的方法收集菌體。堿液不但可以破碎細(xì)胞，而且可以萃取胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)。
(2)脫乙酰化目的是將甲殼素分子中的乙酰氨基脫乙酰后變成殼聚糖。在步驟(1)收集的菌體中加入重量百分濃度為10-70％的濃堿溶液，濃堿最好是氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，加入的量使堿與絲狀菌體的重量比為0.5∶1-14∶1，在50-200℃條件下，反應(yīng)1-5小時(shí)，收集菌體。反應(yīng)最好是在回流或密閉條件下進(jìn)行，以防止溶液蒸發(fā)，降低堿的濃度。
為提高脫乙酰的效率，脫乙?；牟僮骺梢圆捎枚虝r(shí)間多次處理的方法，如采用兩次脫乙?；看翁幚?-2小時(shí)，可顯著提高殼聚糖的脫乙酰度，達(dá)85％以上。
(3)殼聚糖的萃取在步驟(2)收集的菌體中加入重量百分濃度為1-30％的酸進(jìn)行萃取，所用的酸最好為有機(jī)酸，如乙酸、乳酸、檸檬酸等，或鹽酸，重量百分濃度最好為1-15％，加入的量使酸與絲狀菌體的重量比為0.05∶1-3∶1，萃取溫度為20℃～100℃，攪拌萃取0.5～20小時(shí)，除去菌絲體殘?jiān)占锨逡骸?br> 為了減少酸的用量，可將步驟(2)中收集的菌體用水洗至中性，再進(jìn)行酸萃取。另外，為了提高萃取率，萃取過(guò)程還可重復(fù)2-3次，合并幾次萃取液。
(4)殼聚糖的收集可用堿法或有機(jī)溶劑沉淀萃取液中的殼聚糖，也可采用噴霧干燥或氣流干燥直接將萃取液中的殼聚糖成球；堿法所用的堿液有氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水和和堿性鹽如磷酸鹽等。具體的操作為將萃取上清液的pH值用堿調(diào)節(jié)到大于等于6.0或加入C1-C6的醇或C3-C6的酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀，收集沉淀物制得殼聚糖。其中所用的有機(jī)溶劑最好為丙酮、乙醇或丙醇。
一種殼低聚糖的制備方法，依次包括以下步驟(1)細(xì)胞破碎將絲狀菌體中加入稀堿溶液，所說(shuō)的絲狀菌體為青霉素發(fā)酵的青霉菌、檸檬酸發(fā)酵的黑曲霉菌或乳酸發(fā)酵的根霉菌，所用的稀堿溶液沒(méi)有特別要求，可以是氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀，重量百分濃度最好在1-10％，加入量使堿與絲狀菌體的重量比為0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，攪拌10分鐘-4小時(shí)，收集菌體，可以采用離心或過(guò)濾的方法收集菌體。
(2)酸水解在步驟(1)收集的菌體中加入重量百分濃度為15-98％的酸，最好是15-37％的鹽酸、或40-98％硫酸或硝酸，加入的量使酸與絲狀菌體的重量比為0.4∶1-15∶1，在50-100℃的條件下，水解反應(yīng)1-10小時(shí)，除去殘?jiān)?。反?yīng)最好是在回流或密閉條件下進(jìn)行，以防止溶液蒸發(fā)，降低酸的濃度。
(3)脫酸將步驟(2)的水解液脫酸，至pH值大于等于1.0?？刹捎谜婵諟p壓蒸餾的方法除去酸水解后溶液中殘余的酸，也可采用離子交換法脫酸。
(4)殼低聚糖的干燥將(3)中的溶液干燥制得殼低聚糖?？刹捎谜婵崭稍?、噴霧干燥、氣流干燥或冷凍干燥等干燥方法進(jìn)行處理得到殼低聚糖產(chǎn)品。
本發(fā)明以青霉素、檸檬酸和乳酸發(fā)酵廢菌絲體為原料生產(chǎn)殼聚糖及殼低聚糖的工藝，所得產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，不僅大大降低了殼聚糖和殼低聚糖的生產(chǎn)成本、工藝簡(jiǎn)單，而且也是變廢為寶，經(jīng)分析青霉素、檸檬酸和乳酸發(fā)酵菌絲體中含有10％以上的殼聚糖。我國(guó)每年廢棄的檸檬酸、青霉素或乳酸發(fā)酵的菌絲體就達(dá)30萬(wàn)噸以上，若用于制備殼聚糖和殼低聚糖，對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。
菌絲體提取殼聚糖與蝦殼提取的殼聚糖質(zhì)量的比較如下
由此知菌絲體提取的殼聚糖分子量較低，但脫乙酰度較高。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的描述實(shí)施例1青霉素發(fā)酵菌絲體1g，加入12mL 1％NaOH，在70℃下攪拌30分鐘，離心除去上清液，在菌體中加入10mL 50％NaOH，在130℃下回流處理3小時(shí)，離心除去上清液，用水洗滌菌體到中性，加入10mL 2％HAc溶液，在80℃下攪拌1小時(shí)，離心除去菌體，收集上清液，用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH到8.0～9.0，攪拌沉淀30分鐘，離心收集沉淀，真空干燥后可得到60mg殼聚糖。
實(shí)施例2檸檬酸發(fā)酵菌絲體1g，加入10mL 1％NaOH，在60℃下攪拌3小時(shí)，離心除去上清液并用水洗滌至上清液無(wú)色，加入35％NaOH 10mL在140℃下處理2小時(shí)，離心并洗滌菌體至中性，加入10mL5％乙酸，在100℃下攪拌3小時(shí)，離心收集上清液，用5mL 5％乙酸再次萃取一次，合并兩次萃取液，經(jīng)噴霧干燥可得到80mg殼聚糖。
實(shí)施例31g青霉素發(fā)酵菌絲體，加入120mL 1％NaOH在70℃下攪拌30分鐘，離心除去上清液，在菌絲體中加入100mL濃鹽酸(12moL/L)，在80℃下回流反應(yīng)70分鐘，過(guò)濾除去未反應(yīng)的殘?jiān)?，用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在70℃下蒸干，加入50mL無(wú)離子水溶解后再次真空濃縮，如此反復(fù)數(shù)次濃縮直到溶液pH為2.0時(shí)，噴霧干燥即可得到殼低聚糖產(chǎn)品。
經(jīng)分析知?dú)さ途厶堑慕M成成分分布如下
實(shí)施例41g檸檬酸發(fā)酵菌絲體，加入100mL 5％NaOH在100℃下攪拌3小時(shí)，離心移取上清液。在菌絲體中加入120mL濃鹽酸(12mol/L)，在70℃下回流反應(yīng)100分鐘，過(guò)濾除去未反應(yīng)的殘?jiān)锨逡和ㄟ^(guò)φ2.0cm×20cm的731樹(shù)脂陰離子交換柱，收集流出液，真空濃縮至5mL，經(jīng)冷凍干燥可得到殼低聚糖產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1一種殼聚糖的制備方法，依次包括以下步驟(1)將絲狀菌體加入稀堿溶液中，堿與絲狀菌體的重量比為0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，攪拌10分鐘-4小時(shí)，收集菌體；(2)在步驟(1)收集的菌體中加入重量百分濃度為10-70％的濃堿溶液，堿與絲狀菌體的重量比為0.5∶1-14∶1，在50-200℃條件下，反應(yīng)1-5小時(shí)，收集菌體；(3)在步驟(2)收集的菌體中加入重量百分濃度為1-30％的酸進(jìn)行萃取，酸與絲狀菌體的重量比為0.05∶1-3∶1，收集上清液；(4)將萃取上清液的pH值調(diào)節(jié)到大于或等于6.0或加入C1-C6的醇或C3-C6的酮進(jìn)行沉淀，收集沉淀物制得殼聚糖。
2根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征是所說(shuō)的絲狀菌體為青霉素發(fā)酵的青霉菌、檸檬酸發(fā)酵的黑曲霉菌或乳酸發(fā)酵的根霉菌。
3根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征是步驟(1)中的稀堿溶液為重量百分濃度為1-10％的氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀溶液；步驟(2)中的濃堿溶液為重量百分濃度為30-60％的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，且反應(yīng)在回流或密閉條件下進(jìn)行；步驟(3)中的酸為有機(jī)酸或鹽酸，重量百分濃度為1-20％；步驟(4)中的有機(jī)溶劑為丙酮、乙醇或丙醇。
4一種殼低聚糖的制備方法，依次包括以下步驟(1)將絲狀菌體加入稀堿溶液中，堿與絲狀菌體的重量比為0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，攪拌10分鐘-4小時(shí)，收集菌體；(2)在步驟(1)收集的菌體中加入重量百分濃度為15-98％的酸，酸與絲狀菌體的重量比為0.4∶1-15∶1，在50-100℃的條件下，水解反應(yīng)1-10小時(shí)，除去殘?jiān)?3)將(2)的水解液脫酸，至pH值大于等于1.0；(4)將(3)中的溶液干燥制得殼低聚糖。
5根據(jù)權(quán)利要求3.的制備方法，其特征是所說(shuō)的絲狀菌體為青霉素發(fā)酵的青霉菌、檸檬酸發(fā)酵的黑曲霉菌或乳酸發(fā)酵的根霉菌。
6根據(jù)權(quán)利要求3或4的制備方法，其特征是步驟(2)中的酸為重量百分濃度為15％-37％的鹽酸或40-98％的硫酸或硝酸，且水解反應(yīng)在回流或密閉條件下進(jìn)行，反應(yīng)1-4小時(shí)；步驟(3)中水解液采用真空減壓蒸餾或離子交換法脫酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖和殼低聚糖的制備方法。本發(fā)明以青霉素、檸檬酸或乳酸發(fā)酵后的廢絲狀菌體為原料,分別經(jīng)細(xì)胞破碎、脫乙?；?、萃取和細(xì)胞破碎、酸水解、脫酸、干燥制得殼聚糖和殼低聚糖。本發(fā)明的方法工藝簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、易于工業(yè)化,不但大大降低了生產(chǎn)成本,而且還變廢為寶,對(duì)環(huán)境保護(hù)也非常有益。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1242377SQ9810288
公開(kāi)日2000年1月26日 申請(qǐng)日期1998年7月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月20日
發(fā)明者譚天偉, 戚以政, 羅暉, 王炳武, 鄧?yán)? 許偉堅(jiān), 張淑榮 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)