蜂王漿中得到王漿主蛋白和活性濾后液的超濾膜分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了蜂王漿中得到王漿主蛋白和活性濾后液的超濾膜分離方法。稱取蜂王漿，與水在4℃下攪拌混勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH，用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，再用0.2μm的微孔濾膜去除微粒；采用截留分子量為100kDa的超濾膜M1分離去除大分子雜質(zhì)，再用截留分子量為49kDa的超濾膜M2分離和濃縮M1透過液中的王漿主蛋白，當(dāng)濃縮至1/3體積時，補(bǔ)充純水，讓小分子溶液透過M2，得到的截流液為純化和濃縮的王漿主蛋白溶液，經(jīng)冷凍干燥成為王漿主蛋白凍干粉。小分子溶液含有多糖和10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)，可用于功能飲料生產(chǎn)。本發(fā)明首次用超濾裝置對王漿主蛋白（MRJPs）進(jìn)行分離濃縮，MRJPs的提取率達(dá)到82.63%，經(jīng)冷凍干燥成為蛋白含量大于70%的凍干粉；濾后液用于制備飲料，實(shí)現(xiàn)王漿的綜合利用。
【專利說明】蜂王漿中得到王漿主蛋白和活性濾后液的超濾膜分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及超濾和免疫學(xué)領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及一種蜂王漿中分離得到王漿主蛋白和活性濾后液的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜂王漿(Royal Jelly)是由6~12日齡工蜂頭部的王漿腺(舌腺和鄂腺)分泌，用于喂養(yǎng)飼喂蜂王及幼蟲的特殊乳漿狀物質(zhì)，又名蜂乳、皇漿。蜂王漿含有豐富的蛋白質(zhì)，其中主要水溶性蛋白，即王漿主蛋白(Major Royal Jelly Proteins,MRJPs)占蜂王漿中總蛋白質(zhì)的46%~89%。MRJPs包括MRJPl~9九種蛋白，分子量為49~87kDa，其中含量最為豐富的是MRJP1，占50%左右。MRJPs有促進(jìn)細(xì)胞生長、抗腫瘤、抗菌等生理功能與營養(yǎng)功效。2011年4月24日，日本富山縣立大學(xué)鐮倉昌樹博士在《Nature》首次報道，蜂王漿中的一種57-kDa蛋白(也稱Royalactin，即王漿主蛋白MRJPl單體)是使蜜蜂幼蟲發(fā)育成蜂王的關(guān)鍵活性成分。近年來，MRJPs已成為國內(nèi)外科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。此外，王漿含游離脂肪酸達(dá)26種以上，以10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)最為重要，也是王漿特有的成分，具有抗菌、抗病毒、抑制癌細(xì)胞生長等多種功效，是國際上長期以來評價王漿質(zhì)量的重要指標(biāo)。
[0003]之前已有用離子交換層析、疏水層析、尺寸排阻層析以及離心、透析分離純化蜂王漿活性蛋白的方法報道。如國內(nèi)藍(lán)瑞陽等采用堿提酸沉法和鹽提酸沉法進(jìn)行了蜂王漿蛋白質(zhì)提取，從結(jié)果看存在產(chǎn)物純度低，對蛋白活性影響大，溶劑污染，副產(chǎn)物10-HAD無法利用等問題(藍(lán)瑞陽等 ，2008，蜜蜂雜志，(3):18_20)。日本學(xué)者Salazar-Olivo等用生理鹽水(PBS)低溫溶解王漿24h，低溫離心(4°C，12000g, 30min)方法，從王漿分離出具有促進(jìn)細(xì)胞生長的活性蛋白(Salazar-Olivo 等，Toxicology in Vitro, 2005，19:645-651)。但以往報道的方法普遍存在效率較低，只適合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化。此外，我國和日本已利用蜂王漿開發(fā)生產(chǎn)功能飲料，但都采用了有機(jī)溶劑脫蛋白工藝，造成王漿蛋白資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[(劉進(jìn)等，食品研究與開發(fā)，2003，24 (6) 53-55]。
[0004]超濾膜分離技術(shù)是一種借助外界能量或化學(xué)位的推動，以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，對兩組分或多組分氣體或液體進(jìn)行分離、分級和富集的膜分離方法。超濾膜孔徑為2~20nm,可分離相對分子質(zhì)量為數(shù)千至數(shù)百萬的物質(zhì)如:蛋白質(zhì)、膠體、病毒、熱源、酶、多糖等。與傳統(tǒng)分離方法(蒸發(fā)、萃取或離子交換等)相比，超濾膜分離是在常溫下操作，沒有相變，最適宜對熱敏性物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的分離與濃縮；具有高效、節(jié)能、工藝過程簡單、投資少、污染小等優(yōu)點(diǎn)，在化工、輕工、電子、醫(yī)藥、紡織、生物工程、環(huán)境治理、冶金等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]由于蛋白質(zhì)的尺寸范圍約為5-10nm，分子量可高達(dá)幾十萬以上，屬大分子物質(zhì)，故可應(yīng)用主要截留高分子溶質(zhì)或固體顆粒的超濾膜將蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行濃縮純化。膜的孔徑大小決定能透過膜分子的大小，分子量在某一界限(膜截留分子量)以上的分子會被截留，而分子量小的分子與水溶劑一起透過膜，從而將大于某一相對分子量和小于某一分子量的蛋白質(zhì)分開，這只達(dá)到了分級的目的，因此要提純一種蛋白質(zhì)，可以選用微孔孔徑不同的兩種膜，一種膜孔較小，能使需要的蛋白質(zhì)全部截住，而讓小的蛋白質(zhì)透出，然后將截住在膜內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到孔徑較大的膜內(nèi)，截住較大的蛋白質(zhì)使所需的蛋白質(zhì)流過微孔透出，這樣使蛋白質(zhì)得到了提純。目前，超濾膜應(yīng)用于蛋白純化已很多有文獻(xiàn)報道，并已應(yīng)用于生產(chǎn)。如Ting等用MWCO為I X 104和3X104的PES膜將蛋白濃縮了 6.25和5.92倍(Ting et al.1nt J Food Sci Technol, 2010，45 (8): 1633-1640) Jang等將超濾膜應(yīng)用于大蒜中超氧化物歧化酶SOD的提取分離，通過采用MWCO為I X 105的RC膜、5 X 104的PES膜兩步超濾分離，以及工藝條件pH、離子強(qiáng)度、流速和攪拌速度的優(yōu)化，得到純度為98%、得率為 90%、比活力為 3011U/mg 的 SOD (Wang et a 1.Membr Sci，2010，352 (1/2): 231-238)。超濾技術(shù)的優(yōu)勢在于操作步驟簡單、條件溫和、無需添加化學(xué)試劑。蜂王漿通常含有粗蛋白11%~14.5%、糖20%~30%，王漿蛋白的分子量為49~87kDa，糖的分子量為120~180。對于蜂王漿利用超濾膜分離技術(shù)因?yàn)樾枰婕暗蕉嘁蛩赜绊?，?yōu)化條件難于取得，與層析、離心、透析分離純化等技術(shù)相比沒有優(yōu)勢，所以目前尚無公開的報道(文獻(xiàn)一般僅公開成功的案例)。另外，在實(shí)驗(yàn)室條件下純化某種蛋白易，考慮到規(guī)模生產(chǎn)綜合利用難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蜂王漿中分離得到王漿主蛋白和活性濾后液的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0007]蜂王漿中得到王漿主蛋白和活性濾后液的超濾膜分離方法，包括以下步驟:
[0008]I)稱取蜂王漿，與水在4°C下攪拌混勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH，用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，再用0.2 μ m的微孔濾膜去除微粒；
[0009]2)采用截留分子量為IOOkDa的超濾膜Ml分離去除大分子雜質(zhì)，再用截留分子量為49kDa的超濾膜M2分離和濃縮Ml透過液中的王漿主蛋白，當(dāng)濃縮至1/3體積時，補(bǔ)充純水，讓小分子溶液透過M2，得到的截流液為純化和濃縮的王漿主蛋白溶液。
[0010]步驟2)中所述的 王漿主蛋白溶液經(jīng)冷凍干燥成為王漿主蛋白凍干粉。
[0011]步驟I)中，水與蜂王漿的質(zhì)量比例為5:1 ;pH7，離子強(qiáng)度0.5mol/L。
[0012]步驟2)中所述的小分子溶液含有多糖和10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)，可用于功能飲料生產(chǎn)。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
[0014]I)本發(fā)明首次用超濾裝置對王漿主蛋白(MRJPs)進(jìn)行分離濃縮，得到高收率MRJPs產(chǎn)物。MRJPs的提取率達(dá)到82.63%，經(jīng)冷凍干燥成為蛋白含量大于70%的凍干粉；可用于功能食品和生物制品；現(xiàn)行的提取工藝包括離子交換層析、疏水層析、尺寸排阻層析以及透析方法，這些試驗(yàn)效率很低，蛋白質(zhì)損失大，不適合大批量生產(chǎn)，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0015]2)建立了高效分離王漿中MRJPs的優(yōu)化超濾分離濃縮工藝。
[0016]3)用濃縮MRJPs后的濾后液用于制備飲料，實(shí)現(xiàn)王漿的綜合利用。透過超濾膜的含有糖、10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)的小分子產(chǎn)物經(jīng)濃縮，回收率分別為3.5%和2.11%，可用于功能性飲料生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0018]圖1是是本發(fā)明的超濾裝置示意圖:1.料液槽，2.循環(huán)泵，3.膜組件，4.調(diào)壓閥；
[0019]圖2是本發(fā)明的方法流程；
[0020]圖3是超濾分離產(chǎn)物MRJPs蛋白凍干粉實(shí)物；
[0021]圖4是BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖:以BSA為樣品，經(jīng)梯度稀釋，采用Bradford法，通過紫外分光光度儀測定595nm處的吸光度。以為吸光值OD595為縱坐標(biāo)，BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程:y=0.1878x+0.2264，R2=0.9997 ；
[0022]圖5是水料比對MRJPs提取率的影響結(jié)果示意圖；圖中，在水料比從3:1~5:1變化過程中，MRJPs提取率逐漸提高，當(dāng)水料比為5:1時MRJPs提取率達(dá)到最高；水料比6:1時提取率開始下降；
[0023]圖6是對pH值對MRJPs提取率影響的結(jié)果示意圖；圖中，當(dāng)pH值為7時，MRJPs提取率最高;MRJPs提取率在pH值5到6時迅速提高，在pH值7時達(dá)到最大值；隨后MRJPs提取率逐漸回落；
[0024]圖7是離子強(qiáng)度對MRJPs提取率影響的結(jié)果示意圖；圖中，當(dāng)離子強(qiáng)度為0.5時，MRJPs提取率最高。變化過程中，MRJPs提取率在離子強(qiáng)度0.3到0.5時趨于提高，在離子強(qiáng)度0.5時達(dá)到最大值，隨后MRJPs提取率逐漸回落；
[0025]圖8是MRJPs SDS-PAGE分析結(jié)果示意圖；在最優(yōu)超濾條件下，即水料比5: lmL/g，pH為7，離子(NaCl)強(qiáng)度0.5mol/L獲得的MRJPs SDS-PAGE分析圖，泳道I為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2為鮮王漿；泳道3為最優(yōu)超濾條件下獲得的MRJPs ；
[0026]圖9是MRJPl純化樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；以MRJPl純化樣品為標(biāo)準(zhǔn)抗原，經(jīng)過梯度稀釋，采用Elisa法通過酶標(biāo)儀器測定的450nm處測吸光值。以吸光值OD450為縱坐標(biāo)，MRJPl標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲`線:y=0.036x+0.264，R2=0.993。
【具體實(shí)施方式】
[0027]首先考察pH值、離子強(qiáng)度和水料比對MRJPs提取率的影響，利用Bradford法測定所得樣品的可溶性蛋白MRJPs含量，用凱氏定氮法測定樣品的總蛋白含量。然后通過正交試驗(yàn)得到MRJPs的最優(yōu)分離濃縮工藝，并在最優(yōu)條件下獲得MRJPs樣品。以特異性MRJPl多克隆抗體為一抗，通過酶標(biāo)儀采用Elisa法檢測不同濃度MRJPl蛋白樣品的吸光度，建立吸光度與MRJPl蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以最優(yōu)條件下得到的MRJPs樣品為抗原，檢測樣品吸光度，代入所建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品中的MRJPl的含量。
[0028]1、用超濾裝置從鮮王漿分離濃縮MRJPs的步驟、方法如下:
[0029]稱取50鮮王漿，按一定的水料比例混合，4°C下充分?jǐn)嚢?0min，用NaOH調(diào)節(jié)pH、用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，用0.2 μ m微孔濾膜去除微粒。然后用截留分子量IOOkDa的超濾膜Ml分離去除大分子雜質(zhì)，再用截留分子量為49kDa的超濾膜M2度分離和濃縮Ml透過液中的MRJPs，當(dāng)濃縮至初體積的1/3后，向料液罐不斷補(bǔ)充純水，讓小分子雜質(zhì)全部透過超濾膜M2，得到的截流液為純化和濃縮MRJPs溶液。
[0030]取含MRJPs的濾后液先進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液倒在托盤中，厚度為8~10mm，再將盤置真空冷凍干機(jī)，開動真空冷凍干燥機(jī)，將真空干燥室的溫度降至_40°C，使蜂王漿快速凍結(jié)，然后將真空度控制在IOmmHg左右，使蜂王漿料溫保持在_25°C上下，冷凝器的溫度控制在_501:上下，然后在真空(1.3~13帕)下使其中的水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)，最終使MRJPs脫水成為凍干粉。
[0031]2、MRJPs提取率測定，步驟如下:
[0032](I)可溶性蛋白MRJPs含量測定，步驟如下:
[0033]①取10 μ L全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/mL BSA)稀釋至100 μ L，使終濃度為0.5mg/mL。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別用PBS依次按相同溶液稀釋。
[0034]②按0、1、2、4、8、12、20μ L/孔的加量，將稀釋后BSA標(biāo)準(zhǔn)品分別加到96孔板中，加PBS補(bǔ)足至20 μ L/孔;
[0035]③將適量體積的待測樣品加到96孔板中，加PBS稀釋至20 μ L/孔；
[0036]④每孔加入200 μ L Bradford染色液，輕輕用移液器吹打均勻，室溫靜置3~5min ；
[0037]⑤用酶標(biāo)儀測定吸光度0D595nm，以為吸光度OD595為縱坐標(biāo)，BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4所示):y=0.1878x+0.2264，R2=0.9997。測定待測樣品吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中的蛋白溶度。
[0038](2)總蛋白含量測定，步驟如下:
[0039]稱取0.2~2.0g固體樣品或2~5g半固體樣品或吸取10_20mL液體樣品(約相當(dāng)?shù)?0-40mg)，移入干燥的IOOmL或500mL消化管中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20mL硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，置于硝化爐中硝化，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后繼續(xù)加熱
`0.5h。取下放冷，小心加20mL7jC，放冷后，移入IOOmL容量瓶中，搖勻。取出IOmL溶液，置于福斯2300自動定氮儀，并加入20mL40%Na0H溶液，用10mL2%硼酸溶液作為接受液，蒸餾定氮。測定結(jié)果采用下式計(jì)算:X=[ (V1-V2)XNX0.014)/(mX (10/100)) ] XFX 100% (其中:X:樣品中蛋白質(zhì)的百分含量，g ；V1:樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL ；V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL ；N:硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.014:1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液ImL相當(dāng)于氮克數(shù)；m:樣品的質(zhì)量(體積)，g (mL)；F:氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。)
[0040](3 ) MRJPs提取率計(jì)算
[0041]根據(jù)所測定MRJPs及總蛋白含量計(jì)算MRJPs提取率，MRJPs提取率％=可溶性蛋白MRJPs含量/總蛋白含量X 100%
[0042]3、單因素試驗(yàn)
[0043]考察pH值、水料比和離子強(qiáng)度對MRJPs提取率的影響，方法步驟如下:
[0044](I)稱取50g鮮王漿，在pH值為7、離子強(qiáng)度0.5的條件下溶解，通過超濾膜裝置分離濃縮MRJPs，然后采用Bradford法測定樣品中MRJPs的吸光度，根據(jù)公式[MRJPs提取率(％)=MRJPs質(zhì)量/蜂王漿總蛋白質(zhì)量X 100]得出MRJPs提取率，考察水料比對MRJPs提取率的影響。
[0045](2)稱取50g鮮王漿，在離子強(qiáng)度0.5、水料比(v/m) 6:1條件下溶解，通過超濾膜濃縮MRJPs ;然后用Bradford法測定樣品中MRJPs的吸光度，根據(jù)公式MRJPs提取率(％)=MRJPs質(zhì)量/蜂王漿總蛋白質(zhì)量X 100，得出MRJPs提取率。
[0046](3)稱取50g鮮王漿，在水料比(mL/g) 6: 1、pH值7條件下溶解，通過超濾膜分離濃縮MRJPs ;用Bradford法測定樣品的MRJPs吸光度，根據(jù)公式[MRJPs提取率(％) =MRJPs質(zhì)量/蜂王漿總蛋白質(zhì)量X 100]得出MRJPs提取率。
[0047]4、正交試驗(yàn)
[0048]根據(jù)MRJPs提取率，選擇最優(yōu)參數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，最佳提取條件:在水料比5:1 (mL/g)的條件下，用0.5mol/L的NaCl溶液溶解蜂王漿，調(diào)節(jié)pH值至7。根據(jù)最佳工藝條件進(jìn)行MRJPs提取驗(yàn)證，測得MRJPs提取率為82.63%, MRJPs提取率高于正交試驗(yàn)其它組合。
[0049]5、MRJPs提取物的SDS-PAGE檢測，分別將鮮王漿和超濾獲得的MRJPs產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測，比較MRJPs與鮮王漿蛋白條帶差異。 [0050]6、MRJPl的Elisa檢測，分別將鮮王漿和超濾獲得的MRJPs濃縮樣品的吸光度代入MRJPl蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出兩者的MRJPl含量，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程(如圖 8 所示):y=0.036x+0.264，R2=0.993。
[0051]7、鮮王漿及濾后液中10-HDA含量測定:所得產(chǎn)物及鮮王漿參照GB9697-2008中10-HDA的HPLC測定方法測定10-HDA含量。10-HDA回收利用率按照下式進(jìn)行計(jì)算:10-HDA回收利用率(％)=濾后液10-HAD質(zhì)量/新鮮王漿中10-HDA質(zhì)量X 100%。
[0052]8、鮮王漿及濾后液中總糖含量測定:分別取鮮王漿及最優(yōu)條件下所得濾后液凍干物，參照GB/T9695.3-2008中總糖的測定方法測定總糖含量。按照下式進(jìn)行計(jì)算:總糖回收利用率(％)=濾后液中總糖質(zhì)量/新鮮王漿中總糖質(zhì)量X 100%。
[0053]實(shí)施例1鮮王漿中MRJPs超濾分離濃縮
[0054]1、用超濾膜從鮮王漿中分離濃縮MRJPs工藝
[0055]原理:由于蜂皇漿中通常含有11%~14.5%王漿粗蛋白、20%~30%糖，王漿主蛋白的分子量為49~87kDa,糖的分子量為150~200,可以預(yù)計(jì)，用截留分子量49kDa的超濾膜可高效截留王漿主蛋白，并可有效地將其與糖等低分子量組份分開，達(dá)到提純、濃縮目的。
[0056]操作流程:采用圖1所示超濾裝置(料液槽1、循環(huán)泵2、膜組件3、調(diào)壓閥4順次相連)，按圖2方法流程，操作。稱取50g鮮王漿，按一定的料水比例混合，4°C下充分?jǐn)嚢?0min，用NaOH調(diào)節(jié)pH、用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，用0.2 μ m微孔濾膜去除微粒。然后用截留分子量IOOkDa的內(nèi)壓式聚砜中空纖維超濾膜組件Ml分離去除大分子雜質(zhì)，再用截留分子量為49kDa的透過膜組件M2度分離和濃縮Ml透過液中的MRJPs，當(dāng)濃縮至初體積的1/3后，向料液罐不斷補(bǔ)充純水，讓小分子雜質(zhì)全部透過膜M2，得到的截流液為純化和濃縮MRJPs溶液。
[0057]取含MRJPs的濾后液先進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液倒在托盤中，厚度為8~10mm，再將盤置真空冷凍干機(jī)，開動真空冷凍干燥機(jī)，將真空干燥室的溫度降至_40°C，使蜂王漿快速凍結(jié)，然后將真空度控制在IOmmHg左右，使蜂王漿料溫保持在_25°C上下，冷凝器的溫度控制在-50°C上下，然后在真空(1.3~13帕)下使其中的水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)。真空低溫干燥持續(xù)進(jìn)行12小時左右后，至MRJPs的水分已降至10%左右，繼續(xù)干燥。此時提高干燥室的溫度至30°C，最高不超過40°C，持續(xù)4~5小時，讓水分快速蒸發(fā)，使MRJPs水分含量降低到2%左右，即完成干燥過程得到凍干粉(圖3)。
[0058]2、MRJPs提取率測定
[0059](I)可溶性蛋白MRJPs含量測定，具體步驟如下:[0060]①取10 μ L蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/mL BSA)稀釋至100 μ L，使終濃度為0.5mg/mL。將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用PBS分別依次按相同溶液稀釋。
[0061]②將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品(0.5mg/mL BSA)按O、1、2、4、8、12、20 μ L/孔加量分別加到96孔板中，加PBS將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足至20 μ L ;
[0062]③將適量體積實(shí)驗(yàn)蛋白樣品加到96孔板的樣品空中，加稀釋液至20 μ L ;
[0063]④每孔加入200 μ L Bradford染色液，輕輕用加樣槍吹打均勻，室溫靜止3~5min ；
[0064]⑤酶標(biāo)儀測定A595nm (595nm是蛋白質(zhì)最大吸收光譜)的吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到吸光度與蛋白濃度的回歸方程。測定待測樣品的吸光度，代入回歸方程(如圖4所示):y=0.1878x+0.2264, R2=0.9997 (其中y表示OD595值，x表示MRJPs含量)計(jì)算出樣品的蛋白含量。
[0065](2)總蛋白含量測定，具體步驟如下:
[0066]稱取0.2-2.0g固體樣品或2_5g半固體樣品或吸取10_20mL液體樣品(約相當(dāng)?shù)?0-40mg)，移入干燥的IOOmL或500mL消化管中，加入硫酸銅0.2g，硫酸鉀6g及硫酸20mL，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，置于硝化爐中硝化，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱
0.5h。取下放冷，小心加20mL7jC，放冷后，移入IOOmL容量瓶中，搖勻。取出IOmL溶液，置于福斯2300自動定氮儀，并加入20mL40%Na0H溶液，用10mL2%硼酸溶液作為接受液，蒸餾定氮。測定結(jié)果采用下式計(jì)算:X=[ (V1-V2)XNX0.014)/(mX (10/100)) ] XFX 100% (其中:X:樣品中蛋白質(zhì)的百分含量，g ；Vj:樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL ；V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL ；N:硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.014:1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液ImL相當(dāng)于氮克數(shù);m:樣品的質(zhì)量(體積)，g (mL)；F:氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。)
[0067]3、MRJPs超濾分離濃縮工藝條件優(yōu)化
[0068](I)單因素試驗(yàn)
[0069]首先進(jìn)行單因素分析，考察水料比例(因素I)、pH (因素2)、離子強(qiáng)度(因素3)對MRJPs提取率的影響。
[0070]操作過程如下:稱取適量蜂王漿，按一定的水料比例混合(因素1)，4°C下充分?jǐn)嚢?0min，用NaOH調(diào)節(jié)pH (因素2)、用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度(因素3)，進(jìn)行超濾、濃縮，測定MRJPs含量，冷凍干燥，稱量MRJPs得到提取率。
[0071 ] ②水料比對MRJPs提取率的影響:稱取50g鮮王衆(zhòng)，與不同比例的水溶液(pH值為7、離子強(qiáng)度0.5)混合，溶解，通過超濾膜分離、濃縮MRJPs。然后用Bradford法測定樣品中MRJPs的含量，根據(jù)公式=MRJPs提取率(％)=MRJPs適當(dāng)質(zhì)量/蜂王漿總蛋白質(zhì)量X 100，得出MRJPs提取率，比較不同水料比對MRJPs提取率的影響。結(jié)果(圖5)顯示，在水料比從3:I~5:1變化過程中，MRJPs提取率逐漸提高，當(dāng)水料比為5:1 (5mL水:Ig王漿)時MRJPs提取率達(dá)到最聞；水料比6: I (6mL/g)時提取率開始下降(圖5)。
[0072]②pH值對MRJPs提取率的影響:稱取50g鮮王漿，在離子強(qiáng)度0.5、水料比(mL/g)為6:1的條件下溶解,調(diào)節(jié)pH值,通過超濾膜分離、濃縮MRJPs ;然后用Bradford法測定樣品中MRJPs的含量，根據(jù)公式=MRJPs提取率(％)=MRJPs質(zhì)量/蜂王漿總蛋白質(zhì)量X 100，得出MRJPs提取率，比較不同pH值對MRJPs提取率的影響。結(jié)果(圖5)顯示，當(dāng)pH值為7時，MRJPs提取率最高;MRJPs提取率在pH值5到6時迅速提高，在pH值7時達(dá)到最大值；隨后MRJPs提取率逐漸回落(圖6)。
[0073]③考察離子強(qiáng)度對MRJPs提取率的影響:稱取50g鮮王漿，在水料比(mL/g)為6:1、pH值7的條件下，調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，通過超濾膜儀器濃縮MRJPs ;然后用Bradford法測定樣品中MRJPs的含量，根據(jù)公式MRJPs:提取率(％)=MRJPs質(zhì)量/蜂王漿總蛋白質(zhì)量X 100，得出MRJPs提取率，比較不同離子強(qiáng)度對MRJPs提取率的影響。結(jié)果(圖7)顯示，當(dāng)離子強(qiáng)度為0.5時，MRJPs提取率最高。變化過程中，MRJPs提取率在離子強(qiáng)度0.3到0.5時趨于提高，在離子強(qiáng)度0.5時達(dá)到最大值，隨后MRJPs提取率逐漸回落(圖8)。
[0074](2)正交試驗(yàn)
[0075]根據(jù)上述料水比例、pH值、離子濃度三個單因素對MRJPs提取率的影響，每個因素選定三個水平，進(jìn)行3因素(水料比、pH值、離子濃度)組合正交試驗(yàn)分析。正交試驗(yàn)因素水平見表(表1)。正交結(jié)果(表2)及極差分析結(jié)果(表3)表明，影響MRJPs提取率影響因素依次是PH (B)〉離子強(qiáng)度(C)〉水料比(A)，影響效果達(dá)到顯著水平(p〈0.05)。最佳提取條件是A3B2C2,即在水料比5:1的條件下，用0.5mol/L的NaCl溶液溶解蜂王漿，調(diào)節(jié)pH值至7。根據(jù)最佳工藝條件進(jìn)行MRJPs提取驗(yàn)證，測得MRJPs提取率為82.63%，MRJPs提取率高于正交試驗(yàn)其它組合。
[0076]表1正交試驗(yàn)因素水平
【權(quán)利要求】
1.一種蜂王漿中得到王漿主蛋白和活性濾后液的超濾膜分離方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)稱取蜂王漿，與水在4°c下攪拌混勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH，用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，再用0.2 μ m的微孔濾膜去除微粒； 2)采用截留分子量為100kDa的超濾膜Ml分離去除大分子雜質(zhì)，再用截留分子量為49 kDa的超濾膜M2分離和濃縮Ml透過液中的王漿主蛋白，當(dāng)濃縮至1/3體積時，補(bǔ)充純水，讓小分子溶液透過M2，得到的截流液為純化和濃縮的王漿主蛋白溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的王漿主蛋白溶液經(jīng)冷凍干燥成為王漿主蛋白凍干粉。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，水與蜂王漿的質(zhì)量比例為5:1 ；pH 7，離子強(qiáng)度 0.5 mol/Lo
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的小分子溶液含有多糖和10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)，可用于功能`飲料生產(chǎn)。
【文檔編號】C07K1/34GK103772497SQ201410013192
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】沈立榮, 李玫璐, 于張穎, 周志軍, 譚量量, 趙敏潔, 尹志紅, 裘衛(wèi) 申請人:浙江大學(xué), 杭州碧于天保健品有限公司