膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2β1相互作用的多肽抑制劑及篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2β1相互作用的多肽抑制劑及篩選方法；首次提出的膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2β1相互作用的多肽抑制劑為：LWWNSYY、LRWNSPY和LYWNSGY。根據(jù)分子力學(xué)-泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積分析方法，解析膠原蛋白短肽與血小板表面的整聯(lián)蛋白α2β1相互作用，獲得具有親和作用的關(guān)鍵殘基，藉此構(gòu)建膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α2β1相互作用的多肽抑制劑庫，利用分子對接、均方根偏差比較和分子動(dòng)力學(xué)模擬篩選多肽，獲得與膠原蛋白具有高親和性的多肽抑制劑。通過等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)和血小板吸附實(shí)驗(yàn)證實(shí)所得多肽抑制劑能夠抑制膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α2β1間的結(jié)合，是潛在的高效血栓抑制劑。
【專利說明】膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α 2β 1相互作用的多肽抑制劑及篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及膠原蛋白-整聯(lián)蛋白a 2β I相互作用的多肽抑制劑的理性設(shè)計(jì)流程構(gòu)建并獲得新型多肽抑制劑，屬于生物技術(shù)中的計(jì)算機(jī)模擬和蛋白質(zhì)界面行為研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓形成是由于血管壁發(fā)生病變,使血管內(nèi)皮下組織物暴露于血漿中，誘發(fā)血液凝集并造成血管阻塞的過程，導(dǎo)致器官、組織的缺血性壞死，引發(fā)心血管疾病，如中風(fēng)和心肌梗死。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年死于心血管疾病的人數(shù)遠(yuǎn)高于癌癥，居各類死因之首。其中，由于心肌梗死、腦梗死導(dǎo)致的死亡和殘疾占據(jù)極大比例，對國家的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展造成極大負(fù)面影響。因此，開發(fā)療效顯著、副作用小的血栓防治藥物已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)，具有重要意義。
[0003]血栓癥是由多種因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，包括血小板在破損血管壁處的初始粘附、血小板的穩(wěn)定吸附、以及血小板聚集三個(gè)重要過程。目前，市面上的藥物多為針對血小板聚集過程的抗血小板凝集藥物，例如，阿司匹林(Aspirin)、利多格雷(Ridogrel )、噻氯匹啶(Ticlopidine)等。這類藥物的作用機(jī)理為不可逆抑制血小板胞內(nèi)的關(guān)鍵酶活，從而使血小板處于靜息狀 態(tài)，以達(dá)到抑制血栓形成的目的，但同時(shí)也破壞人體的正常凝血與抗凝血的平衡，存在引發(fā)大規(guī)模出血的風(fēng)險(xiǎn)，有著較大的副作用。目前有研究報(bào)道，整聯(lián)蛋白α2β1的過量表達(dá)將導(dǎo)致血栓的形成，而抑制其表達(dá)僅會(huì)輕微延長出血時(shí)間，并不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的出血不止的問題。因此，通過抑制血小板穩(wěn)定粘附過程中整聯(lián)蛋白α 2β I與膠原蛋白的結(jié)合來抑制血栓的形成，有助于減小大規(guī)模出血的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]整聯(lián)蛋白是一種位于細(xì)胞表面的跨膜蛋白，可以通過與胞外基質(zhì)的相互作用，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)移、吸附和信號傳遞的作用。其中，整聯(lián)蛋白α 2β I在血栓形成過程中對于血小板在膠原蛋白表面的穩(wěn)定粘附起到十分重要的作用。Emsely等人通過晶體衍射對a 2Α結(jié)構(gòu)域的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究。結(jié)果表明，整聯(lián)蛋白α 2β I與膠原蛋白結(jié)合區(qū)域?yàn)閍 2Α結(jié)構(gòu)域，其位于整聯(lián)蛋白α2β1的a亞基中的β螺旋(β-propeller)結(jié)構(gòu)的第二與第三個(gè)β折疊(β-sheet)之間，以5個(gè)反向平行的β折疊的片層結(jié)構(gòu)為中心，周圍圍繞著7個(gè)a螺旋((1-化1^)結(jié)構(gòu)，其中的殘基附54、￥157和!1258都在整聯(lián)蛋白與膠原蛋白結(jié)合中起到關(guān)鍵作用。
[0005]整聯(lián)蛋白α 2β I的配體I型膠原蛋白由兩條a I鏈和一條a 2鏈組成，其中三條a鏈交聯(lián)形成三螺旋結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)被證實(shí)廣泛存在于動(dòng)脈粥樣硬化的患者引起血管梗死的斑塊中。目前，GFOGER (O:羥基脯氨酸)氨基酸序列是被證明是I型膠原蛋白上結(jié)合整聯(lián)蛋白α 2β I親和性最高的位點(diǎn)，序列中的谷氨酸能與a 2Α結(jié)構(gòu)域的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(Metal ion-dependent adhesion site, MIDAS)嵌合的金屬結(jié)合,進(jìn)而與 MIDAS 核心處的氨基殘基D151、S153、S155、T221和D254形成正八面體結(jié)構(gòu)；而精氨酸能與MIDAS位點(diǎn)處的D219通過氫鍵作用結(jié)合。此外，膠原蛋白上的苯丙氨酸能通過其疏水作用與整聯(lián)蛋白疏水區(qū)域結(jié)合。
[0006]由此可見，前人的研究工作主要闡明膠原蛋白上整聯(lián)蛋白α2β1的特異性結(jié)合區(qū)域以及二者相互作用時(shí)相關(guān)聯(lián)的氨基酸殘基。但是，在膠原蛋白與整聯(lián)蛋白結(jié)合界面上，并非所有氨基酸殘基都對二者的結(jié)合起到促進(jìn)作用，對結(jié)合產(chǎn)生決定性作用的關(guān)鍵殘基以及關(guān)鍵作用力和調(diào)控因素尚需深入研究。因此，從分子水平揭示血栓形成過程中膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α 2β I結(jié)合的關(guān)鍵作用力和調(diào)控因素并藉此開發(fā)新型抑制劑對于抗血栓藥物的開發(fā)有著重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)界面行為的研究，尤其是分子之間的結(jié)合過程研究。常用的分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件主要有GROMACS、NAMD, AMBER和CHARMM等。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合分子力學(xué)-泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積分析方法不僅可以獲得模擬體系的各種性質(zhì)，包括構(gòu)象、能量、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及配基-目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的相互作用力等，還能清晰闡述結(jié)合界面上的氨基酸殘基對于結(jié)合是有利還是不利，并評估各氨基酸的相對貢獻(xiàn)和重要程度。[0008]分子對接是兩個(gè)分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識(shí)別的過程。分子對接計(jì)算是把配基分子放在目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)處，按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)和化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則來評價(jià)配基與目標(biāo)蛋白的結(jié)合好壞，并給出兩個(gè)分子的最佳結(jié)合構(gòu)象。就其原理而言，分子對接是一種基于受體的直接設(shè)計(jì)方法。近年來隨著蛋白晶體結(jié)構(gòu)信息的快速增長以及小分子數(shù)據(jù)庫的不斷更新，分子對接已經(jīng)成為基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中的最重要的方法。常用軟件有 DOCK、Autodock 和 FlexX 等。
[0009]采用理性設(shè)計(jì)方法，通過設(shè)計(jì)合理的組合策略可以降低成本。例如，在前期采用諸如分子對接等的計(jì)算速度快但精度有限的方法初步篩選，其后采用MD模擬等計(jì)算量大但更精確的方法篩選，而在后期則采用比較耗時(shí)且成本高的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的在于提出針對膠原蛋白-整聯(lián)蛋白a 2β I相互作用的新型多肽抑制劑的理性設(shè)計(jì)與篩選，所得多肽抑制劑是首次提出并經(jīng)驗(yàn)證是有效的。
[0011]本發(fā)明首次提出的膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2β1相互作用的多肽抑制劑為:LffffNSYY、LRffNSPY 和 LYWNSGY。
[0012]本發(fā)明的的膠原蛋白-整聯(lián)蛋白a 2 β I相互作用的多肽抑制劑篩選方法是，針對膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α 2β I相互作用的新型多肽抑制劑的肽庫構(gòu)建，序列為LXXNSXY，其中X代表20種常見氨基酸的任種。
[0013]利用分子力學(xué)-泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積自由能計(jì)算和分解方法確定整聯(lián)蛋白α2β I中與膠原蛋白結(jié)合的關(guān)鍵殘基為Y157、N154、S155和L220。
[0014]多肽庫構(gòu)建依據(jù)為整聯(lián)蛋白a 2 β I中4個(gè)關(guān)鍵殘基:Υ157、Ν154、S155和L220。
[0015]在肽庫的范圍內(nèi)，利用氨基酸定位法構(gòu)建候選多肽分子庫。
[0016]通過分子對接篩選、均方根偏差比較以及分子動(dòng)力學(xué)模擬復(fù)篩，構(gòu)建針對膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α 2β I相互作用的新型多肽抑制劑的篩選。
[0017]利用Vina分子對接軟件將多肽抑制劑庫中的多肽抑制劑依次與膠原蛋白片段進(jìn)行對接，選取結(jié)合自由能低于-6.5 kcal/mol的多肽抑制劑，共計(jì)177個(gè)。[0018]利用GR0MACS分子模擬軟件自帶的g_rms程序計(jì)算Vina對接得到的177個(gè)多肽抑制劑與整聯(lián)蛋白α2β I中相應(yīng)的關(guān)鍵殘基之間的均方根偏差，選擇25個(gè)多肽抑制劑進(jìn)行下一步的研究。
[0019]根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)和原始結(jié)合模型比對對25個(gè)多肽抑制劑繼續(xù)篩選，選取結(jié)合位點(diǎn)相似的8個(gè)多肽抑制劑進(jìn)行下一步MD模擬研究。
[0020]篩選得到的8個(gè)多肽抑制劑與膠原蛋白片段進(jìn)行MD模擬，再次篩選多肽抑制劑，得到在模擬時(shí)間尺度內(nèi)能與膠原蛋白片段穩(wěn)定結(jié)合的多肽抑制劑，結(jié)合概率Pbind分布在
0.50~1.00的范圍內(nèi)；篩選出LffffNSYY、LRffNSPY和LYWNSGY的結(jié)合能較小而結(jié)合概率較大的高效多肽抑制劑。
[0021]本發(fā)明首次提出的膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2β1相互作用的多肽抑制劑為:LffffNSYY、LRWNSPY和LYWNSGY。根據(jù)分子力學(xué)-泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積分析方法，解析膠原蛋白短肽(GpO)2GFOGER (GPO)3與血小板表面的整聯(lián)蛋白α 2β I相互作用細(xì)節(jié)，獲得整聯(lián)蛋白α2β I中與膠原蛋白短肽具有較高親和作用的關(guān)鍵殘基，藉此構(gòu)建膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α 2β I相互作用的多肽抑制劑庫，利用分子對接、均方根偏差比較和分子動(dòng)力學(xué)模擬篩選候選多肽，獲得與膠原蛋白具有高親和性的多肽抑制劑。隨后通過等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)和血小板吸附實(shí)驗(yàn)證實(shí)所得多肽抑制劑能夠抑制膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α2β1間的結(jié)合，是潛在的高效血栓抑制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α 2 β I相互作用的多肽抑制劑的理性設(shè)計(jì)流程圖
[0023]圖2等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)的熱力學(xué)參數(shù)圖
[0024]圖3血小板吸附實(shí)驗(yàn)效果圖。添加不同樣品的血小板溶液吸光值(600 nm)的測
定
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述，該實(shí)施例是用于解釋、而不以任何方式限制本發(fā)明。
[0026]本發(fā)明針對膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α 2 β I相互作用的新型多肽抑制劑的肽庫構(gòu)建，構(gòu)建依據(jù)為整聯(lián)蛋白α2β I中4個(gè)關(guān)鍵殘基:Υ157、Ν154、S155和L220 ;其特征序列為LXXNSXY，其中X代表20種常見氨基酸的任一一種。
[0027]本發(fā)明的新型多肽抑制劑；理性設(shè)計(jì)方法的應(yīng)用，是在上述肽庫的基礎(chǔ)上，利用氨基酸定位法構(gòu)建候選多肽抑制劑庫:
[0028]
【權(quán)利要求】
1.膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2β I相互作用的多肽抑制劑其特征為:LffffNSYY、LRWNSPY和LYffNSGY0
2.權(quán)利要求1的膠原蛋白-整聯(lián)蛋白α2βI相互作用的多肽抑制劑篩選方法，其特征是針對膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α2β I相互作用的新型多肽抑制劑的肽庫構(gòu)建，序列為LXXNSXY，其中X代表20種常見氨基酸的任一一種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是利用分子力學(xué)-泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積自由能計(jì)算和分解方法確定整聯(lián)蛋白α2β1中與膠原蛋白結(jié)合的關(guān)鍵殘基為Υ157、N154、S155 和 L220。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是多肽庫構(gòu)建依據(jù)為整聯(lián)蛋白α2β1中4個(gè)關(guān)鍵殘基: Y157、N154、S155和 L220。
5.如權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征是:在肽庫的范圍內(nèi)，利用氨基酸定位法構(gòu)建候選多肽分子庫。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是通過分子對接篩選、均方根偏差比較以及分子動(dòng)力學(xué)模擬復(fù)篩，構(gòu)建針對膠原蛋白與整聯(lián)蛋白α2β I相互作用的新型多肽抑制劑的篩選。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是利用Vina分子對接軟件將多肽抑制劑庫中的多肽抑制劑依次與膠原蛋白片段進(jìn)行對接，選取結(jié)合自由能低于-6.5 kcal/mol的多肽抑制劑，共計(jì)177個(gè)。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是利用GR0MACS分子模擬軟件自帶的g_rms程序計(jì)算Vina對接得到的177個(gè)多肽抑制劑與整聯(lián)蛋白α 2β I中相應(yīng)的關(guān)鍵殘基之間的均方根偏差，選擇25個(gè)多肽抑制劑進(jìn)行研究。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)和原始結(jié)合模型比對對25個(gè)多肽抑制劑繼續(xù)篩選，選取結(jié)合位點(diǎn)相似的8個(gè)多肽抑制劑進(jìn)行MD模擬研究。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是篩選得到的8個(gè)多肽抑制劑與膠原蛋白片段進(jìn)行MD模擬，再次篩選多肽抑制劑，得到在模擬時(shí)間尺度內(nèi)能與膠原蛋白片段穩(wěn)定結(jié)合的多肽抑制劑，結(jié)合概率Pbind分布在0.50~1.00的范圍內(nèi)；篩選出LffffNSYY、LRffNSPY和LYWNSGY的結(jié)合能小而結(jié)合概率大的高效多肽抑制劑。
【文檔編號】C07K7/06GK103951731SQ201410151205
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】孫彥, 張麟, 張超 申請人:天津大學(xué)