專利名稱：一種從含有無(wú)活性蛋白的溶液中回收生物活性形式重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的說(shuō)來(lái)涉及一種從含有無(wú)活性蛋白的溶液中回收天然的、生物活性形式重組蛋白的方法。
本領(lǐng)域中已公知制備重組蛋白的方法;應(yīng)用重組技術(shù)可將編碼某種特定蛋白的異源DNA片段插入宿主微生物中。在能誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物，可以產(chǎn)生如胰島素、生長(zhǎng)激素、白介素、干擾素、促生長(zhǎng)因子等異源蛋白。
遺憾的是，由轉(zhuǎn)化微生物產(chǎn)生的異源蛋白常常沒(méi)有生物活性，因?yàn)檫@些蛋白在微生物內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)并沒(méi)有折疊成正確的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這些異源蛋白傾向于形成聚集體，這些聚集體在細(xì)胞內(nèi)可被識(shí)別為“包涵體”(有時(shí)也稱為“折射體”和/或“蛋白粒”)。連接數(shù)個(gè)蛋白分子的共價(jià)分子間二硫鍵的形成，產(chǎn)生了不溶性的復(fù)合體，這可能也是這些包涵體形成的原因。包涵體一般含有大部分異源蛋白和小部分污染的宿主微生物蛋白。
現(xiàn)已建立了數(shù)種方法，以從微生物中提取包涵體，并將其中所含的異源蛋白轉(zhuǎn)化成具有與天然母本蛋白或非重組蛋白一致的具有天然生物活性的蛋白。這些方法一般涉及破碎微生物細(xì)胞;從細(xì)胞碎片中分離出包涵體;在變性劑和/或還原劑存在下使包涵體蛋白變性和/或還原，使蛋白展開而將其自身與不溶性的污染物分離;去除溶液中的還原劑或降低其濃度;在變性劑存在下氧化已還原和變性的蛋白溶液，去除變性劑，從而使異源蛋白重新折疊成三級(jí)構(gòu)象;從仍存在于溶液中的污染蛋白中分離出該異源蛋白。
遵循上述一般性步驟的許多重組蛋白回收和純化方案在本領(lǐng)域中都是已知的。
Yokoo等人的美國(guó)專利4，985，544公開了一種從包涵體中重新激活天然形式的含半胱氨酸蛋白的方法。該方法包括在既有變性劑又有還原劑存在下使蛋白溶解，去除還原劑，氧化蛋白，隨后去除變性劑，使蛋白重新折疊成其天然構(gòu)象。所公開的可能的變性劑為SDS、尿素、鹽酸胍、酸和堿，而所提出的還原劑包括單價(jià)硫醇，例如β-巰基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽和二硫蘇糖醇(DTT)。在所列出的還原劑中，特別優(yōu)選DTT。氧化步驟可以通過(guò)充氣進(jìn)行空氣氧化而完成。
在Yokoo等人的實(shí)施例中，說(shuō)明了分別選用尿素和DTT作為變性劑和還原劑。Yokoo等人的方法的缺點(diǎn)在于，該方法在氧化步驟之前，需要進(jìn)行在變性劑存在下有選擇地完全去除還原劑這一棘手的步驟，該步驟優(yōu)選凝膠過(guò)濾法。
K.Olson的美國(guó)專利4，518，526、Builder等人的美國(guó)專利4，511，502和4，620，948以及Wetzel等人的美國(guó)專利4，599，197，都涉及折射性異源蛋白的溶解和純化，其中，將蛋白用變性溶液處理，該溶液可以包含作為可能變性劑的SDS。然后，任選在還原劑存在下，通過(guò)稀釋變性溶液使蛋白重新折疊。所包括的作為可能還原劑的物質(zhì)為β-巰基乙醇。
P.Ghosh-Dastidar的美國(guó)專利4，766，205涉及一種使天然和重組來(lái)源的含多個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有生物活性的天然構(gòu)象的方法。在用變性劑和還原劑對(duì)所感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理后，降低還原劑的濃度，同時(shí)引入含有二硫鍵的、能形成加合物的化合物。含有二硫鍵的化合物與還原的半胱氨酸殘基反應(yīng)，在去除還原劑的同時(shí)，形成了穩(wěn)定的中間加成產(chǎn)物。該專利公開了含有單、雙或多官能團(tuán)的含巰基試劑為合適的還原劑，如β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇。最優(yōu)選的還原劑為β-巰基乙醇。適宜的能形成二硫鍵加合物的化合物包括胱胺、氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、亞硫酸鈉等。
在穩(wěn)定的加合物形成后，可重新形成天然的胱氨酸二硫鍵，在溫和的氧化/還原環(huán)境中，蛋白質(zhì)可重新折疊成其天然構(gòu)象，這種溫和的氧化/還原環(huán)境包括適宜pH下的弱還原劑和弱氧化劑。適用于這種處理的弱還原劑包括半胱氨酸，而適用于這種處理的弱氧化劑包括大氣氧。
本領(lǐng)域內(nèi)需要提高由含有無(wú)活性的、不正確折疊蛋白的溶液中回收的生物活性蛋白的產(chǎn)率。
本發(fā)明描述了一種提高從含有無(wú)活性蛋白的溶液中獲得的生物活性蛋白產(chǎn)率的新方法。無(wú)活性蛋白可以是以不溶性的包涵體形式存在，也可以是以氧化的、錯(cuò)誤折疊的和聚集的無(wú)用蛋白的形式存在。
本發(fā)明方法是以用第一堿性緩沖液稀釋無(wú)活性蛋白這一步開始的。將稀釋了的無(wú)活性蛋白用作為變性劑的SDS和作為還原劑的L-半胱氨酸進(jìn)行處理，以同時(shí)溶解和還原蛋白質(zhì)。用部分透濾法(partialdiafiltration)將含有已溶解和還原的蛋白的溶液相對(duì)于不含變性劑和還原劑的第二堿性緩沖液進(jìn)行透濾，從而降低溶液中SDS和L-半胱氨酸的濃度。變性和還原了的蛋白繼而被氧化，形成了與天然存在的生物活性蛋白一致的二硫鍵。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用第一堿性緩沖液將含有無(wú)活性蛋白的溶液稀釋至蛋白濃度約為0.1-1.0mg/ml。然后用約0.05%至約1.0%的SDS和約5mM至約25mM的L-半胱氨酸處理稀釋了的無(wú)活性蛋白。將含有已溶解和還原的蛋白的溶液相對(duì)于約0.5至3倍體積的不含變性劑和還原劑的第二堿性緩沖液進(jìn)行透濾，使溶液中的SDS和L-半胱氨酸的濃度下降約70%至約90%。變性和還原了的蛋白繼而被空氣氧化，形成與天然存在的生物活性蛋白一致的二硫鍵。
本發(fā)明的方法可用于有效而經(jīng)濟(jì)地提高在轉(zhuǎn)化微生物中以不溶性的無(wú)生物活性包涵體形式產(chǎn)生的生物活性蛋白的回收率，這種轉(zhuǎn)化微生物是指那些已用指導(dǎo)異源蛋白編碼基因表達(dá)的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的微生物。本發(fā)明的方法特別可用于將無(wú)生物活性的、氧化的、錯(cuò)誤折疊的和聚集的無(wú)用蛋白轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物，尤其是以其天然生物活性形式存在的所需蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步可用于直接從包涵體成功地回收氧化的單體。
“無(wú)用蛋白”是指在象本領(lǐng)域已知的回收技術(shù)所規(guī)定的那樣氧化包涵體蛋白的已溶解和還原的溶液后，與正確折疊的生物活性蛋白一同形成的無(wú)活性的、氧化的、錯(cuò)誤折疊的和聚集的蛋白。具體地說(shuō)，無(wú)用蛋白是由于所回收的包涵體蛋白非共價(jià)聚集和/或分子間或分子內(nèi)共價(jià)多聚而產(chǎn)生的。本發(fā)明可用于再循環(huán)無(wú)用蛋白，以制備正確折疊的單體產(chǎn)物。
可用本發(fā)明方法獲得的生物活性蛋白包括動(dòng)物生長(zhǎng)激素，例如牛、豬、鳥、羊或人的生長(zhǎng)激素。
應(yīng)該理解，本文泛泛地提到蛋白質(zhì)或提到具體的蛋白質(zhì)如牛和豬生長(zhǎng)激素并不是要局限于含有天然蛋白的完整氨基酸順序的分子，而是還包括去掉了順序中不同部分的蛋白質(zhì)片段，以及在其天然順序中進(jìn)行了不同置換和修飾(即類似物)但并不破壞分子的生物活性的蛋白質(zhì)或其片段。
該方法的第一步包括用第一堿性緩沖液稀釋無(wú)活性蛋白，以降低蛋白質(zhì)濃度并調(diào)整蛋白質(zhì)溶液的pH值。優(yōu)選的緩沖液為由等重量的碳酸鈉(Na2CO3)和碳酸氫鈉(NaHCO3)組成的碳酸鹽緩沖液，其濃度一般優(yōu)選為約35mM至約60mM，更優(yōu)選為約40mM至約50mM，最優(yōu)選為約46mM。第一緩沖液的pH優(yōu)選為約9至約11，更優(yōu)選為約9.6至約10，最優(yōu)選為約9.8。緩沖液稀釋后蛋白質(zhì)的濃度優(yōu)選為約0.1至約1.0mg/ml，更優(yōu)選為約0.3至約0.6mg/ml。這可能要求稀釋度為約1∶1.1至約1∶40，當(dāng)無(wú)活性蛋白以氧化的、錯(cuò)誤折疊的以及聚集的無(wú)用蛋白形式存在時(shí)，稀釋度一般為約1∶5;當(dāng)無(wú)活性蛋白以不溶性的包涵體形式存在時(shí)，稀釋度一般為約1∶40。
起始的稀釋步驟為本方法創(chuàng)造了有利的環(huán)境。蛋白質(zhì)的濃度似乎很強(qiáng)地影響隨后的溶解/還原和再氧化步驟的效率。稀釋使蛋白質(zhì)濃度降低，以而增加了蛋白分子間的距離。具體地說(shuō)，蛋白質(zhì)濃度降低使共價(jià)和非共價(jià)的分子間相互作用都減小到最低程度。因而，稀釋后的溶液促進(jìn)了正確的分子內(nèi)相互作用，導(dǎo)致形成正確的二硫鍵。
下一步用變性劑SDS和還原劑L-半胱氨酸處理稀釋的無(wú)活性蛋白，以同時(shí)溶解和還原所需蛋白。加入SDS是為了破壞非共價(jià)相互作用，而加入L-半胱氨酸是為了使共價(jià)錯(cuò)配的分子間和分子內(nèi)二硫鍵解離成為巰基。SDS的濃度最好為約0.05%至約1.0%，最優(yōu)選為約0.2%(重量/體積)，而L-半胱氨酸的濃度優(yōu)選為約5mM至約25mM，最優(yōu)選為約15mM。
其它還原劑，尤其是二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇(βME)以及還原型和氧化型谷胱甘肽，也廣泛地用于控制已還原蛋白質(zhì)的再氧化。然而，DTT非常昂貴(Sigma公司產(chǎn)品每100克563.50美元)，并且由于它有吸濕性而造成貯存困難，使該試劑不適宜用于大規(guī)模生產(chǎn)。另一方面，βME雖然便宜(Sigma公司產(chǎn)品每升32.15美元)，但由于有令人不快的特征性氣味，也不受歡迎。更重要的是，在本方法中將βME(20mM)作為還原劑使用時(shí)，它常常由于形成異常穩(wěn)定的再折疊中間產(chǎn)物而對(duì)再折疊過(guò)程有不利影響。這種再折疊中間產(chǎn)物與大量的殘余還原單體(RM)一起，甚至在氧化48小時(shí)后也常常依然存在。
用半胱氨酸(L-半胱氨酸)作為還原劑，避免了上述的所有問(wèn)題。其價(jià)格合理(味之素公司產(chǎn)品每千克77.00美元)。另外，半胱氨酸為天然氨基酸，并制備成在堿性pH下易溶于水溶液的、穩(wěn)定的干燥晶體。而且，可以獲得大量的食品化學(xué)藥典級(jí)半胱氨酸。半胱氨酸還易于氧化成公認(rèn)的氧化劑胱氨酸，尤其是在要求保護(hù)的方法中出現(xiàn)的堿性pH條件下(巰基的pKa為8.3)。因?yàn)?，任何殘余物?wèn)題都可以減少至最低程度。另外，胱氨酸的存在改善了蛋白質(zhì)溶液隨后的氧化。
進(jìn)行上述反應(yīng)所需的時(shí)間，取決于無(wú)活性蛋白是以不溶性的包涵體形式存在，還是以氧化的、錯(cuò)誤折疊的和聚集的無(wú)用蛋白形式存在。對(duì)于包涵體，反應(yīng)時(shí)間一般需要2-3小時(shí)，而對(duì)于無(wú)用蛋白，45-60分鐘一般就足夠了。
上述反應(yīng)進(jìn)行足夠時(shí)間后，以透濾法，優(yōu)選部分透濾法，使含有已溶解和還原的蛋白的溶液中SDS和L-半胱氨酸的濃度降低，這種透濾法一般是相對(duì)于約0.5至約3倍體積(優(yōu)選約1倍體積)的不含變性劑和還原劑的第二堿性緩沖液進(jìn)行的。第二堿性緩沖液的緩沖鹽濃度優(yōu)選為約35mM至約60mM，更優(yōu)選約40mM至約50mM，最優(yōu)選約46mM;其pH值優(yōu)選約9至約11，更優(yōu)選約9.6至約10，最優(yōu)選約9.8。部分透濾操作使SDS和L-半胱氨酸的濃度在氧化步驟前都減少了約70%至約90%，優(yōu)選約80%。如實(shí)施例4所示，相對(duì)于高于要求保護(hù)的方法中所述體積的緩沖液進(jìn)行透濾將導(dǎo)致所需氧化蛋白單體產(chǎn)率顯著降低。
透濾法的優(yōu)點(diǎn)在于可使低分子量物質(zhì)如SDS和L-半胱氨酸的濃度降低，而高分子量物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濃度則不受影響。
SDS和L-半胱氨酸濃度的降低為隨后進(jìn)行的再氧化步驟創(chuàng)造了有利的環(huán)境。此外，通過(guò)將蛋白溶液調(diào)整至優(yōu)選為約9.8的堿性pH值，可使留在溶液中的半胱氨酸自然轉(zhuǎn)化為胱氨酸，從而改善了隨后的氧化反應(yīng)以及所需氧化蛋白單體的最終產(chǎn)率。
下一步，在空氣存在下將所產(chǎn)生的已溶解和還原的蛋白單體氧化成正確折疊的氧化單體，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選約24小時(shí)。這種氧化單體含有與天然存在的生物活性蛋白一致的二硫鍵。如上所述，因?yàn)樵谌缫蟊Ｗo(hù)的方法中所要求的堿性pH條件下，半胱氨酸自發(fā)氧化成已知的氧化劑胱氨酸，所以不需要另加氧化劑。在氧化反應(yīng)發(fā)生足夠時(shí)間后，可使所得溶液通過(guò)裝有樹脂如Amberlite
IRA-400的離子交換柱，以去除所有殘余的SDS。然后，可對(duì)含有聚集體衍生單體的流出液進(jìn)行所需的后續(xù)處理步驟。
本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了一般性描述，下面的實(shí)施例給出了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，其目的在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施及其優(yōu)點(diǎn)?？梢岳斫?，實(shí)施例是以舉例說(shuō)明的方式給出的，決不是要對(duì)說(shuō)明書和權(quán)利要求書進(jìn)行限制。
實(shí)施例1用pH9.8的46mM碳酸鹽緩沖液，以1∶5的稀釋度稀釋無(wú)用蛋白溶液，所述緩沖液含有21mM碳酸鈉和25mM碳酸氫鈉，而所述無(wú)用蛋白溶液則含有豬生長(zhǎng)激素(pST)的共價(jià)和非共價(jià)聚集體以及少量的pST氧化單體。下一步加入0.2%(W/V)SDS和15mM半胱氨酸(L-半胱氨酸)，使無(wú)用蛋白溶解和還原。應(yīng)用上述濃度的SDS和半胱氨酸，溶解/還原反應(yīng)基本上在約1小時(shí)內(nèi)完成。下一步在室溫下用聚砜膜PM10(截留分子量為10，000道爾頓)，相對(duì)于另一46mM碳酸鹽緩沖液進(jìn)行1倍體積的透濾，使SDS和半胱氨酸的濃度迅速降低。經(jīng)過(guò)透濾后，溶液的環(huán)境在pH值、pST濃度以及SDS和半胱氨酸/胱氨酸濃度等方面，對(duì)于還原pST的自發(fā)再折疊均為最佳。
然后，使含有已溶解和還原的pST的溶液進(jìn)行環(huán)境空氣氧化約24小時(shí)，接著使溶液通過(guò)Amberlite
IRA-400柱，以去除殘余SDS。然后，對(duì)含有聚集體衍生單體的流出液進(jìn)行后續(xù)的處理步驟，包括超濾和層析，以制備純化的單體pST。


圖1A-1E顯示了本方法每一步驟的高壓液相色譜(HPLC)的色譜圖。圖1A代表以1∶5稀釋的無(wú)用蛋白溶液。如圖1B中的色譜圖所畫出的，在0.2%SDS變性和15mM半胱氨酸還原1小時(shí)后，原來(lái)存在于圖1A中的代表氧化單體(OM)的峰消失，而出現(xiàn)了代表還原單體(RM)的更大的峰。這表明，在無(wú)用蛋白溶液中存在的pST聚集體和氧化單體均已被有效還原。如圖1C所示，在1倍體積透濾后，OM峰顯著增大，而RM峰減小。在再氧化13(圖1D)和24(圖1E)小時(shí)后，RM峰基本消失，而OM峰大致增至初始OM峰的約3倍。這表明已成功地完成了再氧化。如圖1E所示的數(shù)據(jù)所表明的，1.55克/升OM源自起初存在于稀釋的無(wú)用蛋白溶液(如圖1A所示)中的0.53克/升OM。這種增加歸因于pST聚集體轉(zhuǎn)化為pST單體。
實(shí)施例2圖2A給出了兩幅得自凝膠滲透色譜(GPC)的色譜圖，其中之一是在實(shí)施例1的聚集體再循環(huán)過(guò)程之前完成的，另一幅則是在其后完成的。實(shí)線代表未稀釋的無(wú)用蛋白溶液，而虛線代表得自Amberlite IRA-400柱的產(chǎn)物流出液。圖2B所報(bào)告的數(shù)字給出了GPC單體(GM)的ppm數(shù)以及pST聚合物或高分子量雜質(zhì)與pST單體的比率。這一稱為P/M比率的比率，被用來(lái)度量樣本的純度。P/M比率越小，樣本越純。
圖2A和2B表明，當(dāng)將含有174ppmGM和大量pST聚集體、P/M比率為42.4的無(wú)用蛋白溶液，按照實(shí)施例1的聚集體再循環(huán)方法進(jìn)行處理時(shí)，GM增加10倍而達(dá)到1695ppm，而P/M比率降至4.1。GM和P/M的這一劇烈變化是由于pST聚集體轉(zhuǎn)化成pST單體。
實(shí)施例3將含有δ7-pST(在氨基酸順序的N末端缺失頭7個(gè)氨基酸的pST)的包涵體從大腸桿菌菌株HB101中分離出來(lái)，該菌株是在美國(guó)專利4，788，144所公開的δ7-pST制備條件下進(jìn)行培養(yǎng)的。將細(xì)胞從發(fā)酵液中離心出來(lái)，并再懸浮于pH7.8的含20mMEDTA的0.1M磷酸鈉緩沖液中，在8，000-10，000磅/平方英寸的壓力下，使細(xì)胞兩次通過(guò)Manton-Gaulin勻漿器以裂解細(xì)胞。將粗制的包涵體再次離心出來(lái)，并用pH7.5、含10mMEDTA的0.176M磷酸鈉緩沖液再洗滌兩次，每次洗滌后進(jìn)行離心。經(jīng)過(guò)洗滌的包涵體用pH9.8的46mM碳酸鹽緩沖液以1∶40稀釋度稀釋，該緩沖液含21mM碳酸鈉和25mM碳酸氫鈉。下一步加入0.2%(W/V)SDS和15mML-半胱氨酸，使包涵體溶解和還原。在室溫下攪拌混合物2小時(shí)15分。在溶解和還原結(jié)束后，HPLC分析表明RM為16.8克/升，而OM消失。然后在室溫下將混合物用PM10膜對(duì)1倍體積的另一46mM碳酸鹽緩沖液進(jìn)行透濾。HPLC分析表明透濾液含有14.4克/升RM和0.96克/升OM。
然后，對(duì)經(jīng)過(guò)透濾的溶液進(jìn)行環(huán)境空氣氧化約20小時(shí)。在氧化反應(yīng)結(jié)束后，OM大致增至10.0克/升，RM降至0.52克/升。這表明氧化反應(yīng)實(shí)質(zhì)上已完成。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明可用于從包涵體中回收氧化的單體。
實(shí)施例4用pH9.8的46mM碳酸鹽緩沖液，以1∶5的稀釋度稀釋無(wú)用蛋白溶液，所述緩沖液含有21mM碳酸鈉和25mM碳酸氫鈉，而所述無(wú)用蛋白溶液則含有pST的共價(jià)和非共價(jià)聚集體以及pST的氧化單體。稀釋的無(wú)用蛋白溶液中OM的濃度，經(jīng)HPLC測(cè)定為0.26克/升。下一步加入0.16%(W/V)SDS和13mML-半胱氨酸，使無(wú)用蛋白溶液溶解和還原。在室溫下攪拌混合物約3小時(shí)，然后在室溫下將混合物用PM10膜對(duì)15倍體積的另一46mM碳酸鹽溶液進(jìn)行透濾，以完全去除SDS和L-半胱氨酸。
在2倍、4倍和15倍體積緩沖液交換后，從樣本中取等分試樣。它們分別代表了“部分”(70-90%)、“基本”(90-99%)和“全部”(100%)去除了溶解劑(SDS)和還原劑(L-半胱氨酸)。所有試樣在室溫下和空氣存在下氧化24小時(shí)，然后用HPLC法分析OM濃度。2倍、4倍和15倍體積樣本的HPLCOM分別為0.38、0.29和0.075克/升。以RM的所有峰消失證實(shí)所有氧化均已完成。
此結(jié)果表明，完全去除溶解劑和還原劑會(huì)對(duì)所需蛋白單體的高收率回收產(chǎn)生不利影響。
實(shí)施例5用pH9.8的46mM碳酸鹽緩沖液，以1∶5的稀釋度稀釋無(wú)用蛋白溶液，所述緩沖液含有21mM碳酸鈉和25mM碳酸氫鈉，而所述無(wú)用蛋白溶液則含有pST的共價(jià)和非共價(jià)聚體以及pST的氧化單體。HPLC分析表明稀釋的無(wú)用蛋白溶液中OM濃度為0.15克/升。下一步加入0.5(W/V)SDS、60毫克/升EDTA和40mML-半胱氨酸，使無(wú)用蛋白溶液溶解和還原。在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。HPLC分析表明，在溶解和還原結(jié)束后，RM為0.68克/升。
在有空氣存在和室溫的條件下，氧化混合物24小時(shí)，這一過(guò)程中并不去除溶解劑或還原劑。HPLC分析表明RM仍有0.42克/升，而OM則沒(méi)有測(cè)出。
該結(jié)果表明不降低溶解劑和還原劑的濃度，就不能達(dá)到成功的氧化，也不能達(dá)到所需蛋白單體的高收率回收。
權(quán)利要求
1.一種從含有無(wú)生物活性蛋白的溶液中制取天然生物活性形式重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟a)用第一堿性緩沖液稀釋無(wú)活性蛋白溶液；b)用足量的變性劑SDS和還原劑L-半胱氨酸處理稀釋后的蛋白，以同時(shí)溶解和還原所說(shuō)的蛋白；c)通過(guò)相對(duì)于第二堿性緩沖液進(jìn)行透濾，使所得到的溶液中SDS和L-半胱氨酸的濃度下降約70%至約90%；d)氧化(c)步驟的已變性和還原的蛋白，以形成與天然存在的生物活性蛋白一致的二硫鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)和(c)中的緩沖液的濃度為約35mM至約60mM，pH值為約9至約11。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(a)和(c)中的緩沖液的濃度為約40mM至約50mM，pH值為約9.6至約10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)的緩沖液稀釋后，無(wú)活性蛋白的濃度為約0.3mg/ml至約0.6mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中變性劑為約0.05%至約1.0%的SDS。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中變性劑為約0.2%SDS。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還原劑為約5mM至約25mM的L-半胱氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中還原劑為約15mM的L-半胱氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的SDS和L-半胱氨酸濃度的下降是通過(guò)相對(duì)于約0.5至約3倍體積的所說(shuō)第二緩沖液進(jìn)行透濾而發(fā)生的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)的氧化是在空氣存在下發(fā)生的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)為生長(zhǎng)激素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中生長(zhǎng)激素為牛、豬、鳥、羊或人生長(zhǎng)激素。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中生長(zhǎng)激素為豬生長(zhǎng)激素。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的無(wú)活性蛋白以不溶性包涵體形式存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的無(wú)活性蛋白是氧化的、錯(cuò)誤折疊的和聚集的無(wú)用蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從含有無(wú)活性蛋白的溶液中制取天然生物活性形式重組蛋白的方法，無(wú)活性蛋白以不溶性包涵體或氧化的、錯(cuò)誤折疊的和聚集的無(wú)用蛋白形式存在，該方法包括用第一堿性緩沖液稀釋無(wú)活性蛋白溶液，加入SDS和L-半胱氨酸以同時(shí)溶解和還原該蛋白，相對(duì)第二堿性緩沖液進(jìn)行透濾使SDS和L-半胱氨酸的濃度下降約70％—90％，氧化已變性和還原的蛋白以形成與天然存在的生物活性蛋白一致的二硫鍵。
文檔編號(hào)C07K1/113GK1083071SQ9310805
公開日1994年3月2日 申請(qǐng)日期1993年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月2日
發(fā)明者E·李, D·A·施維拉, R·-D·楊 申請(qǐng)人:皮特曼-穆爾有限公司