專利名稱：用于制備α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽的“一勺燴”方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(α)APM(HCl)的“一勺燴”反應(yīng)法，該鹽酸鹽用于制備α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(α-APM)，后者是一種甜味劑，其甜度約是蔗糖的200倍。這種二肽化合物的增甜效果極佳，與普通糖相比，只要非常少的一點(diǎn)量就足以使食品或飲料出現(xiàn)甜味。其結(jié)果是使廣大消費(fèi)者在不必放棄享受甜品的同時(shí)，可以減少攝取熱量。與其他甜味劑(如糖精，環(huán)己基氨基磺酸鹽)相比，這種二肽化合物也沒有不良回味現(xiàn)象。另外，本發(fā)明還涉及增加APM(HCl)α/β比例的方法，以及生產(chǎn)具有易流動的粘度的最終反應(yīng)混合物(α/β)APM(HCl)的方法。
α-APM是已知化合物，1970年授予Schlatter的美國專利3，492，131號對它作了描述。從那時(shí)起不斷涌現(xiàn)出大量的涉及各種制備方法及相關(guān)化合物的其他專利，并且文獻(xiàn)報(bào)道之多也預(yù)示了這種二肽對低熱量甜味劑工業(yè)的巨大影響。但是至今為止，制備方法一直局限于高成本的離析和回收方法，這一負(fù)擔(dān)必然地轉(zhuǎn)嫁到消費(fèi)者身上。與先有技術(shù)相比，采用本發(fā)明方法在不必離析中間體的同時(shí)，可以類似的產(chǎn)率得到所期望的最終產(chǎn)物。
α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯是一種基本上由兩種氨基酸，即，L-天冬氨酸和L-丙氨酸組成的二肽。一個(gè)時(shí)期以來人們認(rèn)為該二肽的增甜性能取決于上述各單體氨基酸的立體化學(xué)。這兩種氨基酸中每一種氨基酸既可以以D式也可以L式存在，并且已經(jīng)確認(rèn)L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸酯具有甜味，而相應(yīng)的D-D，D-L和L-D異構(gòu)體則沒有。將含有L-L二肽的各異構(gòu)體混合，也就是說將DL-天冬氨酰-L-苯丙氨酸，L-天冬氨酰-DL-苯丙氨酸和DL-天冬氨酰-DL-苯丙氨酸混合，它們可產(chǎn)生甜味，但甜度只是該二肽的一半，其原因是外消旋體中只含有1/2的L-L體。
通過將天冬氨酸與L-苯丙氨酸或其甲酯連接在一起的偶合反應(yīng)可以制得上述二肽，該偶合反應(yīng)需要在天冬氨酸部分接上氨基保護(hù)基，例如，甲酰基，乙?；?，乙酰乙?；S基，取代或未取代的芐酯基，叔丁氧羰基，和氫鹵酸鹽。用于本發(fā)明目的的氨基保護(hù)基(在本領(lǐng)域常稱之為N-保護(hù)基)應(yīng)稱之為N-甲?；?，其原因是甲?；糠质潜景l(fā)明的封鎖劑。甲酰化的天冬氨酸酐是一種廣泛采用的起始原料，并且該方法已有很多描述(參見美國專利4，175，562號)。
在溶劑中進(jìn)行的該偶合反應(yīng)是下述生產(chǎn)α-L-天冬酰-L-苯丙氨酸甲酯(α-APM)的幾種專利方法中一步共同反應(yīng);參見;美國專利3，962，207號(Uchiyama)，美國專利4，173，562號(Bachman)，歐洲專利127，411號(Yaichi等)，所有這些均引為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。在兩個(gè)氨基酸進(jìn)行偶合反應(yīng)的過程中，產(chǎn)生兩種異構(gòu)體作為中間體，并且，它們的立體化學(xué)最終決定了具體分子的甜度。α-異構(gòu)體是所期望的產(chǎn)物，從中離析出的純α-APM所具有的甜度約是普通糖的200倍。而β-異構(gòu)體則沒有這么高的甜度。本發(fā)明的目標(biāo)是改進(jìn)α-APM的制備方法，以期以更低的生產(chǎn)成本，更高的產(chǎn)率制備所期望的最終產(chǎn)物-α-異構(gòu)體。
APM的α和β異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)如下
α異構(gòu)體β異構(gòu)體
已知，由該偶合反應(yīng)所形成的α和β異構(gòu)體，以及各異構(gòu)體的比例取決于用于該反應(yīng)的溶劑種類、發(fā)生該反應(yīng)的溫度和所用溶劑的量。根據(jù)美國專利4，173，562號(Bachman)，當(dāng)采用乙酸作為溶劑在50℃進(jìn)行偶合反應(yīng)時(shí)，α/β異構(gòu)體比例可以達(dá)到75∶25。乙酸對苯丙氨酸的摩爾比必須至少為10∶1。當(dāng)乙酸對L-苯丙氨酸的摩爾比降至6∶1時(shí)，α/β異構(gòu)體比例突然下降到69/31。本發(fā)明表明如果用烷基酯、位阻醇或它們的混合物部分地代替乙酸作為偶合反應(yīng)的溶劑，α/β比例可以增至約80/20。為此，本發(fā)明所采用的位阻醇應(yīng)該是指仲或叔醇。
在本方法中采用這些溶劑所引起的問題是在反應(yīng)0.5至3小時(shí)后，反應(yīng)混合物固化，變得實(shí)際上無法攪拌，或者不可能從反應(yīng)器中取出，可攪拌的體系必須至少滿足兩個(gè)要求，即，一方面攪拌應(yīng)保證反應(yīng)物混合達(dá)到反應(yīng)完全的目的，第二方面是在反應(yīng)后必須能通過蒸餾除去溶劑。
先有技術(shù)所存在的另一個(gè)問題是在某些工藝條件下，由于α-APM仍留在原反應(yīng)液中，因此，會損失25%或更多的α-APM(參見美國專利4，173，562號)。還有一個(gè)問題是在上述美國專利中，由天冬氨酸，大量過量的甲酸和乙酸酐的反應(yīng)混合物來生產(chǎn)甲?；?L-天冬氨酸酐。在反應(yīng)過程的某一點(diǎn)必須要通過蒸餾除去過量的甲酸，并且，從乙酸中分離甲酸勢必要增加最終產(chǎn)物的成本。
美國專利3，962，207號介紹了使L-天冬氨酸酐鹽酸鹽與L-苯丙氨酸甲酯偶合的類似方法，在該方法中所存在的問題是L-苯丙氨酸甲酯的需要量很大，這也使該方法的成本增加。第二，該方法導(dǎo)致形成相當(dāng)量的三肽，由于必須要除去這些三肽而勢必增加成本，并使分離工藝復(fù)雜化。而這一點(diǎn)在本發(fā)明中是不會出現(xiàn)的。
本發(fā)明的目的是提供制備α-APM(HCl)的方法。采用“一勺燴”方法達(dá)到了這一目的，在該方法中，在形成甲?；疞-天冬氨酸酐過程中產(chǎn)生的反應(yīng)副產(chǎn)物同時(shí)作為偶合反應(yīng)的溶劑，由此避免了分離過程所帶來的許多問題，并且使制備成本降低。用酯或位阻醇稀釋該偶合反應(yīng)物料可以提高α-APM(HCl)的收率。
先按類似于先有技術(shù)的方法(參見美國專利3，933，781號，3，962，207號和4，173，562號)使天冬氨酸與乙酸酐和甲酸混合，制得N-甲?；?L-天冬氨酸酐。但是，在本發(fā)明方法中只采用極少量的甲酸(每摩爾天冬氨酸用1.2-1.35摩爾當(dāng)量)，并且，通過加入乙酸酐和異丙醇使其過量部分轉(zhuǎn)化為甲酸異丙酯。
然后，通過加入L-苯丙氨酸(L-Phe)使甲?；奶於彼狒偷嘏己稀Ｈ芜x在偶合反應(yīng)中加入烷基酯或位阻醇可以令人驚奇地改善α/β比例。而且，按通常方式通過醇與酸酐反應(yīng)制備酯，會出現(xiàn)意料之外的結(jié)果，即，在該反應(yīng)過程中，位阻醇不能進(jìn)攻甲酰基天冬氨酸酐。該偶合反應(yīng)可以在低速或無攪拌條件下進(jìn)行，借以保持反應(yīng)混合物的低粘度，以使最終的反應(yīng)混合物為可流動體。
然后，用鹽酸脫去所得二肽的甲酰基，并將甲醇、水和鹽酸的濃度調(diào)節(jié)到有效量，使之發(fā)生酯化反應(yīng)。由此產(chǎn)生高收率的α-APM(HCl)。該αAPM(HCl)從反應(yīng)混合物中沉淀，分離之，用堿中和，形成α-APM。
本發(fā)明涉及制備α-APM(HCl)的改進(jìn)方法。本發(fā)明的“一勺燴”方法，在開始階段是在催化劑(如氧化鎂)存在下，將L-天冬氨酸與最少量的甲酸(以天冬氨酸計(jì)至少為1.2摩爾當(dāng)量)和乙酸酐(以天冬氨酸計(jì)至少為約2.0摩爾當(dāng)量)混合，借以形成N-甲酰基-L-天冬氨酸酐。適宜的催化劑包括金屬的氧化物、氫氧化物和鹽，并且，本文引為參考文獻(xiàn)的美國專利4，508，912號和4，550，180號公開了這些催化劑。該反應(yīng)溫度高至約52℃，最好在50℃左右將該混合物至少攪拌約2.5小時(shí)。約2.5小時(shí)后補(bǔ)加乙酸酐(約0.2mole)，其目的是將所有過量的未反應(yīng)甲酸轉(zhuǎn)化為甲酸-乙酸酐，即，混合酸酐。再過2.5小時(shí)后，加入過量的異丙醇(以加入的甲酸總量計(jì)至少為約0.3摩爾當(dāng)量)使所有的甲酸-乙酸酐轉(zhuǎn)化為甲酸異丙酯。以天冬氨酸計(jì)，所采用的甲酸量最好是1.3至1.35摩爾當(dāng)量。
另一方式，在反應(yīng)開始時(shí)間將乙酐一次全部加到反應(yīng)混合物中(每摩爾天冬氨酸加2.3-2.9摩爾)，然后加入仲醇，通過與混合酸酐反應(yīng)生成相應(yīng)的酯來消耗掉過量的甲酸?；蛘邔⑸倭康囊宜狒c仲醇一起一次加入即可。但是，最好將甲酸、大部分乙酐及催化劑混合2-3小時(shí)左右，然后再加入少量的乙酐。在混合狀態(tài)下使該反應(yīng)再維持2-3小時(shí)，然后向該反應(yīng)物中加入仲醇(異丙醇)。將該最終反應(yīng)混合物混合，最好是在50℃左右再混合2-3小時(shí)致使反應(yīng)完全。
然后，使產(chǎn)物N-甲酰基-L-天冬氨酸酐與L-苯丙氨酸就地反應(yīng)，由此省去了全部昂貴、耗時(shí)的分離過程。該反應(yīng)副產(chǎn)物可用作該偶合方法的共溶劑。
任選在烷基酯或位阻醇或兩者的適宜混合物存在下，使L-苯丙氨酸與等摩爾量的N-甲酰基-L-天冬氨酸酐偶合?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)如果每摩爾L-苯丙氨酸中加入至少1.2摩爾左右的烷基酯和/或位阻醇時(shí)，可以增加α/β比。隨著酯或醇的量增加，α/β比也增加，但其最高點(diǎn)是酯、醇或其混合物的摩爾量為L-苯丙氨酸摩爾量的約4.7倍，此時(shí)，達(dá)到飽和水平，即無論再加入多少酯或醇，異構(gòu)體的比例保持恒定。
在該偶合反應(yīng)中所采用的烷基酯最好選自乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸異丙酯，乙酸正丁酯和甲酸異丙酯。乙酸甲酯(MeOAc)是優(yōu)選的烷基酯。可采用的位阻醇包括異丙醇、仲或叔丁醇。異丙醇是優(yōu)選的位阻醇。這些是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但這并不意味著限制使用其他烷基酯或位阻醇，也不意味著限制本發(fā)明的范圍。
然后，在約5°-60℃，最好是在15°-30℃(即，室溫)將上述混合物攪拌4-6小時(shí)左右，即可完成該偶合反應(yīng)。在該偶合反應(yīng)期間出現(xiàn)的問題是隨著該反應(yīng)形成N-甲?；?L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸，該混合物或漿狀物開始固化，即，粘度增高，直到攪拌變得非常困難，甚至無法攪拌，當(dāng)粘度高到這種地步時(shí)，就很難過濾，并且妨礙熱傳導(dǎo)，致使下文所述的乙酸、酯和/或位阻醇的蒸餾受到妨礙?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在偶合反應(yīng)中加入乙酸可以抑制這一固化，即，降低其粘度。正是這一混合作用保證了反應(yīng)完全。此外，在脫甲?；氨仨毻ㄟ^蒸餾從該混合物中除去酸和酯。為了做到這一點(diǎn)，該反應(yīng)混合物必須是可攪拌的。
加入乙酸酐的量取決于合成多少N-甲酰基天冬氨酸酐。由于該偶合反應(yīng)直接在反應(yīng)副產(chǎn)物中進(jìn)行，因此，在L-天冬氨酸和乙酐之間進(jìn)行初反應(yīng)時(shí)就應(yīng)已有一些乙酸存在了。在該系統(tǒng)中的乙酸總量，以摩爾/摩爾計(jì)算，應(yīng)該是L-苯丙氨酸量的7倍左右。因此，沒有必要以7倍于L-苯丙氨酸的量加入乙酸。當(dāng)該體系中已有乙酸的總摩爾量約為L-苯丙氨酸量的7倍時(shí)，只加少量的乙酸就可以了。
盡管可在常溫下進(jìn)行偶合反應(yīng)，但最好將溫度升高，這樣也有助于降低反應(yīng)混合物的粘度。有利于該反應(yīng)的溫度在25℃至40℃之間，最好是在30℃左右。
本發(fā)明的另一特點(diǎn)是通過控制對偶合反應(yīng)混合物的攪拌來降低偶合反應(yīng)混合物的粘度?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在偶合反應(yīng)過程中停止或降低攪拌速度可以顯著地降低偶合反應(yīng)混合物的粘度。在大型反應(yīng)器中(裝有5英尺長槳葉機(jī)械攪拌器的直徑為10英尺的反應(yīng)器)，以很慢的速度攪拌，例如，每分鐘5-40轉(zhuǎn)(rpm)，并采用間歇攪拌法，即每隔5-15分鐘短暫地啟動攪拌，與每分鐘60轉(zhuǎn)或更快的攪拌速度下進(jìn)行的反應(yīng)相比，采用前一種方法可以大大地降低偶合反應(yīng)混合物的粘度。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中(裝有3英寸槳葉的4英寸圓底燒瓶)，200-300rpm使反應(yīng)混合物變得很稠，而以5-15rpm攪拌時(shí)，則成為流動性很好的低粘度反應(yīng)混合物。在該反應(yīng)混合物中加入L-Phe后1小時(shí)左右關(guān)掉攪拌器，待該反應(yīng)(約6小時(shí))產(chǎn)生低粘度反應(yīng)混合物后再啟動攪拌。但是在工業(yè)生產(chǎn)中，攪拌器停止時(shí)間超過1小時(shí)后，由于沉淀物沉積和結(jié)塊，使得再啟動攪拌器變得很困難。因此，最好采用慢攪拌和間歇攪拌。
本文所采用的術(shù)語“可流動”或“低粘度”用于偶合反應(yīng)混合物時(shí)，意指可從玻璃容器或反應(yīng)器中傾出的液體。這類液體的粘度一般在約15000厘泊(cp)以下，優(yōu)選者在1000-10000cp之間，最好是在150-500cp之間。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中攪拌方法并不十分重要。可以采用任何標(biāo)準(zhǔn)的攪拌方式，例如，注入惰性氣體，振蕩，翻滾反應(yīng)器，機(jī)械攪拌等。優(yōu)選的是機(jī)械攪拌。具體的攪拌器結(jié)構(gòu)也并不十分嚴(yán)格。采用槳式或葉片攪拌器時(shí)，攪拌速度一般是5-40rpm左右，最好是20rpm左右。雖然槳端速度(米/秒)隨根據(jù)槳長而調(diào)定的rpm而改變，但就實(shí)施本發(fā)明而言，rpm更準(zhǔn)確地反映了攪拌速度。低于40rpm(±)的任何攪拌速度均可以降低反應(yīng)混合物的粘度。但是，應(yīng)該注意到，就實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(4英寸燒瓶)而言，攪拌速度在40-150rpm之間即可成為可流動的反應(yīng)混合物。
通過高效液相色譜(HPLC)可以分析由上述發(fā)明方法生產(chǎn)的N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α和β-異構(gòu)體(α/βF-AP)，并由此測得這些方法所得α/β比非常之高，約為79.5∶20.5。
在進(jìn)行下述脫甲酰基反應(yīng)前，任選從該反應(yīng)混合物中除去乙酸和所有的酯(乙酸甲酯，甲酸異丙酯等)或位阻醇。最好在約15-25英寸Hg進(jìn)行減壓蒸餾除去乙酸和酯。先進(jìn)行減壓蒸餾，然后再加入HCl，使α/βF-AP脫甲?；??；厥找宜帷Ⅴズ?或醇，并且在其后的偶合反應(yīng)中循環(huán)使用。
然后脫去N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸α和β異構(gòu)體的甲?；?。為使α/βF-AP脫甲酰基生成α/β-AP，在上述異構(gòu)體混合物中加入鹽酸和甲醇。過量的甲醇也可以與存留在反應(yīng)混合物中的所有乙酸和甲酸反應(yīng)，形成乙酸甲酯和甲酸甲酯，它們的沸點(diǎn)比乙酸或甲酸的沸點(diǎn)低得多，因此，可以通過較低溫度的蒸餾從該體系中除去之。
然后，將HCl、甲醇和水的濃度調(diào)到足以高產(chǎn)率產(chǎn)生α-APM(HCl)的濃度，借以將所得α/β-AP混合物和它們的各種甲酯酯化。甲醇濃度應(yīng)該是約1-10%(重量)，最好是約3-5%(重量)。HCl濃度應(yīng)為約9-18%(重量)，最好是約12.5-14.5%(重量)。水的濃度應(yīng)約為32-50%(重量)，最好是約37-42%(重量)。將水HCl和甲醇濃度調(diào)好后，在約35℃，最好是環(huán)境溫度(20-30℃)溫和地?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合物。在4-8天左右，通常是約6天，該酯化反應(yīng)完成。
由于α-APM·HCl·2H2O在水溶液中的溶解度比β-APM(HCl)要低，因此，所得α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的鹽酸鹽(α-APM(HCl))很容易與β-異構(gòu)體分離(參見前述Ariyoshi)。α-異構(gòu)體從溶液中沉淀，通過過濾，離心，潷析任何一種慣用方法分離之。
然后，用堿中和α-APM(HCl)，形成APM，最后采用本領(lǐng)域公知的結(jié)晶技術(shù)回收之。
下列實(shí)施例旨在具體例證本發(fā)明。所列這些實(shí)施例僅作闡示之用，并表明本發(fā)明的精神和范圍并非限于此中的細(xì)節(jié)及其修改案。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，即可從此中所披露內(nèi)容顯見其所用物料及方法。
實(shí)施例1將0.12g(0.003mole)氧化鎂(催化劑)溶解在16ml(0.405mole)95%的甲酸中。然后將60.2ml乙酐加到上述溶液中，在35°-40℃加熱10-15分鐘。然后加入39.93g(0.3mole)L-天冬氨酸，將該混合物在50±20℃攪拌2.5小時(shí)。此時(shí)，補(bǔ)加8.6ml乙酸酐，在50±20℃再繼續(xù)反應(yīng)2.5小時(shí)，向該反應(yīng)混合物中加入9.2ml(0.120mole)異丙醇，再繼續(xù)加熱2小時(shí)，此時(shí)經(jīng)高效液相色譜(HPLC)證實(shí)已形成了N-甲?；於彼狒?。
將N-甲?；於彼狒旌衔锢鋮s至室溫(20-25℃)，向該混合物中加入150ml(1.89moles)乙酸甲酯，然后加入44.6g(0.27moles)L-苯丙氨酸。將該混合物在室溫(20-30℃)攪拌3小時(shí)，然后將其在室溫放置過夜(18-24小時(shí))，固化。
將該固化產(chǎn)物溶解在甲醇和水(9∶1)的溶液中。通過HPLC分析所得N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α和β異構(gòu)體混合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α/β異構(gòu)體比率為79.2∶20.8。
實(shí)施例2采用就地偶合反應(yīng)制得的N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α/β比例與采用不同酯/醇作共溶劑時(shí)的α/β比例之比較。將氧化鎂(0.121g;0.003mole)在充氮下溶解在16.4ml(0.406mole)93.4%的甲酸中。然后在攪拌下將62.5ml(0.655mole)乙酸酐加到該混合物中，形成白色沉淀。在隨后的30分鐘內(nèi)將混合物的溫度升至37-38℃，加入L-天冬氨酸(39.93g;0.3mole)，將該混合物在48-50℃加熱2.5小時(shí)。補(bǔ)加乙酸酐(8.6ml，0.09mole)，再加熱2.5小時(shí)，然后在該反應(yīng)混合物中加入9.2ml(0.120mole)異丙醇，在50±2℃再繼續(xù)加熱2.0小時(shí)，然后將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫(22-27℃)。
為制備多份第一反應(yīng)混合物，將制備N-甲?；?L-天冬氨酸酐的過程重復(fù)數(shù)次。在每一份這種第一反應(yīng)混合物中加入100ml表1列出的某一烷基酯或位阻醇溶劑，然后加入44.6g(0.27mole)L-苯丙氨酸。將所得漿液在室溫保溫5小時(shí)以就地完成偶合反應(yīng)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，每一反應(yīng)物漿液越來越固化，為溶解其中的所有固體，加入大量的甲醇/水(10∶1)溶液。每一反應(yīng)混合物中取2.0g等分試樣進(jìn)行HPLC分析，每一反應(yīng)物中所形成的N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的α/β比率如下表1溶劑 α/β比例乙酸甲酯 79∶21乙酸乙酯 79∶21乙酸異丙酯 80∶20乙酸正丁酯 78∶22甲酸甲酯 75.5∶24.5甲酸異丙酯 78∶22異丙醇 78∶22仲丁醇 76∶24叔丁醇 78∶22不加溶劑 71∶29實(shí)施例3按實(shí)施例1所述方法再次制備N-甲?；於彼狒?，將該天冬氨酸酐留在原反應(yīng)混合物中就地與L-苯丙氨酸偶合。向該反應(yīng)混合物加入100ml乙酸甲酯，44.6g(0.27mole)L-苯丙氨酸和84ml(1.47mole)乙酸。由于乙酸酐與L-天冬氨酸反應(yīng)時(shí)，在形成酸酐的過程中生成乙酸副產(chǎn)物，這樣在該反應(yīng)物存在的乙酸總量等于166.4ml(2.912mole)。
在室溫(20°-25℃)，將該偶合反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)左右，在偶合反應(yīng)完成后，該混合物不出現(xiàn)固化。采用HPLC分析所得α/β異構(gòu)體之比為79.5∶20.5。
實(shí)施例4按實(shí)施例1所述方法制備N-甲?；於彼狒?F-Asp＝0)并將其留在原反應(yīng)混合物中。然后加入44.6g(0.27mole)L-苯丙氨酸，106.89g(1.26mole)乙酸甲酯和足量乙酸(使乙酸總量達(dá)2.91mole)，由此，就地進(jìn)行偶合反應(yīng)(見實(shí)施例3)。
將該混合物在室溫(20°-25℃)攪拌6小時(shí)左右進(jìn)行偶合反應(yīng)。偶合反應(yīng)完成后該混合物也不出現(xiàn)固化。α/β異構(gòu)體比是79.5∶20.5表3歸納了在偶合反應(yīng)中加入不同濃度乙酸甲酯和乙酸(HOAc)時(shí)，所得產(chǎn)物α/β異構(gòu)體之比。N-甲?；於彼狒蚅-苯丙氨酸的用量保持恒定，即每一反應(yīng)中為0.27mole。反應(yīng)溫度和時(shí)間也不變。在每一反應(yīng)中，以每摩爾L-苯丙氨酸所加溶劑摩爾數(shù)分別表示乙酸甲酯和乙酸的濃度。每種混合物中所得α/β之比列于表的右邊，由此可以證實(shí)本發(fā)明方法的確可制得高α/β比的產(chǎn)物。
表3在L-Phe和F-Asp＝0偶合時(shí)，改變HOAc和MeOAc的濃度，所得α/β比實(shí)驗(yàn)＃ 每摩爾L-Phe的溶劑摩爾數(shù) α∶βMeOAc HOAc1 4.65 0.00 80.0/20.02 4.65 5.34 78.6/21.43 7.00 5.34 79.2/20.8
4 4.60 10.79 79.5/20.55 3.49 10.79 79.2/20.86 2.33 10.79 77.9/22.17 1.17 10.79 77.1/22.98 2.94 9.00 77.4/22.69 3.50 9.00 78.0/22.010 2.28 7.00 77.15/22.8511 1.17 8.58 76.3/23.712 2.61 7.67 77.8/22.213 0.00 5.34 69.0/31.014 0.00 10.50 74.0/26.0實(shí)施例5盡管在偶合反應(yīng)中推薦的乙酸用量一般是L-苯丙氨酸用量的7倍，但是經(jīng)證實(shí)，即使少量的乙酸也可起催化劑的作用。將按實(shí)施例2所述方法制得的N-甲酰基天冬氨酸酐(31.0g;0.217mole)在充氮下與150ml乙酸甲酯及25.8ml(0.45mole)乙酸混合。然后加入33.0g(0.20mole)L-苯丙氨酸，在約25℃攪拌該混合物。3.5小時(shí)后，補(bǔ)加100ml乙酸甲酯以防止固化，4.5小時(shí)后重復(fù)此步驟，總共反應(yīng)6小時(shí)后，將反應(yīng)漿液溶解在足量的甲醇和水(10∶1)中。用HPLC分析該溶液，經(jīng)測定α/β異構(gòu)體比例為80∶20。
實(shí)施例6將氧化鎂(0.4g;0.01mole)溶解在53.3ml(1.35mole)95%的甲酸和200ml(2.10mole)乙酸酐中。該反應(yīng)本身放熱，使反應(yīng)溫度在15分鐘由20-22℃升至40℃。在該反應(yīng)混合物中加入L-天冬氨酸(133.1g;1.0mole)，將所得漿液在48°-50℃加熱2.5小時(shí)，此時(shí)，加入28.9ml(0.303mole)乙酸酐。再連續(xù)加熱2.5小時(shí)，然后混入30.7ml(0.4mole)異丙醇，將該反應(yīng)混合物在48-50℃攪拌1.5小時(shí)，然后使之冷卻至室溫(25°±2℃)。所得混合物含有N-甲?；於彼狒?。
在該反應(yīng)混合物中加入187ml乙酸甲酯和148.68g(0.9mole)L-苯丙氨酸，將所得漿液攪拌1.5小時(shí)。加入120ml乙酸以促進(jìn)攪拌，并將該混合物在25-26℃再保溫4.5小時(shí)，將該混合物進(jìn)行減壓(22英寸Hg)蒸餾，直到反應(yīng)混合物達(dá)到65℃為止。
將甲醇(220ml)和100ml鹽酸(1.2mole)混入該漿液中，并將其在60℃左右加熱1小時(shí)。蒸餾所得澄清液，直到蒸餾頭的溫度達(dá)到63℃為止，而該反應(yīng)混合物的溫度是73℃。補(bǔ)加甲醇(400ml)，繼續(xù)蒸餾，直到反應(yīng)混合物的溫度達(dá)到85℃。在約26英寸Hg下將反應(yīng)混合物減壓處理45分鐘，使剩余的殘留物冷卻至室溫(約25℃)，在冷卻的殘留物中加入120ml 37%的鹽酸、19ml甲醇和94.8ml水。然后在室溫將該混合物攪拌6天。
將所得漿液過濾，洗滌，在50℃干燥10小時(shí)后得到白色固體(197.54g)。該產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析顯示含有61.5%的α-APM。
實(shí)施例7方法與實(shí)施例6基本相同，不同之處是以維持恒定體積的速度加入400ml甲醇。所得固體(197.85g)經(jīng)HPLC測定含有67.18%的α-APM。
實(shí)施例8方法與實(shí)施例7基本相同，不同之處是完全在減壓條件下進(jìn)行最后的蒸餾，最高頂溫為55-56℃。L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽的收率為理論量的51%。
實(shí)施例9方法與實(shí)施例7基本相同，不同之處是加入甲醇后，在減壓(20英寸Hg)下，于55-67℃蒸餾2小時(shí)。分離得到186.15g α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽二水合物，經(jīng)分析表明α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的含量是64.68%。
實(shí)施例10
用5分鐘的時(shí)間將甲酸(95.7%;16ml;0.405mole)滴加到60.2ml(0.631mole)乙酸酐中，在此期間溫度升至40℃。將該混合物攪拌55分鐘，加入39.93g(0.3mole)L-天冬氨酸和0.43g(0.003mole)乙酸鎂。將所得漿液在47-48℃加熱2.5小時(shí)。加入乙酸酐(7.1ml;0.0744mole)，連續(xù)加熱2.5小時(shí)，加入異丙醇(7.21g;0.120mole)，連續(xù)加熱1.5小時(shí)。停止加熱，加入130ml乙酸和44.6g(0.27mole)L-苯丙氨酸。將該混合物在環(huán)境溫度攪拌過夜。將所得漿液溶解在750ml水和1.05升甲醇中，稱重，取出一等份該溶液用HPLC分析α/β-N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸，經(jīng)測定α-異構(gòu)體的得率為71.5%，實(shí)施例11在充氮下將甲酸(16.0ml;0.405mole)加到0.121g(0.003mole)氧化鎂中，攪拌，直到固體溶解，加入乙酸酐(60.2ml;0.631mole)，立即出現(xiàn)沉淀，經(jīng)15分鐘溫度升到40℃，加入L-天冬氨酸(39.93g;0.3mole)，將該漿液在48-50℃加熱2.5小時(shí)，補(bǔ)加乙酸酐(9.3ml;0.0974mole)，再連續(xù)加熱2.5小時(shí)，加入異丙醇(11.9ml;0.155mole)，并將該混合物加熱1.5小時(shí)。使溫度升至53℃，用15分鐘時(shí)間，分四次加入44.6g(0.27mole)L-苯丙氨酸。在10分鐘內(nèi)溫度升至58℃，再繼續(xù)攪拌50分鐘以上。使該反應(yīng)混合物冷至環(huán)境溫度，加入30.1ml37%的鹽酸和70ml水。將該漿液加熱至60℃，保溫1小時(shí)，在此期間所有的固體溶解，減壓蒸餾除去溶劑，將蒸餾瓶的溫度保持在55±2℃。稱重，殘留物為119g。在該殘留物中加入100g水，重復(fù)蒸餾，得到107g殘留物。加入50.5ml鹽酸、41.2ml水和31.5ml甲醇，將該漿液在20-30℃攪拌4天。濾出固體，用50ml飽和鹽水洗滌，經(jīng)干燥過夜后，得到43.95g白色結(jié)晶狀α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽二水合物。
實(shí)施例12按實(shí)施例1制備N-甲?；於彼狒幕鞈乙骸Ｏ燃尤胍宜峒柞?75ml)和84ml乙酸，然后再加入L-苯丙氨酸(44.6g)，將所得漿液在20-30℃攪拌6小時(shí)，在50mmHg減壓蒸除溶劑(350g)。加入鹽酸(37%;30ml)和66.7ml甲醇，在60-62℃加熱1小時(shí)。補(bǔ)加甲醇(528ml)，蒸餾到瓶溫為85℃為止。減壓至26英寸Hg，蒸餾至瓶溫為30℃。然后加入36.4ml鹽酸、24.4ml水和5.5ml甲醇，將所得混合物攪拌4天。濾出所得沉淀，洗滌，干燥，得到63.1g白色固體。HPLC分析表明α-AMP含量為63%。
實(shí)施例13按實(shí)施例1制備N-甲酰基-L-天冬氨酸酐(F-Asp＝0)的各種混懸液，并將其置于裝有Talboys 134-2型機(jī)械攪拌器的500ml圓底燒瓶中。在這些反應(yīng)混合物中加入乙酸甲酯(MeOAc)，乙酸(HOAc)和L-苯丙氨酸(L-Phe)，加入量應(yīng)達(dá)到下述摩爾比MeOAc/HOAc(總量)/Phe/F-Asp＝0是2.73/10.64/1.0/1.0。在室溫，以200-300rpm的攪拌速度使該反應(yīng)混合物反應(yīng)1小時(shí)。此時(shí)反應(yīng)溫度上升至40℃，將攪拌速度降至5-15rpm之間。3小時(shí)內(nèi)Phe基本轉(zhuǎn)化完全。于室溫反應(yīng)6小時(shí)(包括在50-55℃反應(yīng)的1.5-2.0小時(shí))后，用Brookfield粘度計(jì)LV測定粘度。結(jié)果如下1小時(shí) 1小時(shí)后 粘度(厘泊)(RPM-轉(zhuǎn)子2)攪拌速度 溫度6＊ 12＊ 30＊ 60＊200-300rpm 室溫 2860cp 1587cp 819cp 483cp(對照)5-15rpm 25℃ 1225 937 490 3015-15rpm 40℃ 690 485 287 170＊轉(zhuǎn)子rpm實(shí)施例14
除反應(yīng)混合物在反應(yīng)1小時(shí)后完全停止攪拌外，其他操作與實(shí)施例13的方法相同?？偣卜磻?yīng)6小時(shí)后，可以攪拌反應(yīng)混合物，但需要輔助啟動攪拌器。一旦開始攪拌，反應(yīng)混合物變成很好的流體，與以200-300rpm攪拌反應(yīng)6小時(shí)的反應(yīng)混合物相比，前者的粘度低得多。分析該反應(yīng)混合物表明Phe轉(zhuǎn)化完全。
實(shí)施例15除將反應(yīng)混合物間歇攪拌外，即，反應(yīng)開始45分鐘后，每隔5-15分鐘，低速攪拌12秒，其它操作與實(shí)施例13的方法相同。先將上述反應(yīng)所得混合物以200-300rpm攪拌1小時(shí)，在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，該反應(yīng)混合物成為流動液體。對反應(yīng)混合物的分析表明Phe完全轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例16按實(shí)施例1制備N-甲?；?L-天冬氨酸酐(F-Asp＝0)的混懸液，并將其置于裝有Talboys 134-2型機(jī)械攪拌器的500ml圓底燒瓶中。在該反應(yīng)混合物中加入MeOAc，HOAc和Phe，使它們的摩爾比達(dá)到MeOAc/HOAc(總量)/Phe/F-Asp＝0為2.73/7.84/1.0/1.0。以200-300rpm的攪拌速度，在室溫使該反應(yīng)混合物反應(yīng)1小時(shí)。然后將攪拌速度降至5-15rpm，在約5小時(shí)內(nèi)Phe完全轉(zhuǎn)化。兩個(gè)對照組是以200-300rpm的攪拌速度反應(yīng)6小時(shí)。于室溫反應(yīng)6小時(shí)(包括在50-55℃反應(yīng)的1.5-2小時(shí))后，用Brookfield粘度計(jì)LV測定粘度。結(jié)果如下1小時(shí)后的攪拌速度 粘度(cP)(RPM-轉(zhuǎn)子4)12＊ 30＊ 60＊200-300rpm(對照) 9，100 6，740 5，110200-300rpm(對照) 12，000 8，000 6，0005-15rpm 6，850 3，740 2，410＊轉(zhuǎn)子rpm實(shí)施例17
除了在攪拌速度降至5-15rpm時(shí)，將反應(yīng)混合物溫度升至40℃外，其他操作與實(shí)施例16的方法相同。所得反應(yīng)混合物的流動性很好，與以200-300rpm操作的對照組相比，前者的粘度低得多。分析表明Phe完全轉(zhuǎn)化。
以類似的操作，采用本文所述的各種烷基酯、位阻醇、攪拌參數(shù)及蒸餾技術(shù)，可以很高的收率生產(chǎn)α-APM(HCl)。
權(quán)利要求
1.用于制備α-APM鹽酸鹽的“一勺燴”方法，該方法包括(a)在由甲酸、乙酸酐和仲醇組成的第一混合物中將L-天冬氨酸甲酰化，得到N-甲酰基-L-天冬氨酸酐；(b)在有效的溫度，使所述N-甲?；於彼狒偷嘏cL-苯丙氨酸偶合，得到α，β-N-甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸異構(gòu)體；(c)加入有效量的鹽酸使所述異構(gòu)體脫去甲?；?d)從反應(yīng)混合物中除去殘留的乙酸和甲酸；(e)在反應(yīng)混合物中加入有效量的甲醇、水和鹽酸使脫去甲?；漠悩?gòu)體酯化，得到α-和β-APM鹽酸鹽，其中α-APM-鹽酸鹽沉淀；和(f)離析α-APM鹽酸鹽。
2.按權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(a)中的仲醇是異丙醇，并且在加入適量乙酸的條件下進(jìn)行偶合步驟。
3.按權(quán)利要求2的方法，其中，在適量的烷基酯、位阻醇或它們的混合物存在下進(jìn)行偶合步驟。
4.按權(quán)利要求1、2或3的方法，其中，偶合步驟(b)還包括在脫甲?；襟E(c)前減壓蒸餾除去存在于反應(yīng)混合物中的乙酸、位阻醇和酯;脫甲酰基步驟(c)還包括加入有效量的甲醇使存在于反應(yīng)混合物中的所有甲酸和乙酸酯化;和步驟(d)包括除去所得的乙酸甲酯和甲酸甲酯。
5.按權(quán)利要求4的方法，其中，采用常壓蒸餾進(jìn)行步驟(d)。
6.按權(quán)利要求4的方法，其中，采用減壓蒸餾進(jìn)行步驟(d)。
7.按權(quán)利要求4的方法，還包括用堿中和離析出的α-APM鹽酸鹽，形成APM。
8.按權(quán)利要求4的方法，其中，全部乙醇總摩爾量至少是L-苯丙氨酸摩爾量的7倍。
9.按權(quán)利要求4的方法，其中，在步驟(b)中加入烷基酯，其加入量至少是L-苯丙氨酸的摩爾數(shù)的1.2倍。
10.按權(quán)利要求9的方法，其中，所述烷基酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、甲酸異丙酯或它們的混合物。
11.按權(quán)利要求4的方法，其中，在步驟(b)中加入位阻醇，其用量至少是L-苯丙氨酸用量的摩爾數(shù)的1.2倍。
12.按權(quán)利要求11的方法，其中，所述位阻醇是異丙醇、仲丁醇、叔丁醇或它們的混合物。
13.按權(quán)利要求4的方法，其中，在步驟(b)中加入所述烷基酯和位阻醇的混合物，其用量至少是L-苯丙氨酸用量的摩爾數(shù)的1.2倍。
14.按權(quán)利要求4的方法，其中，在無攪拌條件下進(jìn)行偶合步驟(b)。
15.按權(quán)利要求4的方法，其中，在攪拌條件下進(jìn)行偶合步驟(b)，以足以形成可流動的最終反應(yīng)混合物。
16.按權(quán)利要求15的方法，其中，采用機(jī)械攪拌器進(jìn)行攪拌。
17.按權(quán)利要求16的方法，其中，該機(jī)械攪拌器的轉(zhuǎn)速小于每分鐘40轉(zhuǎn)(rpm)。
18.按權(quán)利要求16的方法，其中，在整個(gè)反應(yīng)過程中周期性地啟動攪拌器。
19.按權(quán)利要求15的方法，其中，按下述方法進(jìn)行攪拌(a)在加入L-苯丙氨酸后的前半個(gè)小時(shí)劇烈攪拌，(b)然后慢速或間歇攪拌。
20.按權(quán)利要求19的方法，其中，采用機(jī)械攪拌器進(jìn)行攪拌，并且(a)以約60rpm的攪拌速度進(jìn)行劇烈攪拌，(b)以約20rpm的攪拌速度進(jìn)行慢速攪拌，(c)至少每隔15分鐘啟動一次攪拌，每次至少攪拌1分鐘，由此進(jìn)行間歇攪拌。
21.用于制備α-APM鹽酸鹽的“一勺燴”方法，該方法包括(a)在由甲酸、乙酸酐和異丙醇組成的第一反應(yīng)混合物中將L-天冬氨酸甲?；?，得到N-甲酰基天冬氨酸酐;(b)在(ⅰ)乙酸和(ⅱ)適量的烷基酯、位阻醇或它們的混合物存在下，于5°-40℃就地將上述天冬氨酸酐與L-苯丙氨酸偶合，得到α，β-N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸異構(gòu)體;(c)加入有效量的HCl和甲醇，使上述異構(gòu)體脫去甲?；?(d)減壓蒸餾，從該反應(yīng)混合物中除去過量的乙酸、甲酸、乙酸甲酯和甲酸甲酯;(e)在該反應(yīng)混合物中加入有效量的甲醇和HCl，使脫去甲?；漠悩?gòu)體酯化，得到α，β-APM鹽酸鹽，其中α-AMP鹽酸鹽沉淀而出;和(f)離析α-APM/鹽酸鹽。
22.按權(quán)利要求21的方法，其中，(1)乙酸與L-苯丙氨酸的摩爾此至少是7∶1，和(2)在減壓蒸餾步驟(d)期間向反應(yīng)物中加入有效量的甲醇，通過形成相應(yīng)的甲酯來促進(jìn)除去乙酸和甲酸。
23.按權(quán)利要求22的方法，其中，位阻醇、烷基酯或其混合物與L-苯丙氨酸的摩爾比至少是1.2∶1。
24.按權(quán)利要求23的方法，其中，所述烷基酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、甲酸異丙酯或它們的混合物。
25.按權(quán)利要求23的方法，其中，所述位阻醇是異丙醇、仲丁醇、叔丁醇或它們的混合物。
26.按權(quán)利要求22所述方法，其中，在足以形成可流動的最終反應(yīng)混合物的攪拌條件下進(jìn)行所述偶合步驟(b)。
27.按權(quán)利要求25的方法，其中，采用機(jī)械攪拌器，以低于30rpm的速度進(jìn)行攪拌。
28.一種將N-甲?；?L-天冬氨酸酐與L-苯丙氨酸偶合，產(chǎn)生α/β-N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸混合物的方法，其改進(jìn)之處在于在烷基酯、位阻醇或它們的混合物存在下進(jìn)行該偶合反應(yīng)，借以提高α/β比例。
29.按權(quán)利要求28的改進(jìn)方法，其中，所述烷基酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯或它們的混合物，所述位阻醇是異丙醇。
30.按權(quán)利要求28的改進(jìn)方法，其中，在乙酸甲酯存在下進(jìn)行偶合反應(yīng)。
31.按權(quán)利要求30的改進(jìn)方法，其中，存在于反應(yīng)介質(zhì)中的乙酸甲酯量是每摩爾L-苯丙氨酸加1.2至4.7摩爾當(dāng)量乙酸甲酯。
32.一種制備α/β-N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸異構(gòu)體的方法，該方法包括(a)N-甲?；?L-天冬氨酸酐與L-苯丙氨酸反應(yīng)，(b)在乙酸存在下，和(c)在無攪拌條件下進(jìn)行上述反應(yīng)，不攪拌可使最終反應(yīng)混合物呈可流動態(tài)。
33.按權(quán)利要求32的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包括(a)加入一定量的烷基酯、位阻醇或其混合物有助于提高異構(gòu)體的α/β比例。
34.按權(quán)利要求33的方法，其中，(d)是乙酸甲酯。
35.按權(quán)利要求32的方法，其中，將N-甲?；?L-天冬氨酸酐與L-苯丙氨酸先攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后停止攪拌。
36.一種制備α/β-N-甲?；?L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸異構(gòu)體的方法，該方法包括(a)使N-甲?；?L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸，(b)在乙酸存在下反應(yīng)，和(c)在足以使最終反應(yīng)混合物呈可流動態(tài)的攪拌條件下反應(yīng)。
37.按權(quán)利要求36的方法，其中，采用機(jī)械攪拌器，以低于每分鐘約40轉(zhuǎn)(rpm)的速度進(jìn)行攪拌。
38.按權(quán)利要求37的方法，其中，攪拌速度是約20rpm。
39.按權(quán)利要求36的方法，其中，在整個(gè)反應(yīng)過程中，周期性地?cái)嚢璺磻?yīng)混合物。
40.按權(quán)利要求37的方法，其中，在約69℃進(jìn)行該反應(yīng)。
41.按權(quán)利要求40的方法，其中，在約30℃進(jìn)行該反應(yīng)。
全文摘要
公開了用于制備α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(α-APM(HCl)的“一勺燴”方法。α-APM(HCl)是制備糖精的中間體。
文檔編號C07K5/06GK1058971SQ9010691
公開日1992年2月26日 申請日期1990年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1988年2月12日
發(fā)明者羅伯特·A·埃里克森, 許光燦, 馬克·R·約翰遜, 約翰·B·希爾, 葉菲姆·蓋爾曼, 小休·L·德賴登 申請人:紐特拉斯威特公司