一種分離膜受體蛋白的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分離膜受體蛋白的方法，用免疫磁珠分離人肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜上與乙型肝炎病毒ｐｒｅＳ１肽段結(jié)合的蛋白，建立快速分離膜受體蛋白的方法,本發(fā)明本研究結(jié)果條帶的分子量范圍與前述學(xué)者大體相當(dāng)，并且條帶更為豐富，說(shuō)明免疫磁珠法用于分離受體結(jié)合蛋白是行之有效的，該方法從膜蛋白的制備到凝膠的掃描，整個(gè)過(guò)程在２ｄ之內(nèi)即可完成，并且操作非常的簡(jiǎn)單，與其它的方法相比較能夠達(dá)到省時(shí)、省力、方便快捷的效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種分離膜受體蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離膜受體蛋白的方法，屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(11 6 ？ ￡1 1:丨1:丨38^丨1~113 ,只8 \0是引起人類(lèi)慢性乙型肝炎的病原體，其感染肝細(xì)胞的機(jī)制仍然不十分清楚，普遍認(rèn)為只3 V可能通過(guò)其包膜蛋白與肝細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體蛋白作用，使病毒與細(xì)胞黏附、融合并最終進(jìn)入胞內(nèi)，已知的只
8V候選受體大多都與？ 6 3 1區(qū)域的2 1?4 7位氨基酸相互作用；人6 0 11 - 了 3
011 4等證明？ 1-651區(qū)在只3 V感染中的重要性。近1 0年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用6 3丁 ？ 11 1 1 - (1 0 V 11技術(shù)、免疫共沉淀和噬菌體展技術(shù)的方法來(lái)篩選肝細(xì)胞膜蛋白與？
1-6 3 1結(jié)合的蛋白，但這3種方法操作均較繁瑣，所需時(shí)間長(zhǎng)，并且獲得的結(jié)合蛋白條帶較單一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種分離膜受體蛋白的方法，該方法快捷方便，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案一種分離膜受體蛋白的方法，用免疫磁珠分離人肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜上與乙型肝炎病毒？
1-6 3 1肽段結(jié)合的蛋白，建立快速分離膜受體蛋白的方法。
[0005]前述的一種分離膜受體蛋白的方法中，具體為提取膜受體細(xì)胞膜蛋白，以生物素標(biāo)記的？ 1- 6 3 1肽段為釣餌，與提取的膜蛋白4 1孵育過(guò)夜，入鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠，洗滌磁珠后收集結(jié)合蛋白，通過(guò)3 0 5電泳分離結(jié)合蛋白。
[0006]由于采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明本研究結(jié)果條帶的分子量范圍與前述學(xué)者大體相當(dāng)，并且條帶更為豐富，說(shuō)明免疫磁珠法用于分離受體結(jié)合蛋白是行之有效的，該方法從膜蛋白的制備到凝膠的掃描，整個(gè)過(guò)程在2 4之內(nèi)即可完成，并且操作非常的簡(jiǎn)單，與其它的方法相比較能夠達(dá)到省時(shí)、省力、方便快捷的效果。

【具體實(shí)施方式】
[0007]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0008]本發(fā)明的實(shí)施例:
1材料與方法
1.1材料及儀器
^ 6 ？ 0 2人肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；膜蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京普利萊生物公司I'購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；生物素標(biāo)記的？ 6 3 1肽段購(gòu)自賽百盛生物公司；鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠購(gòu)自柏匯申生物科技有限公司；0 V高糖培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自美國(guó)只7 0 1 0 11 6公司；0 0 2培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)),低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)3 1 8爪￡1公司)，0 V V -111- 5型穩(wěn)流電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠)，11 V人X掃描儀(11 V人X公司兄
[0009]1.2 方法
1.2.1免疫磁珠法分離？ 6 3 1結(jié)合蛋白
基本操作步驟:(1)細(xì)胞培養(yǎng)收集，110 ^02細(xì)胞培養(yǎng)于含1 0 %血清的0 V 2 V高糖培養(yǎng)基中，約4 8 11后生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，0.2 5 %胰酶消化并收集細(xì)胞，用？ 3 3溶液洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)；(2) II 6 ？ 0 2細(xì)胞膜蛋白的提取，取生長(zhǎng)良好的只6 ？ 0 2細(xì)胞8瓶(約2.2 5 %的胰酶消化后收集細(xì)胞于5 0 1離心管內(nèi)，8 0 0〖11離心5111〖11，并且用？ 8 3洗漆3次，參照試劑盒胞膜一胞漿一胞核說(shuō)明提取膜蛋白，用3 ￡1 (1 5 0 (1法對(duì)膜蛋白定量；(3)膜蛋白與？ 6
31結(jié)合的最適濃度的選取，在6支1.50112)3-13611(101*5管中各加膜蛋白1
1118，1 ?6 號(hào)管分別加入含量為 259 8、509 8、1009 8、1509 8、2009 8、2 5 0 0 %生物素標(biāo)記的？ I1 6 3 1，再加？ 8 3緩沖液至1 111 1處，孵育過(guò)夜，1?6號(hào)管分別加入濃度為0.15 8/1^的鏈酶親和素標(biāo)記磁珠259 1,50^ 1、1 0 0 1 ? 1 5 0 11 1 ? 2 0 0 11 1 ? 2 5 0 11 1，各管加？ 3 3緩沖液使反應(yīng)終體積為1 2 0 0 9 1，3 7 I搖床3 0爪1 11后，插入磁力架吸去未結(jié)合部分，并且用？ 3 3洗漆磁珠3次后，在磁珠中加入自制蛋白裂解液(尿素8 111 0 1丨二硫蘇糖醇6 5 111爪 01/ 乙，4% ￠:? 八？ 3 ,0.2 % 810-1.7^6)30^ 1，冰浴 3 0 爪 I 11，將與？ 6 3 1結(jié)合的蛋白裂解出來(lái)；(4) 5 0 3 - ？人6 2及考馬斯亮藍(lán)染色，配制1 2 %的分離膠和5 %的濃縮膠，將裂解后的蛋白加入5倍處理后，取2 0 ^ 1上樣，8 0 V電泳跑出分離膠，1 2 0 V電泳至凝膠底部，考馬斯亮藍(lán)染色，3 11后脫色至背景清晰可見(jiàn)即可；(5)凝膠掃描，脫色后的凝膠用II V人X掃描儀進(jìn)行掃描。
[0010]1.2.2目的條帶獲取
為了獲得較清晰的條帶，參照前面最適濃度的結(jié)果，將膜蛋白與生物素標(biāo)記？ 6 31和鏈酶親和素標(biāo)記磁珠用量均擴(kuò)大2倍，再行操作(操作方法同前
[0011]2 結(jié)果
2.1？ 1- 6 5 1濃度梯度結(jié)果
1爪8膜蛋白與不同濃度？ I1 6 3 1蛋白結(jié)合的結(jié)果，4號(hào)泳道即1 111 8膜蛋白與15 0 9 8的？『6 3 1肽段結(jié)合較佳。
[0012]2.2目的條帶獲取
2111 8膜蛋白與3009 8的？ 1631結(jié)合，經(jīng)3 0 0 9 1鏈酶親和素標(biāo)記磁珠獲得的結(jié)合蛋白，通過(guò)3 0 5 - ？人6 2電泳分離出了多條帶-，比較明顯的4 5?9 7匕11有9條帶，? 9 7匕11處有5條帶，? 2 0匕11處有2條。
[0013]3 討論
目前常用于研究？ 1- 6 5 1受體的方法主要是免疫共沉淀技術(shù)、0 5 X ？ 11 1 1 - ￠1
0V 11和噬菌體展示技術(shù)，免疫磁珠的0 1?1 4 111級(jí)的粒徑使其在相同的情況下具有更大的表面積，一方面增強(qiáng)了其在溶劑中的懸浮穩(wěn)定性(無(wú)外加磁場(chǎng)時(shí)),另一方面也使其更容易捕獲靶物質(zhì)并與之結(jié)合，本研究用生物素標(biāo)記的？ 1- 6 3 1多肽為釣餌，與膜蛋白結(jié)合后，加入鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠，磁珠上的鏈酶親和素和？ 1-6 5 1上的生物素結(jié)合后，在磁珠上就形成了鏈霉素一生物素一？ 1-631 一膜蛋白的復(fù)合物，再加入裂解液使結(jié)合上的膜蛋白裂解出來(lái)，通過(guò)3 0 3 - ？ ^0 2電泳可將這些膜蛋白分離，？ 6 3 1是否被裂解在液相中還需做進(jìn)一步的驗(yàn)證，但其分子量為3 3 8 3 1^0，即使存在于液相中，其電泳速度很快，不影響本研究結(jié)果。本研究不僅用到了磁珠的穩(wěn)定性與易捕獲性，同時(shí)利用了配體受體蛋白結(jié)合的特異性和可逆性，親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專(zhuān)一性，不增加非特異性干擾，也不會(huì)因反應(yīng)試劑濃度高低受影響，所以可確定生物素標(biāo)記的？ 1- 6 3 1與膜蛋白的工作濃度，按比例加入鏈酶親和素磁珠即可對(duì)膜蛋白中？ I1 6 3 1結(jié)合蛋白進(jìn)行分離。
[0014]本研究有效的分離出了多條條帶，較明顯的4 5?97&11有9條，?97匕11處有5條，? 2 0 11處有2條。由于本研究采用生物素標(biāo)記的？ I1 6 3 1為釣館，？『6
31為2 1?4 7位氨基酸肽段，可能有多種成分與其結(jié)合，故出現(xiàn)多條帶，均為？ 1- 6 31有效的膜結(jié)合成分，丁崗強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)1 1 0 V 11的特異條帶；蘇婧等用？ 81 I'- V 6 3 1:6 1- 11技術(shù)篩選出人肝細(xì)胞膜蛋白中可能與？ 1-631結(jié)合的1 5個(gè)位點(diǎn)；崔侖標(biāo)等通過(guò)
03??？ 1111-00 V 11技術(shù)及蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了人XX只0 5 7能與13『631特異結(jié)合；葛以躍等聯(lián)合利用6 31 1 -00 V 11與現(xiàn)代蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了 2種與13『6 3 1特異結(jié)合蛋白只？ 78和6只？ 75，本研究結(jié)果條帶的分子量范圍與前述學(xué)者大體相當(dāng)，并且條帶更為豐富，說(shuō)明免疫磁珠法用于分離受體結(jié)合蛋白是行之有效的。該方法從膜蛋白的制備到凝膠的掃描，整個(gè)過(guò)程在2 4之內(nèi)即可完成，并且操作非常的簡(jiǎn)單。與其它的方法相比較能夠達(dá)到省時(shí)、省力、方便快捷的效果。
[0015]本研究成功分離出只6 ？ 0 2細(xì)胞膜蛋白與？ 1-631結(jié)合的蛋白，但其種類(lèi)、功能及在只3V感染中是否發(fā)揮作用還需要做進(jìn)一步的研究，本方法的建立為乙型肝炎病毒感染初期與病毒黏附相關(guān)的細(xì)胞受體的研究打下了基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種分離膜受體蛋白的方法，其特征在于:用免疫磁珠分離人肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜上與乙型肝炎病毒P Γ e S I肽段結(jié)合的蛋白，建立快速分離膜受體蛋白的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離膜受體蛋白的方法，其特征在于:具體為提取膜受體細(xì)胞膜蛋白，以生物素標(biāo)記的P r e S I肽段為釣餌，與提取的膜蛋白4 °C孵育過(guò)夜，入鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠，洗滌磁珠后收集結(jié)合蛋白，通過(guò)S DSPAGE電泳分離結(jié)合蛋白。
【文檔編號(hào)】C07K14/02GK104497108SQ201410739932
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】敖云霞 申請(qǐng)人:敖云霞