用于快速多重擴增str基因座的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供多重聚合酶鏈式反應(PCR)擴增短串聯(lián)重復序列(STR)基因座的方法，其可用于從靶核酸快速產(chǎn)生高特異性STR譜。所得的STR譜可以用于法律執(zhí)行、國土安全、軍事、情報和親子測試應用中的人類鑒定目的。
【專利說明】用于快速多重擴增STR基因座的方法和組合物
[0001]通過引用納入
[0002]本申請通過引用將以下申請的全文納入作為參考:標題為“RuggedizedApparatus for Analysis ofNucleic Acid and Proteins (用于核酸和蛋白質分析的強化設備)”的美國申請序列號11 / 132，712 ;標題為“Methods for Rapid MultiplexedAmplification of Target Nucleic Acids (用于祀核酸的快速多重擴增的方法)”的美國申請序列號 12 / 080，746 ;標題為 “Plastic Microfluidic Separation and DetectionPlatforms(塑料微流體分離與檢測平臺)”的美國申請序列號12 / 080，745;標題為“Integrated Nucleic Acid Analysis (完整核酸分析)”的美國申請序列號 12 / 080,751和標題為“Unitary Biochips (整體型生物芯片)”的美國申請序列號13 / 044,485。
[0003]政府支持
[0004]本發(fā)明在國土安全部(Departmentof Homeland Security)的 SBIR 資金N10PC2010S號的政府資助下完成。政府可享有本發(fā)明的某些權利。
發(fā)明領域
[0005]本發(fā)明一般涉及用于核酸樣品內的短串聯(lián)重復序列(Short Tandem Repeat)基因座的快速擴增的組合物和方法。
[0006]發(fā)明背景
[0007]聚合酶鏈式反應(PCR)是促進核酸序列在體外快速指數(shù)型擴增的酶促反應。在法醫(yī)學中，可使用PCR來鑒定個體，該鑒定基于對含有一類稱為短串聯(lián)重復序列(STR)的重復DNA的人基因組的小區(qū)域擴增來進行。給定的STR重復的單位長度為2~10個堿基對，并且STR通常落入非編碼和側接序列內，但偶爾在編碼區(qū)內(Edwards等，Am.J.Hum.Genet.1991，49，746-756)。人類基因組中有數(shù)十萬個STR基因座，平均每6~IOkb出現(xiàn)一個(Beckman和Weber, Genomicsl992,12，627-631)，并且這些中的許多是高多態(tài)性的(Edwards 等，Trans.Assoc.Am.Physiciansl989,102,185-194)。STR 分析已經(jīng)成為法醫(yī)醫(yī)療設備中的主要工具，具有越來越多的應用，包括法律執(zhí)行、親子測試、大規(guī)模災難中的人類鑒定和常規(guī)的兒童分型。
[0008]發(fā)明概述
[0009]一方面，本發(fā)明提供了用于STR基因座的多重擴增的方法，所述方法包括(a)使溶液中的樣品接觸針對STR基因座的至少6種不同引物對，其中用熒光染料標記各對的至少一種引物，并且其中所得到的STR多重物具有等于或高于3.20的多重密度；(b)通過聚合酶鏈式反應(PCR)，在一個反應室中使用所述至少6種引物對進行同時擴增，，以產(chǎn)生擴增的核酸產(chǎn)物；和(c)通過激光誘導的熒光來檢測所述核酸產(chǎn)物。在相關方面，所述多重STR試驗的多重密度為3.0或更高，3.1或更高，3.2或更高，3.3或更高，3.4或更高，3.5或更高，3.6或更高，3.7或更高，3.8或更高，3.9或更高，4.0或更高，4.2或更高，4.4或更高，
4.6或更高，4.8或更高，5.0或更高，5.5或更高，6.0或更高，6.5或更高，7.0或更高，7.5或更高，8.0或更高，8.5或更高，9.0或更高，9.5或更高，或10.0或更高。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。增加熒光染料的數(shù)量允許較高的多重密度。
[0010]在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于STR基因座的多重擴增的方法，所述方法包括(a)在溶液中使樣品接觸針對STR基因座的至少6種不同的引物對，其中用熒光染料標記各對的至少一種引物，并且其中使用至少6種不同的熒光染料標記物，并且其中所得的STR多重物的STR基因座大小范圍總和大于1044 ； (b)通過聚合酶鏈式反應(PCR)，在一個反應室中使用所述至少6種引物對進行同時擴增，以產(chǎn)生擴增的核酸產(chǎn)物；和(c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。在相關方面中，所述多重STR試驗的STR基因座大小范圍總和是1050個堿基或更大，1075個堿基或更大，1100個堿基或更大，1125個堿基或更大，1150個堿基或更大，1175個堿基或更大，1200個堿基或更大，1225個堿基或更大，1250個堿基或更大，1275個堿基或更大，1300個堿基或更大，1325個堿基或更大，1350個堿基或更大，1375個堿基或更大，1400個堿基或更大，1425個堿基或更大，1450個堿基或更大，1475個堿基或更大，1500個堿基或更大，1600個堿基或更大，1700個堿基或更大，1800個堿基或更大，1900個堿基或更大，2000個堿基或更大，2500個堿基或更大，3000個堿基或更大，4000個堿基或更大，或5000個堿基或更大。在一些實施方案中，總共采用4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40 或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測染料標記的片段。增加熒光染料的數(shù)量允許較大的STR基因座大小范圍總和。
[0011]本文中提供的某些方面涉及多態(tài)性基因座的多重擴增的方法，所述方法包括(a)在一種溶液中使獲自一個或多個來源的一個多個核酸模板的樣品接觸至少6種不同的引物對，各對與所述一個或多個核酸模板中的至少6個STR基因座之一雜交，其中所述引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種(并且在一些方面中，5種，而在其它方面中，多于6種)不同的標記物；(b)通過聚合酶鏈式反應(PCR)，在一個反應室中對一個或多個核酸中的至少6個STR多態(tài)性基因座進行擴增，來產(chǎn)生至少6種核酸產(chǎn)物。在一些實施方式中，擴增6個或更多個基因座。在一些實施方式中，擴增7個或更多個，8個或更多個，9個或更多個，10個或更多個，11個或更多個，12個或更多個，13個或更多個，14個或更多個，15個或更多個，16個或更多個，17個或更多個，18個或更多個，19個或更多個，20個或更多個，21個或更多個，22個或更多個，23個或更多個，24個或更多個，25個或更多個，26個或更多個，27個或更多個，28個或更多個，29個或更多個，30個或更多個，31個或更多個，32個或更多個，34個或更多個，36個或更多個，38個或更多個，或40個或更多個STR基因座。
[0012]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物對，和針對至少一個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21Sll、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179 的引物對，和針對選自下組的STR基因座的至少一種引物對:STR基因座SE33、Penta C、PentaD、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1P0、DYS391 和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包括用于性別鑒定的釉原蛋白(amelogenin)或其它標志物。
[0013]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D16S539、vWA、D21S11、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX,CSF1P0,Penta E、FGA、D8S1179的引物對，和針對至少一個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOUD18S51、D16S539、vWA、D21S11、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX, CSF1P0、PentaE、FGA、D8S1179的引物對，和針對選自下組的STR基因座的至少一種引物對:STR基因座SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391 和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0014]在一些實施方案中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S1656、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1P0、Penta E、FGA、D8S1179、D6S1043 的引物對，和針對至少一個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、DlS1656、D16S539、vWA、D21Sll、D12S391、Penta
D、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX,CSF1P0、Penta E、FGA、D8S1179、D6S1043 的引物對，和針對選自下組的STR基因座的至少一個額外引物對:STR基因座SE33、D10S1248、D2S441、Penta C、D22S1045 和 DYS391。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40 或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0015]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1P0、DYS391、FGA、D8S1179 的引物對，和針對至少一個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1P0、DYS391、FGA、D8S1179 的引物對，和針對選自下組的STR基因座的至少一種額外引物對:STR基因座SE33、Penta C、Penta D、TPOX、Penta
E、D22S1045和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40 或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0016] 在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSF1P0、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179 的引物對，和針對至少兩個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座0351358、0195433、0251338、1'邯1、018551、0151656、01051248、025441、0165539^歡、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSF1P0、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179的引物對，和分別針對選自下組的STR基因座的至少一種額外引物對:STR基因座Penta C、Penta D、Penta E、SE33 和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0017]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、SE33、TH01、D18S51、DlS1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21Sll、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSF1P0、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179 的引物對，和針對至少一個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座 D3S1358、D19S433、D2S1338、SE33、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vffA, D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX、CSF1P0、D22S1045、DYS391、FGA、D8S1179的引物對，和針對選自下組的STR基因座的至少一種額外引物對:STR基因座Penta
C、Penta D、Penta E 和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0018]在一些實施方案中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、THOUD18S51、D16S539、vWA、D21Sll、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSFlP0、FGA、D8S1179 的引物對，和各自分別擴增至少一個額外STR基因座的至少6種額外引物對，各自分別擴增至少一個其它的STR基因座。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、TH01、D18S51、D16S539、vWA、D21Sll、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSFlP0、FGA、D8S1179的引物對，和包含針對選自下組的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個額外STR基因座的至少一種引物對的至少六種額外引物對:STR基因座D19S433、D2S1338、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、Penta D、Penta E、D22S1045 和 DYS391。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0019]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S6156、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物對，和各自分別擴增至少一個額外STR基因座的至少兩種額外引物對。在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433mD2S1338、THOU D18S51、D16S539、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179的引物對，和各自分別擴增選自下組的至少一個額外STR基因座的至少兩種額外引物對:STR 基因座 SE33 、Penta C、Penta D、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSF1P0、Penta E、DYS391 和 D6S1043。在一些實施方案中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40 或更多種熒光染料
來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包括用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0020]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1P0、FGA、D8S1179和D6S1043的引物對，和針對至少一個額外STR基因座的引物對。在一些實施方式中，所述多重 STR 試驗包含針對 STR 基因座 D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1P0、FGA、D8S1179 和 D6S1043 的引物對，和分別針對選自下組的STR基因座的至少一種額外引物對:STR基因座SE33、THO1、DIS1656、D10S1248、D2S441、Penta C、vWA、Penta D、D22S1045、Penta E、SE33 和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。 [0021]在一些實施方式中，所述多重STR試驗包含針對STR基因座D3S1358、D19S433、D2S1338、D18S51、D16S539、D10S1248、D21S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1P0、D22S1045、FGA和D8S1179的引物對，采用或不采用分別針對選自下組的STR基因座的至少一種額外引物對:STR基因座SE33、Penta C、Penta D、ΤΡ0Χ、Penta E、DYS391 和 D6S1043。在一些實施方式中，總共采用 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。在一些實施方式中，在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物。
[0022]在一些實施方式中，所述多重STR試驗的多重密度為3.0或更高，3.1或更高，3.2或更高，3.3或更高，3.4或更高，3.5或更高，3.6或更高，3.7或更高，3.8或更高，3.9或更高，4.0或更高，4.2或更高，4.4或更高，4.6或更高，4.8或更高，5.0或更高，5.5或更高，
6.0或更高，6.5或更高，7.0或更高，7.5或更高，8.0或更高，8.5或更高，9.0或更高，9.5或更高，或10.0或更高。在一些實施方式中，總共采用4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。增加熒光染料的數(shù)量允許更高的多重密度。
[0023]在一些實施方式中，所述多重STR試驗的STR基因座大小范圍總和是1044個堿基或更大，1050堿基或更大，1075個堿基或更大，1100個堿基或更大，1125個堿基或更大，1150個堿基或更大，1175個堿基或更大，1200個堿基或更大，1225個堿基或更大，1250個堿基或更大，1275個堿基或更大，1300個堿基或更大，1325個堿基或更大，1350個堿基或更大，1375個堿基或更大，1400個堿基或更大，1425個堿基或更大，1450個堿基或更大，1475個堿基或更大，1500個堿基或更大，1600個堿基或更大，1700個堿基或更大，1800個堿基或更大，1900個堿基或更大，2000個堿基或更大，2500個堿基或更大，3000個堿基或更大，4000個堿基或更大，或5000個堿基或更大。在一些實施方式中，總共采用4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、35、40 或更多種熒光染料來標記引物(標記各引物對的一員)，并且基于激光激發(fā)和檢測來檢測所述染料標記的片段。增加熒光染料的數(shù)量允許較大的STR基因座大小范圍總和。
[0024]采用6 種或更多種熒光標記物(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20種或更多種標記物)具有許多優(yōu)勢。例如，對于降解的DNA樣品而言，通過所述多重STR評價中的小擴增子的應用，提高了產(chǎn)生所有所需擴增產(chǎn)物的可能性。6種或更多種標記染料的應用通過允許在大于引物和引物二聚體的矯作物(artifact)的最小可能范圍中設計額外的基因座，通過允許減小基因座的平均擴增子大小類增加了對于降解的DNA樣品而言的成功機會。在一些實施方式中，在多重組中擴增6個或更多個基因座，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。在一些實施方式中，在多重組中擴增12個或更多個基因座，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。在一些實施方式中，在多重組中擴增6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、40、45,50個或更多個基因座，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。特意設想了隨著時間發(fā)展，政府將會批準其它的基因座以及在多重組中使用更多種顏色中的6種以允許設想超過27個基因座?？梢蕴娲鄠€基因座中的一個。例如，F(xiàn)BI目前考慮將TPOX基因座從其目前要求的狀態(tài)降至所推薦的狀態(tài)，對于將進入美國CODIS數(shù)據(jù)庫的樣品譜(profile)也是如此。
[0025]這種顏色的增加和可被探查的STR基因座數(shù)量的增加也將減少偶然配對的發(fā)生率(關于DNA數(shù)據(jù)庫管理2010中的ENFSI文獻,可參見http: / / www.enfs1.0rg / )，并且將增加許多其它基于STR的應用執(zhí)行的可信度。例如，DNA序型的作用也已經(jīng)拓展至包括數(shù)據(jù)庫的家族性搜索(Bieber 等，F(xiàn)inding criminals through DNA of theirrelatives (通過親屬的 DNA 來尋找罪犯).Science.2006 ；312 (5778):1315-6 ；Nothnagel等，Potentials and limits of pairwise kinship analysis using autosomal shorttandem repeat loci (使用常染色體的短串聯(lián)重復基因座的成對親屬關系分析的潛力與限制).1nt J Legal Med.2010 ; 124(3):205-15)，并且親屬關系分析正用于難民、避難者(asylee)和移民應用中(Baker 等,Reuniting Families:An Online Database to Aidin the Identification ofUndocumented Immigrant Remains氺(重組家方矣:協(xié)助鑒定未存檔移民的線上數(shù)據(jù)庫 *).J Forensic Sc1.2008 ；53 (I):50-3 ;Preston.US set to begina vast expansion of DNA sampling ；big effect on immigrants ；law to cover mostpeople detained or arrested by federal agents (美國開始擴大 DNA 取樣；對移民的巨大影響；覆蓋被聯(lián)邦探員拘留或逮捕的大多數(shù)人的法律).The New York times.2007:A1,A15)。
[0026]使用6種或更多種標記物的另一個優(yōu)勢基于:數(shù)個國家已經(jīng)確定了用于協(xié)助鑒定各種犯罪行為的罪犯的國家數(shù)據(jù)庫中應用的標準STR基因座的組(Budowel等,PopulationData on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci m African-Americans,US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians (關于非洲裔美國人、美國白種人、西班牙人、巴哈馬人、牙買加人和特立尼達島人的十三個CODIS核心短串聯(lián)重復基因座的人口數(shù)據(jù)庫).J Forensic Sc1.1999 ;44:1277-86 ；Butler, Genetics andgenomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing (人鑒定測試中使用的核心短串聯(lián)重復基因座的遺傳學和基因組學).J Forensic Sc1.2006Mar ；51(2):253-65 ；Gill 等，New multiplexes for Europe—Amendments and clarification
of strategic development (針對歐洲的新型多重物-戰(zhàn)略性發(fā)展的改善與闡明).Forensic Sci Int.2006 ; 163 (1-2):155-7)。這些標準組在國家與國家之間是不同的。隨著時間推移，由于希望跨國界共享STR序型數(shù)據(jù)，區(qū)域、國家和國際數(shù)據(jù)庫的大小有所增加?？梢酝瑫r分析的STR基因座的數(shù)量的增加將有益于數(shù)據(jù)庫搜索兼容性。使用6種或更多種標記物允許形成新的國際STR標準，其基本上納入了個體國家中使用的所有STR基因座。
[0027]存在幾類可以納入多重STR試驗的STR基因座。這些包括常染色體的STR(上文所述那些中的大部分)、X STR、Y STR和微小-STR (常染色體、Y-STR和X-STR的較低分子量形式)。STR試驗可以由給定試驗中的一種類型的STR基因座或STR基因座的組合組成(例如，可以同時探查常染色體、X-STR和Y-STR)。
[0028]在待評價直系男性-男性(male-to-male)遺傳的情況中，親屬關系分析和地理血統(tǒng)的研究明顯得益于Y染色體STR標志物的使用。在一些實施方式中，在多重組中擴增6個或更多個Y染色體STR基因座，(就一些應用而言，優(yōu)選6、8、10、12、14、15、18、21、24、
27、30或更多個Y染色體STR基因座)，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。在一些實施方式中，在多重組中擴增18個或更多個基因座，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。在一些實施方案中，在多重組中擴增18個或更多個基因座，其中至少一個選自DYS19、DYS3781、DYS38911、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a / b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。在一些實施方式中,在多重組中擴增24個或更多個基因座，其中至少一個選自 DYS19、DYS3781、DYS389I1、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a / b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。
[0029]在一些實施方式中，在多重組中擴增30個或更多個基因座，其中至少一個選自DYS19、DYS3781、DYS38911、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a / b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641或DYS643，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。
[0030]在親屬關系、法醫(yī)學和人類學中復雜缺陷情況中，X染色體標志物對于分析特別有用。男性的X-染色體譜作為單元型傳給后代，使其成為用于家族鑒定的高多態(tài)性結合的系統(tǒng)。在一些實施方式中，在多重組中擴增6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30個或更多個X染色體STR基因座，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。在一些實施方式中,在多重組中擴增13個或更多個基因座，其中至少一個選自 DXS6807、DXS9895、DXS10135、DXS8378、DXS9902、DXS10076、DXS10077、DXS10078、DXS7132、DXS10074、DXS981、DXS6800、DXS9898、DXS6801、DXS6809、DXS6789、DXS7424、DXSlOU DXS6797、DXS7133、GATA172D05、HPRTB, DXS10101、DXS9908、DXS8377、DXS10134、DXS7423、DXS10011、DXS10102、DXS10103、DXS10104、DXS10105、DXS10106 或 DXS10107，其中各引物對的至少一種引物是經(jīng)標記的，并且其中使用至少6種不同的標記物。
[0031]在一些實施方案中，將針對13個CODIS基因座(即，CSF1P0、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TP0X、vWA)中至少五個的引物對和至少一種Y-標志物摻入所述多重物。而在另一個實施方式中,將針對所述13個CODIS基因座中至少五種的引物對、至少一種Y-標志物和選自D1S1656、D2S441、D2S1338、D6S1043、D10S1248、D12S391、D19S433、Penta B、Penta C、Penta D、Penta E、D22S1045和SE33的兩種或更多種標志物摻入所述多重物。在這些實施方式中，采用總共5、6、7、8、9、
10、11、12種或更多種熒光染料來標記引物(一種標記物/引物對)，并且在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物(該可任選的標志物不同于上述的至少一種Y-標志物)。
[0032]在一些實施方式中，將針對13個CODIS基因座(即，CSF1P0、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、TP0X、vWA)中至少五種的引物對和至少一種X-標志物摻入所述多重物。而在另一個實施方式中，將針對所述13個CODIS基因座中至少五種的引物對、至少一種X-標志物和選自D1S1656、D2S441、D2S1338、D6S1043、D10S1248、D12S391、D19S433、Penta B、Penta C、Penta D、Penta E、D22S1045 和SE33的兩種或多種標志物摻入所述多重物。在這些實施方式中，采用總共5、6、7、8、9、10、
11、12種或更多種熒光染料來標記引物(一種標記物/引物對)，并且在所述多重物中可任選地包含用于性別鑒定的釉原蛋白或其它標志物(該可任選的標志物不同于上述的至少一種X-標志物)。
[0033]在一些實施方式中，對引物對的正向或反相引物或兩者進行獨特標記(例如，使用熒光染料)。在一些實施方式中，所述標記物是熒光染料。在一些實施方式中，使用激光(例如，藍寶石(Sapphire)488nm激光)檢測所述突光標記的擴增子。使用激光的優(yōu)勢在于，相較于例如酶標儀，試驗的靈敏度和檢測限制有顯著改善。
[0034] 在一些實施方式中，所述核酸產(chǎn)物在以下時間內擴增:短于180分鐘、短于120分鐘、短于90分鐘、短于80分鐘、短于70分鐘、短于60分鐘、短于55分鐘、短于50分鐘、短于45分鐘、短于40分鐘、短于35分鐘、短于30分鐘、短于25分鐘、短于20分鐘、短于18分鐘、短于17分鐘、短于16分鐘、短于15分鐘、短于14分鐘、短于13分鐘、短于12分鐘、短于11分鐘、短于10分鐘、短于9分鐘、短于8分鐘、短于7分鐘、短于5分鐘或短于約4分鐘。
[0035]就本文提供的實施方式中任一項所述的方法而言，所述反應室可以在微流體生物芯片上(參見，例如，Giese 等(2009), “Fast multiplexed polymerase chain reactionfor conventional and microf luidic short tandem repeat analysis (用于常規(guī)和微流體短串聯(lián)重復序列分析的快速多重聚合酶鏈式反應)”，.T Forensic Sci54(6):1287-96))。此外，所述反應室可以在完全整合的(fully-1ntegrated)微流體生物芯片上,所述生物芯片能夠以“樣品入一結果出”(sample-1n to results out)系統(tǒng)設定同時針對一個或多個樣品進行一系列復雜的處理步驟，其中不需要操作員操作。在一些實施方式中，所述方法包括核酸產(chǎn)物的電泳分離和檢測。在一些實施方式中，在微流體生物芯片上進行所述核酸產(chǎn)物的分離和/或檢測。
[0036]在本文中所述的任何實施方案中，所述樣品可包含約Ipg~超過10 μ g的一種或多種核酸(模板)。在一些實施方式中，所述樣品包含少于Ing的一種或多種核酸(模板)。在某些方面中，就0.05ng~4.0ng范圍的核酸模板水平而言，各核酸產(chǎn)物的雜合峰高比(heterozygous peak height ratio) (PHR)對于為 0.6 ~1.0。
[0037]本發(fā)明的其它方面涉及用于快速多重擴增多態(tài)性基因座的試劑盒，所述試劑盒包含:(a)鹽、緩沖劑、dNTP和聚合酶；(b)選自上述那些的STR引物對的組，各引物對具有正向引物和反相引物，并且與一種或多種核酸或核酸混合物中的至少6個基因座之一雜交，其中各引物對的正向或反相引物或兩者用熒光染料標記；(C)用于STR基因座的快速多重擴增的成分(例如，鹽、緩沖劑、鎂、dNTP和聚合酶)，其中成分(a)、(b)和(C)被放在單個反應容器內。
[0038]在本文中所述的任何實施方式中，可以采用任何DNA聚合酶。示例包括水生棲熱菌(Thermus aquaticus) (Taq)、強烈火球菌(Pyrococcus furiosus) (Pfu)、伍斯氏火球菌(Pyrococcus woesei) (Pwo)、黃棲熱菌(Thermas flavus) (Tfl)、嗜熱棲熱菌(Themusthermophilus) (Tth)、里氏棲熱菌(Thermus litoris) (Tli)和海棲熱袍菌(Thermotogamaritime) (Tma)。這些酶、這些酶的修飾形式和酶的組合可從供應商購得，如羅氏公司(Roche)、英杰公司(Invitrogen)、恰根公司(Qiagen)、司查塔基公司(Strategene)和應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)。代表性的酶包括PHUS10N(馬薩諸塞州伊普斯威奇的 NEB 公司)、Hot MasterTaq.TM.(艾本德公司(Eppendorf))、PHUSI ON Mpx (芬酶公司(Finnzymes))、PyroStart (富酶泰斯公司(Fermentas))、KOD (EMD 生物科學公司)、Z-Taq(TAKARA公司)和CS3AC / LA(密蘇里州大學城的克蘭泰克公司(KlenTaq))。
[0039]本發(fā)明的指導可應用于任何核酸擴增方法，包括但不限于，多重終點PCR、實時PCR、逆轉錄PCR、不對稱PCR、巢式PCR、LATE PCR、降落式PCR、數(shù)字PCR、等溫PCR、滾環(huán)式擴增、鏈置換擴增和多重置換擴增。 [0040]本發(fā)明的指導可應用于通過改變給定基因座處的等位基因大小來表征的任何多重基因座的分析。多重STR分析可應用于多種生物體，包括非人類哺乳動物、魚類、鳥類、爬行動物和兩棲動物物種。此外，本發(fā)明可用于通過多個基因座可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA)和擴增的片段長度多態(tài)性(AFLP)分析的細菌(包括病原體)的鑒定和表征。這些方法與STR分析相似，并且也可以廣泛地用于菌株分型以及植物、真菌和動物中的表征。本發(fā)明的指導可用于非多態(tài)性基因座的分析，或多態(tài)性與非多態(tài)性基因座組合的分析。最后，本發(fā)明可直接應用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多重分析。
[0041]附圖簡述
[0042]圖15-色26-基因座，25-STR正式基因座的設計
[0043]圖2A是進行PCR的微流體生物芯片的照片。
[0044]圖2B是接受圖2A的生物芯片的快速熱循環(huán)儀的照片。
[0045]圖3是對于26-基因座，25STR正式基因座多重反應上的各基因座的擴增產(chǎn)物的顏色校正掃描。
[0046]圖4說明25-STR基因座的實質無重疊STR試驗的設計。
[0047]圖5顯示使用8種染料來標記基因座組擴增產(chǎn)物的設計。
[0048]圖6顯示使用8種染料來標記常染色體STR和Y STR基因座組擴增產(chǎn)物的設計。
[0049]圖7說明允許26個STR基因座和釉原蛋白基因座在單個反應中共擴增的設計。
[0050]圖8A說明了本發(fā)明的攝譜儀的圖。
[0051]圖SB描述選擇與所述攝譜儀一起使用的像差校正凹全息光柵。
[0052]圖SC顯示允許將儀器容易地設置成供于采用集成波長模塊或現(xiàn)有濾光器和離散PMT的運行的鏡子。
[0053]圖8D顯示6-色和8-色儀器的射束路徑。
[0054]圖9說明核心5-染料組和DyLight633 (DL633)染料的發(fā)射光譜圖。穿過該圖底部寫有檢測器通道。Y-軸顯示相關信號強度。各框的區(qū)域中的數(shù)字表示各相應染料的最大發(fā)射波長(nm)。
[0055]圖10說明經(jīng)減去基線和顏色校正的擴增產(chǎn)物的8-色分離電泳圖。在實施例6的8-色儀器上分離并檢測擴增產(chǎn)物。所述擴增的片段由各組中對其所用的來指示。圖1lA說明向未標記引物的5’末端添加GTTTCTT尾部以減少iNTA的作用。
[0056]圖1lB說明向未標記引物的5’末端添加G-尾部以減少iNTA的作用。
[0057]圖1lC說明將染料標記從D8S1179引物對的一種引物交換至另一種引物的作用。
[0058]圖12A表示在GeneBench FX儀器上分離之后以5色顯示的6_染料26-基因座多重擴增產(chǎn)物范圍中消除矯作物之前存在兩種矯作物(箭頭下)。
[0059]圖12B表示在GeneBench FX儀器上分離之后以5色顯示的6_染料26-基因座多重擴增產(chǎn)物中消除矯作物之前的存在兩種矯作物(左圖中的箭頭下)，并且它們在消除矯作物之后消失(右圖中的箭頭下)的放大視圖。
[0060]圖12C表示在GeneBench FX儀器上分離之后以5色顯示的6_染料26-基因座多重擴增產(chǎn)物范圍中消除矯作物之后兩個矯作物(箭頭下)消失。
[0061]圖13說明遵循本發(fā)明所述的開發(fā)在6- / 8-色儀器上分離并檢測的男性DNA的6-色27-基因座擴增產(chǎn)物。
[0062]圖14A說明在6- / 8-色儀器上分離并檢測的男性DNA的6_色27-基因座擴增產(chǎn)物。
[0063]圖14B說明了在6-/8-色儀器上分離并檢測的女性DNA的6_色27-基因座擴增產(chǎn)物。[0064]圖15A顯示使用5種染料來評價C0DIS13核心STR基因座的設計。
[0065]圖15B顯示使用6種染料的設計,說明需要較小的多重大小范圍(Multiplex SizeRange)，并且獲得較大的多重密度來評價C0DIS13核心STR基因座。
[0066]圖15C顯示使用8種染料的設計，說明需要較小的多重大小范圍，并且獲得較大的多重密度來評價C0DIS13核心STR基因座。包括的表格說明5-染料、6-染料和8-染料選擇所用的多重大小范圍和多重密度的數(shù)值。
[0067]圖16顯示24個基因座擴增設計。
[0068]圖17顯示23個基因座擴增設計。
[0069]圖18顯示22個基因座擴增設計。
[0070]圖19顯示21個基因座擴增設計。
[0071]發(fā)明詳述
[0072]本文中描述用于遺傳分析的方法。所述方法的一些實施方式被設計成提供一個或多個核酸模板的高特異性遺傳譜，例如，短串聯(lián)重復序列(STR)譜。各個譜提供給定核酸模板內的多個、多態(tài)性基因組基因座的DNA“指紋”，其然后可用于一些實施方式以鑒定所得核酸模板的來源個體(或關于該個體或該個體血親的信息)。
[0073]本發(fā)明的目的是提供多重STR試驗，所述多重STR試驗產(chǎn)生可用于各種應用的人類鑒定信息。例如，法醫(yī)實驗室最近鑒定的家族性搜索的增加值，即，搜索源自犯罪現(xiàn)場樣品的譜與州、國家或國際數(shù)據(jù)庫中存在的譜之間的聯(lián)系，通過將可能的嫌疑犯范圍縮小至在所述數(shù)據(jù)庫中具有譜的個體的家族成員，以幫助調查。本發(fā)明的試驗為家族搜索提供實質上更高的可信度，并且顯著減少搜索規(guī)模增加的數(shù)據(jù)庫獲得的偶然配對的數(shù)量。
[0074] 本發(fā)明的試驗的較高辨別力還增強了在移民和難民應用分析中的DNA序型的使用。在這些情況中，可以更高的正確結果可信度來進行涉及美國公民或特定難民的個體權利相關的美國國務院政策的實施。盡管13個CODIS STR基因座在檢測父母-子女關系和兄弟-姐妹關系中提供了適當?shù)谋ＷC，但更遠的關系(如祖父母-孫子女或阿姨/叔叔-侄子/侄女的)親屬關系分析導致許多可信度水平有限的結果。增加測試用的STR基因座數(shù)量和/或選擇更多測試用的多態(tài)性基因座增加了親屬關系分析中結果可信度提高的可能性比率的強度，并降低了欺詐的潛在風險。本發(fā)明的試驗還提供對有時獲自法醫(yī)樣品的降解DNA樣品的評價的優(yōu)勢。
[0075]盡管STR分析已經(jīng)成為證據(jù)的黃金標準，但國際上并沒有將STR基因座組標準化。在美國，聯(lián)邦調查局選擇了 13個STR基因座和釉原蛋白基因座(用于性別確定)，以供與DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)(CODIS)結合使用。該美國組通常稱為“C0DIS核心基因座”并且由 STR 基因座 CSF1P0、FGA、THOU TPOX, VffA, D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11組成。一般而言，各STR基因座以其被發(fā)現(xiàn)的染色體(例如，D3S1358位于人染色體3上)或以鄰近基因(例如，CSFlPO位于編碼集落刺激因子-1受體基因的人c-fms原癌基因受體的基因的內含子中)來命名。英國核心基因座是FGA、TH01、VWA、D2S1338、D3S1358、D8S1179、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11 和釉原蛋白。歐洲核心基因座是卩6六、11101、￥歡、0151656、025441、0351358、0851179、01051248、0125391、018551、D21S11、D22S1045和釉原蛋白。奧地利政府在歐洲核心基因座的基礎上增加了 D2S1338、D16S539和D19S433，而德國政府增加了基因座SE33。中國常常使用基因座D6S1043，并結合 STR 基因座 CSF1P0、FGA、vWA、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11和釉原蛋白。國際刑警組織標準組基因座是FGA、TH01、VWA、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11,以及可任選的釉原蛋白。
[0076]本發(fā)明提供同時探查所有STR基因座的STR試驗，所述STR基因座是為包括全世界的國家數(shù)據(jù)庫和含有這些基因座的子集而選擇的。這樣的國際STR標準組將顯著提高國家之間的有效合作，以提高社會安全性。本領域技術人員應理解，設計和構建多重STR試驗時，必須平衡多種因素。這些因素變得愈發(fā)難平衡，特別是因為試驗中的STR基因座數(shù)量增加超過18個。必須平衡的因素包括STR矯作物(例如，iNTA，和兩種或多種引物與樣品核酸的非計劃相互作用的產(chǎn)物)的預防或去除、絕對和相對信號強度、反應效率和時間、STR基因座重疊、STR擴增子分解、STR基因座大小范圍和可耐受的重疊程度、STR基因座雜合性、反應中所用的熒光染料標記物的數(shù)量、多重大小范圍，以及進行反應的一個或多個儀器的規(guī)格和性能。這些因素阻礙了 STR試驗在多重密度高于約3.15和STR基因座大小范圍總和為1022的單個、同時的反應中移動超過18個正式基因座。根據(jù)所需的結果，這些工具和指導可被應用于允許數(shù)量多很多的正式基因座摻入STR多重物中，并且獲得高得多的多重密度和STR基因座大小范圍總和。
[0077]如本文中所用的術語“STR基因座”和“多個STR基因座”指由兩個或多個核苷酸在給定的靶核酸的基因座處的重復模式組成的核苷酸序列。所述重復模式的長度可以是約2~約10個堿基對(bp)，并且通常在非編碼內含子區(qū)中。所述重復模式可以含有不對應于所述重復單位的間插序列，或可以含有超過一種的重復模式。
[0078]如本文中所用的術語“STR等位基因”或“等位基因”指的是個體基因組中發(fā)現(xiàn)的STR基因座的形式。給定的STR基因座可以是雜合的，意味著兩個等位基因(各生物學親本固有的一個)的長度不同且堿基對組成不同，或可以是純合的，意味著兩個等位基因長度相同(堿基對組成通常相同但并不總是相同)。罕見地，對于給定的STR基因座，個體可能具有三個或更多個等位基因。偶爾，由于一個或多個突變，給定STR基因座的個體的等位基因可能不同于他或她的父母。
[0079]如本文中所用的術語“等位基因分型標準物(allelic ladder) ”指的是一組長度與各STR基因座都觀察到的共有等位基因相對應的DNA。不同的市售STR試劑盒在表示各基因座的等位基因分型標準物中具有不同的等位基因。
[0080]如本文中所用的術語“STR基因座大小范圍”或“基因座大小范圍”指的是群體中觀察到的共有等位基因的大小范圍。已知在測試的數(shù)千萬中的一個或少數(shù)個體中檢測或觀察到任何特定數(shù)量的DNA樣品，可能還沒有觀察到非共有等位基因。因為市售試劑盒具有不同的大小范圍(公司傾向于隨著時間推移將罕見的等位基因加入它們的等位基因分型標準物中)，因此確定所有感興趣的STR基因座的STR基因座大小范圍是重要的。這樣的確定使不同STR試驗能夠相互比較。非共有等位基因目前可能還未被包括在任何特定的等位基因分型標準物中，或者可能是為方便起見而未被包括。等位基因分型標準物中不必包含全部已知的等位基因，因為其它的等位基因可通過與現(xiàn)有的等位基因分型標準物成分進行大小比較來鑒定。在市售可得的等位基因分型標準物組中，各基因座的最大和最小等位基因之間的大小差異被用于確定標準STR基因座大小范圍，并且示于表1。對于應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的產(chǎn)品AmpFISTR I Identifiler、AmpFlSTR Identifiler Plus、AmpFlSTR Identifiler DirectsAmpFlSTR NGM Select、AmpFlSTR Sinofiler 以及普洛麥格公司(Promega Corporation)的產(chǎn)品 PowerPlexl6HS、ESX 的 PowerPlexl7 和 PowerPlexl8D而言，通過比較線上現(xiàn)有的市售公開技術材料來確定以下比較中包括的STR基因座大小范圍。就各基因座而言，確定了上述技術材料中所述的市售可得的等位基因階梯分型標準物的合并組中的最大和最小等位基因。然后基于重復序列的數(shù)量，以及所述基因座處是否存在四喊基或五喊基重復序列長度來確定最大和最小等位基因之間的大小差異，以喊基計。對于各基因座，分配一個針對該基因座的稱為“基因座標準大小范圍”的值。使用這些單個值來確定“多基因座大小范圍總和”(即，針對各多重物內所含的單個基因座的全部標準大小范圍的總和)。
[0081]表1的STR基因座可以歸為四類:1)由一個或多個國家官方批準的基因座:CSF1P0、FGA、THOU TPOX、VffA, D1S1656、D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D10S1248、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D22S1045、SE33和釉原蛋白；2)在中國廣泛使用的基因座:D6S1043 ；3)在美國提出使用的基因座:DYS391 ;和4)市售STR試劑盒中使用的三個基因座:Penta B、C、D和E。合在一起，這四類中所含的任何STR基因座被稱為“正式STR基因座”。目前這些類別中的基因座通常已經(jīng)接受了嚴格的驗證和測試。隨著時間推移，可以將新的基因座加入以上的類別中:1)由一個或多個國家官方批準的新基因座；2)由一個或多個國家廣泛使用但非官方批準的新基因座；3)在美國提出使用的新基因座；和4)在市售試劑盒中發(fā)現(xiàn)的新基因座。對于之后成為這些類別之一的成員的新基因座，可以使用所述基因座的最大和最小等位基因的公開限制來確定各STR基因座的大小范圍。對于沒有落入這四類之一的“非正式” STR基因座，可以使用所述基因座的最大和最小等位基因的公開限制來確定各STR基因座的大小范圍。
[0082]表1
【權利要求】
1.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少6種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且其中所得的STR多重物的多重密度等于或大于3.20 ； (b)在一個反應室中使用所述至少6種引物對通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增，以產(chǎn)生擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
2.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述方法包括: (a)在一種溶液中使所述樣品與STR基因座的至少6種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且其中使用至少6種不同的熒光染料標記物，并且其中所得的STR多重物的多重密度等于或大于2.0 ； (b)在一個反應室中使用所述至少6種引物對通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增，以產(chǎn)生擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述所得的STR多重物的多重密度等于或大于 3.2。
4.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少6種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且其中使用至少6種不同的熒光染料標記物，并且其中所得的STR多重物的STR基因座大小范圍總和大于1044 ； (b)在一個反應室中使用所述至少6種引物對通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增，以產(chǎn)生擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
5.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少16種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少6種不同的熒光染料標記物；和 (b)在一個反應室中通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增所述至少16個基因座，以產(chǎn)生至少16種擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括用于性別鑒定的標志物。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述STR譜在小于約2小時內產(chǎn)生。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述STR譜在微流體生物芯片中產(chǎn)生。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述STR譜在完全整合的微流體生物芯片中產(chǎn)生。
10.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述檢測方法通過質譜分光光度計實行。
11.一種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少21個STR基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座選自下組:D3S1358、D19S433、D2S1338、D22S1045、PentaB, TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D16S539、vffFA3U D21S11、D12S391、釉原蛋白、PentaD, D5S818、D13S317、D7S820、TPOX,CSF1P0、PentaE、D8S1179、FGA、SE33、DYS391、D6S1043、DYS439、DYS389I1、DYS19、DYS392、DYS393、DYS3891、DYS390、DYS385a、DYS385b、DYS437 和 DYS438，并且其中使用 7 種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
12.—種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少16個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座中的15個來自下組:D3S1358、D19S433、D2S1338、THOU D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179, 并且所述多個中的至少I個STR基因座選自下組:SE33、Penta C、Penta D、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSF1P0、DYS391 和 D6S1043，并且其中使用 6 種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
13.一種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少16個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，并且其中所述STR基因座中的15個來自下組:D3S1358、D19S433、D2S1338、TH01、D18S51、D1S1656、D10S1248、D2S441、D16S539、vWA、D21S11、D12S391、D22S1045、FGA、D8S1179，和至少一個其它STR基因座，其中使用6種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
14.一種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少18個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座中的5個是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多個中的至少13個STR基因座選自下組:D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSFlP0、PentaE、SE33、DlS1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、TH01和 vWA，并且其中使用6種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
15.一種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少15個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座中的5個是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多個中的至少10個STR基因座選自下組:D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSFlP0、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、THOl 和 vffA,并且其中使用6種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
16.一種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少21個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座中的5個是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多個中的至少16個STR基因座選自下組:D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSFlP0、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、THOl 和 vffA,并且其中使用6種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
17.一種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，該方法包括:a)提供至少23個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座中的5個是D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11和FGA，并且所述多個中的至少18個STR基因座選自下組:D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TP0X、CSFlP0、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、PentaC、D12S391、D22S1045、DYS391、D6S1043、THOl和 vffA,并且其中使用6種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
18.—種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少18個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中所述STR基因座中的至少I個來自下組:DYS19、DYS3781、DYS38911、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a / b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS472、DYS476、DYS480、DYS481、DYS485、DYS487、DYS488、DYS490、DYS491、DYS492、DYS494、DYS495、DYS497、DYS505、DYS508、DYS511、DYS522、DYS525、DYS530、DYS531、DYS533、DYS537、DYS540、DYS549、DYS554、DYS556、DYS565、DYS567、DYS568、DYS569、DYS570、DYS572、DYS573、DYS575、DYS576、DYS578、DYS579、DYS580、DYS583、DYS589、DYS590、DYS594、DYS617、DYS618、DYS636、DYS640、DYS641 或 DYS643, 并且其中使用6種或更多種不同的標記物來標記所述擴增的基因座。
19.如權利要求12、14、16、18、24或29所述的方法，其特征在于，所述方法還包括選自下組的至少一個其它STR標志物:常染色體STR、微型-STR、Y-STR和X-STR。
20.一種用于多重擴增STR基因座的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含: (a)生物芯片，所述生物芯片包含在至少一種溶液中的樣品和STR基因座的至少6種不同的引物對，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且其中所得的STR多重物的多重密度等于或大于3.20 ;和 (b)擴增系統(tǒng)，所述擴增系統(tǒng)用于使用所述至少6種引物對通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增；和 (c)檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含能夠檢測所述至少6種不同熒光標記物的激光器。
21.一種用于多重擴增核酸基因座的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含: (a)生物芯片，所述生物芯片包含在至少一種溶液中的樣品和STR基因座的至少6種不同引物對，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且其中使用至少6種不同的熒光染料標記物，并且其中所得的STR多重物的STR基因座大小范圍總和大于1044 ； (b)擴增系統(tǒng)，所述擴增系統(tǒng)用于使用所述至少6種引物對通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增；和 (c)檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含能夠檢測所述至少6種不同熒光標記物的激光器。
22.一種用于多重擴增STR基因座的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含: (a)生物芯片，所述生物芯片包含在至少一種溶液中的樣品和STR基因座的至少16種不同引物對，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少6種不同的熒光染料標記物；和 (b)擴增系統(tǒng)，所述擴增系統(tǒng)用于使用所述至少16種引物對通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增；和 (c)檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含能夠檢測所述至少6種不同熒光標記物的激光器。
23.—種多重擴增包含多個基因座的DNA分子的方法，所述方法包括: a)提供至少35個基因座； b)在單一擴增反應中擴增所述基因座，其中至少一個STR基因座選自下組:D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11、FGA、THOl 和 vWA、D19S433、D2S1338、D16S539、PentaD、D5S818、D13S317、D7S820、TPOX, CSF1P0、PentaE、SE33、D1S1656、D10S1248、D2S441、Penta C、D12S391、D22S1045、DYS391和D6S1043，并且其中使用6種或更多種不同的標記物來標記各所述基因座的各引物對的一員。
24.—種用于檢測包含至少一個核酸的樣品中的至少三種SNP多態(tài)性的存在的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與至少3種不同的寡核苷酸接觸， (b)使用至少6種不同的熒光標記物來產(chǎn)生至少6種不同的熒光信號，和 (c)通過大小、序列或其它特征來分離經(jīng)標記的產(chǎn)物，并且通過激光誘導的熒光檢測包含單個熒光信號的產(chǎn)物。
25.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少18種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少6種不同的熒光染料標記物； (b)在一個反應室中通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增所述至少16個基因座，以產(chǎn)生至少16種擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
26.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少21種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少6種不同的熒光染料標記物；和 (b)在一個反應室中通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增所述至少16個基因座，以產(chǎn)生至少16種擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
27.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少22種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少6種不同的熒光染料標記物；和 (b)在一個反應室中通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增所述至少16個基因座，以產(chǎn)生至少16種擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
28.一種從包含核酸的樣品多重擴增STR基因座的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與STR基因座的至少23種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少6種不同的熒光染料標記物；和 (b)在一個反應室中通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增所述至少16個基因座，以產(chǎn)生至少16種擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
29.一種從包含核酸的樣品多重擴增至少7個基因座的方法，所述方法包括: (a)在溶液中使所述樣品與所述基因座的至少7種不同引物對接觸，其中各引物對的至少一種引物用熒光染料標記，并且使用至少7種不同的熒光染料標記物；和 (b)在一個反應室中通過聚合酶鏈式反應(PCR)同時擴增所述至少7個基因座，以產(chǎn)生至少7種擴增的核酸產(chǎn)物；和 (c)通過激光誘導的熒光檢測所述核酸產(chǎn)物。
【文檔編號】C07H21/04GK103917661SQ201280032757
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年5月11日 優(yōu)先權日:2011年5月12日
【發(fā)明者】J·W·舒姆, R·F·塞爾登, E·坦 申請人:網(wǎng)絡百奧有限公司