專利名稱：一種蘋果渣中根皮苷的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多酚類物質(zhì)提純技術(shù)，特別涉及一種蘋果渣中根皮苷的分離純化方法。
背景技術(shù)：
多酚類物質(zhì)具有很多獨(dú)特的作用，目前多酚物質(zhì)的應(yīng)用越來越廣泛。多酚是多羥基酚類化合物的總稱，在植物體中廣泛存在，又稱為單寧。多酚的獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予了它很多獨(dú)特的功能，如多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗動(dòng)脈硬化等多種功效。目前，國內(nèi)外研究的多酚制備方法有化學(xué)合成法和提取分離法，前者雖然可以得到純度較高的多酚產(chǎn)品但是產(chǎn)品的安全性較差，并需要 消耗大量的合成原料和合成能量；后者由于其具有制得的產(chǎn)品安全性高、原料來源廣泛、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)而受到了廣泛的關(guān)注。另外，采用提取分離法可以從很多工業(yè)化生產(chǎn)的廢料中制備多酚，對(duì)工業(yè)廢料可以實(shí)現(xiàn)綜合再利用，因此，目前多酚制備的研究聚焦在了提取分離方法上。根皮苷屬于多酚類物質(zhì)，分子式為C21H24Oltl,為多酚物質(zhì)中植物黃酮類中的二氫查爾酮苷。根皮苷主要存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實(shí)中，具有多種生物活性，如調(diào)節(jié)血壓、血糖，保護(hù)心臟、清除體內(nèi)自由基及美白等，并且還具有低毒的特點(diǎn)。目前，從植物中提取根皮苷的主要原料為蘋果植物，近年來在多穗柯植物中也發(fā)現(xiàn)了含量比較豐富的根皮苷。但是，其提取分離方法僅限于粗提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，為蘋果渣深度加工和綜合利用以及根皮苷的制備開辟一條新的途徑。在蘋果榨汁過程中，大部分多酚物質(zhì)隨果皮和果芯而轉(zhuǎn)移到果渣中，因此，蘋果渣中含有較多的多酚物質(zhì)，其中含量較多的為根皮苷。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。一種蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟:(I)粗提:將重量比為1:8-1:12的蘋果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液體積比為50-70%，再在60-80°C恒溫水浴鍋中重復(fù)浸提、過濾，合并濾液，離心分離，得上清液為蘋果渣的粗提溶液；(2)吸附:將蘋果渣的粗提溶液作為吸附液，調(diào)節(jié)蘋果渣的粗提溶液pH值為3.5-4.0后，采用D-101大孔吸附樹脂對(duì)蘋果渣的粗提溶液中的根皮苷進(jìn)行樹脂吸附；(3)洗脫:采用pH值為7.0、體積濃度75%_90%的乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫、濃縮、干燥，得純化根皮苷粉。上述技術(shù)方案的步驟(2)中，吸附工藝參數(shù)影響吸附率的權(quán)重關(guān)系是:吸附液流速 > 吸附液pH>吸附液濃度。優(yōu)選地，在步驟(2)進(jìn)行樹脂吸附前，先對(duì)蘋果渣的粗提溶液進(jìn)行取樣，對(duì)樣品濃縮、烘干、稱重，計(jì)算粗提溶液濃度，通過濃縮或加水調(diào)節(jié)粗提溶液濃度為0.4-0.5mg/mL ；更優(yōu)選地，在進(jìn)行樹脂吸附前，粗提溶液濃度為0.45mg/mL。優(yōu)選地，步驟(2)中調(diào)節(jié)蘋果渣的粗提溶液pH值時(shí)采用檸檬酸或醋酸。上述技術(shù)方案的步驟(3)中，洗脫工藝參數(shù)影響洗脫率的權(quán)重關(guān)系是:乙醇洗脫液pH>乙醇洗脫液濃度 > 洗脫溫度。優(yōu)選地，在步驟(3)進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫溫度為65_75°C ;更優(yōu)選地，在步驟(3)進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫溫度為70°C。本發(fā)明以蘋果渣為原料，以根皮苷為分離純化對(duì)象，采用有機(jī)溶劑提取法制備粗提物，研究最佳的分離純化條件，使得根皮苷在蘋果渣粗提物干粉的濃度為0.78% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))經(jīng)本發(fā)明的分離純化產(chǎn)物干粉中濃度為17.23% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))，其提純效果得到質(zhì)的提高，蘋果渣深度加工和綜合利用提供參考，同時(shí)為尋找高純度根皮苷的制備原料開辟一條新的途徑。


圖1為不同型號(hào)的樹脂對(duì)蘋果渣根皮苷粗提溶液的吸附率和洗脫率柱狀圖；圖2為不同的上樣濃度影響D-101樹脂吸附率的曲線
圖3為不同的吸附流速影響D-101樹脂吸附率的曲線圖；圖4為不同的洗脫液pH影響樹脂洗脫率的曲線圖；圖5為不同濃度的乙醇洗脫液影響樹脂洗脫率的曲線圖；圖6為不同流速的乙醇洗脫液影響樹脂洗脫率的曲線圖。

發(fā)明內(nèi)容
下面結(jié)合附圖和具體驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。一、實(shí)驗(yàn)方案(I)蘋果渣中根皮苷粗提溶液的制備將體積比60%的乙醇溶液按照1:10的料液比與杜仲葉粉混合，70°C恒溫水浴鍋中浸提5h，浸提2次，過濾，合并濾液，離心分離，上清液為蘋果渣中根皮苷粗提溶液。將粗提溶液減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉。使用時(shí)，用水溶解，重新得粗提溶液，其PH值時(shí)采用檸檬酸或醋酸。工業(yè)生產(chǎn)中，具體是:將重量比為1:8-1:12的蘋果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液體積比為50-70%，再在60-80°C恒溫水浴鍋中重復(fù)浸提、過濾，合并濾液，離心分離，得上清液為蘋果渣的粗提溶液，調(diào)節(jié)其濃度和PH值后直接使用。(2)根皮苷的測定采用高效液相色譜法檢測各樣品中的根皮苷。將一定濃度的蘋果渣根皮苷樣品溶液濃縮，濃縮液經(jīng)過孔徑0.45 μ m濾膜過濾，進(jìn)樣測定根皮苷含量。(3)樹脂預(yù)處理按照LS-6、HPD-600、XDA-8、D-101和D4020這5種大孔吸附樹脂說明書所述方法，對(duì)這5種樹脂進(jìn)行預(yù)處理及再生處理，待用。(a)樹脂的優(yōu)選效果對(duì)比準(zhǔn)確稱取用濾紙吸干表面水分的經(jīng)過預(yù)處理的樹脂lg(精確到0.0OOlg)，置于250mL三角瓶中，加入已知濃度的蘋果根皮苷粗提溶液IOOmL,避光密封，置于恒溫水浴振蕩器中，25°C，120r/min振蕩24h。濾出樹脂，用蒸餾水洗去表面殘留多酚溶液后用濾紙吸干表面水分備用，測定容液中剩余根皮苷濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算樹脂吸附率:吸附率A (%) = [ (C0 - Ce) /C0] X 100%式中=Ctl為粗提溶液中根皮苷的起始濃度，mg/mL ；Ce為吸附平衡時(shí)溶液中的總多酚濃度mg/mL ；A為吸附率，％。量取體積比90%的乙醇溶液IOOmL,于 25°C下振蕩洗脫吸附了蘋果根皮苷的樹脂2h,測定解吸液中總多酚濃度，計(jì)算洗脫率，公式如下:洗脫率D (%) =CdVd/ [ (C0 — Ce) X VA] X 100%式中:D為洗脫率，％ ；CD為洗脫液中總多酚濃度，mg/mL ；VA為吸附液體積，mL ；VD為洗脫液體積，HlL。以吸附率、洗脫率兩個(gè)指標(biāo)說明樹脂的優(yōu)選效果，并進(jìn)行后續(xù)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)研究。(b)上樣濃度(蘋果渣中根皮苷粗提溶液濃度)對(duì)根皮苷吸附率影響取5份樣品濃度分別為0.15,0.30,0.45,0.60,0.75mg/mL的溶液，體積相同并在相同的吸附柱上吸附，收集洗脫液，用HPLC法測定其洗脫液中根皮苷的含量，從而計(jì)算大孔樹脂的吸附率。(C)吸附流速對(duì)吸附率的影響對(duì)6份相同的樣品溶液在相同的吸附柱上進(jìn)行吸附，并且分別在流速為0.5、1.0、1.5,2.0,2.5,3.0mL/min條件下進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。用HPLC測定其洗脫液中根皮苷的含量，從而計(jì)算大孔樹脂的吸附率。(d)洗脫液pH對(duì)洗脫率的影響調(diào)節(jié)洗脫劑的pH值，用3、4、5、6、7、8、9、10、11等9種不同pH值的乙醇溶液在相
同的流速和相同的乙醇濃度下進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用HPLC法測定其洗脫液中根皮苷的含量，從而計(jì)算大孔樹脂的洗脫率。(e)乙醇洗脫液濃度對(duì)洗脫效果的影響對(duì)6份相同的樣品溶液在相同流速和相同的吸附柱上進(jìn)行吸附，然后分別用相同體積的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇進(jìn)行洗脫，減壓濃縮回收乙醇后，用HPLC測定其洗脫液中根皮苷的含量，從而計(jì)算大孔樹脂的洗脫率。(f)洗脫劑流速對(duì)洗脫效果的影響對(duì)5份相同的樣品溶液，在相同的條件進(jìn)行吸附，然后在0.5、1.0、1.5,2.0,2.5、
3.0mL/min的條件下進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用HPLC法測定根皮苷濃度，計(jì)算出不同流速下的解吸率。二、效果對(duì)比 (I)樹脂優(yōu)選效果對(duì)比5種不同型號(hào)的樹脂對(duì)蘋果渣根皮苷粗提溶液的吸附率和洗脫率如圖1所示。從表I可以看出，吸附率最高的樹脂是XDA-8樹脂，其次是D-1Ol和D4020 ;洗脫率最高的是D-101，其次是D4020。D-1Ol樹脂具有較高的吸附率和最高的洗脫率，符合發(fā)明人綜合優(yōu)選D-1Ol樹脂作為分離蘋果渣中根皮苷的樹脂。(2)上樣濃度對(duì)根皮苷吸附率的影響效果對(duì)比
不同的上樣濃度對(duì)D-101樹脂吸附率的影響如圖2所示。由圖可以看出，上樣液濃度(即吸附液濃度)由0.15mg/mL上升到0.45mg/mL，樹脂的吸附率隨之上升；而上樣液濃度由0.45mg/mL上升到0.75mg/mL時(shí)，樹脂的吸附率卻隨之下降。吸附過程中，上樣濃度過小，吸附效率低；上樣濃度過大，會(huì)發(fā)生多層吸附，也會(huì)使吸附率降低。結(jié)果顯示，發(fā)明人選用0.45mg/mL這個(gè)濃度比較適合，且吸附率較高，選用0.45mg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)上樣濃度。(3)吸附流速對(duì)根皮苷吸附率的影響效果對(duì)比不同的吸附流速對(duì)樹脂吸附率的影響如圖3所示。由圖3可以看出，吸附流速從1.0mL/min增大到6.0mL/min,吸附率不斷下降。上樣吸附的流速大，樣品溶液與樹脂床接觸的時(shí)間就被縮短，因此樹脂吸附根皮苷的量就變少，從而導(dǎo)致樹脂吸附率下降。吸附流速在lmL/min時(shí)，根皮苷的吸附率達(dá)到最高；在6mL/min根皮苷的吸附率達(dá)到最低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選擇lmL/min的吸附速率進(jìn)行吸附。(4)乙醇洗脫液pH對(duì)根皮苷洗脫率的影響效果對(duì)比不同的洗脫液pH對(duì)樹脂洗脫率的影響如圖4所示。由圖4可以看出，pH值由3上升到7時(shí)，洗脫率隨之上升；pH值由7上升到11時(shí)，洗脫率隨之下降，即在pH為7時(shí)洗脫率最高。根皮苷屬于中性極的物質(zhì)，可以被偏中性的洗脫液很好地洗脫。發(fā)明人優(yōu)選乙醇洗脫液，PH為7。(5)乙醇洗脫液濃度對(duì)洗脫效果的影響

不同濃度的乙醇洗脫液對(duì)樹脂洗脫率的影響如圖5所示。由圖5可以看出，隨著乙醇濃度的增大，洗脫率也隨之增大。這可能是因?yàn)殡S乙醇濃度增加，洗脫劑的極性降低，對(duì)樹脂的洗脫能力就越強(qiáng)，根皮苷在洗脫液中的溶解性越好。發(fā)明人選用高濃度的乙醇溶液，即體積濃度75%-90%乙醇溶液，作為洗脫劑。(6)洗脫劑流速對(duì)洗脫效果的影響不同流速的乙醇洗脫液對(duì)樹脂洗脫率的影響如圖6所示。由圖6可以看出，隨著洗脫劑流速的不斷增加，解吸率不斷減小。流速增大，導(dǎo)致洗脫液與樹脂接觸的時(shí)間短，樹脂床中吸附的根皮苷還沒有被充分洗脫，洗脫液就已經(jīng)流過樹脂床了。因此，洗脫流速不宜過大，實(shí)驗(yàn)室選擇0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫。三、進(jìn)一步研究和結(jié)論(I)發(fā)明人進(jìn)一步研究D-1Ol樹脂對(duì)蘋果渣中根皮苷的吸附率，其中，吸附工藝參數(shù)影響吸附率的權(quán)重關(guān)系是:吸附液流速〉吸附液PH>吸附液濃度。換言之，吸附工藝參數(shù)影響吸附率的權(quán)重關(guān)系由大到小依次是:吸附液流速、吸附液pH、吸附液濃度。最優(yōu)吸附條件:吸附液濃度0.5mg/mL、吸附液pH值4、吸附流速(實(shí)驗(yàn)室LOmL/min,)在此條件下吸附率可達(dá)到69.87% ;工業(yè)生產(chǎn)中，選用可容忍的最低吸附流速即可。將吸附液濃度、吸附液pH和吸附流速作為動(dòng)態(tài)吸附的3個(gè)考察因素，每個(gè)因素為3個(gè)水平，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)以吸附率為響應(yīng)值。按照三因素三水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)，驗(yàn)證各影響因素對(duì)吸附率影響的結(jié)果如表I所示，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表2所示。由表2結(jié)果可驗(yàn)證，該回歸模型F檢驗(yàn)極顯著(P〈0.001)，失擬檢驗(yàn)不顯著(P>0.05)，其決定系數(shù)R2=0.9514，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.8889，表明此二次回歸模型擬合性較好，響應(yīng)值的變化95.14%與所選變量有關(guān)，回歸方程能較好地描述各影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。各影響因素中，吸附液PH和吸附流速的二次方對(duì)吸附率的影響極顯著(P〈0.01)。由F值大小可以看出，各影響因素對(duì)吸附率的影響順序?yàn)?吸附流速〉吸附pH>吸附液濃度。數(shù)據(jù)分析與處理采用Design_Expert7.0軟件處理和分析試驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)回歸分析，得出該模型因素實(shí)際值的二次回歸方程為:Rl=-1l.17-129.95A+29.5275B+98.34C+4.5AB-26.0AC-0.3BC+163.0A2-3.9925B2-41.07C2 ;對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理,驗(yàn)證最優(yōu)吸附條件:吸附液濃度0.5mg/mL、吸附液pH值4、吸附流速(實(shí)驗(yàn)室1.0mL/min);同時(shí)，工業(yè)生產(chǎn)中采用吸附液濃度0.5mg/mL、吸附液PH值4、可容忍的最低吸附流速，結(jié)論一致。此外，工業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)蘋果渣的粗提溶液(即吸附液)進(jìn)行取樣，對(duì)樣品濃縮、烘干、稱重，計(jì)算粗提溶液濃度，通過濃縮或加水調(diào)節(jié)粗提溶液濃度0.4-0.5mg/mL ;調(diào)節(jié)蘋果渣的粗提溶液PH值(吸附液pH值)時(shí)采用食品級(jí)的檸檬酸或醋酸來實(shí)現(xiàn)。表1D-101樹脂吸附試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)粗提:將重量比為1:8-1:12的蘋果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液體積比為50-70%，再在60-80°C恒溫水浴鍋中重復(fù)浸提、過濾，合并濾液，離心分離，得上清液為蘋果渣的粗提溶液； (2)吸附:將蘋果渣的粗提溶液作為吸附液，調(diào)節(jié)蘋果渣的粗提溶液pH值為3.5-4.0后，采用D-101大孔吸附樹脂對(duì)蘋果渣的粗提溶液中的根皮苷進(jìn)行樹脂吸附； (3)洗脫:采用pH值為7.0、體積濃度75%-90%的乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫、濃縮、干燥，得純化根皮苷粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，在步驟(2)中，吸附工藝參數(shù)影響吸附率的權(quán)重關(guān)系是:吸附液流速 > 吸附液PH>吸附液濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，在步驟(2)進(jìn)行樹脂吸附前，先對(duì)蘋果渣的粗提溶液進(jìn)行取樣，對(duì)樣品濃縮、烘干、稱重，計(jì)算粗提溶液濃度，通過濃縮或加水調(diào)節(jié)粗提溶液濃度為0.4-0.5mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，在進(jìn)行樹脂吸附前，粗提溶液濃度為0.45mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中調(diào)節(jié)蘋果渣的粗提溶液PH值時(shí)采用檸檬酸或醋酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，在步驟(3)中，洗脫工藝參數(shù)影響洗脫率的權(quán)重關(guān)系是:乙醇洗脫液pH>乙醇洗脫液濃度 > 洗脫溫度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，在步驟(3)進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫溫度為65-75°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，，在步驟(3)進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫溫度為70°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及多酚類物質(zhì)提純技術(shù)，公開了一種蘋果渣中根皮苷的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟(1)粗提將重量比為18-1:12的蘋果渣和浸提乙醇溶液混合，浸提乙醇溶液體積比為50-70%，再在60-80℃恒溫水浴鍋中重復(fù)浸提、過濾，合并濾液，離心分離，得上清液為蘋果渣的粗提溶液；(2)吸附將蘋果渣的粗提溶液作為吸附液，調(diào)節(jié)蘋果渣的粗提溶液pH值為3.5-4.0后，采用D-101大孔吸附樹脂對(duì)蘋果渣的粗提溶液中的根皮苷進(jìn)行樹脂吸附；(3)洗脫采用pH值為7.0、體積濃度75%-90%的乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫、濃縮、干燥，得純化根皮苷粉。
文檔編號(hào)C07H15/203GK103214530SQ201310109318
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者尚華, 劉迪 申請(qǐng)人:陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院